Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль точечных мутаций в патогенезе заболеваний человека и современные методы их детекции. (Литературный обзор) 10
1.1. Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека 10
1.1.1. Мутации в генах факторов II, V свертываемости крови, метилентетрагидро-фолатредуктазы человека и их связь с предрасположенностью к тромбозам и гипергомоцистеинемии 10
1.1.2. Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии 13
1.1.3. Мутации в генах рецептора витамина D3, al-коллагена типа 1, эстрогенового рецептора а человека и их связь с предрасположенностью к остеопорозу 17
1.2. Современные методы детекции точечных мутаций 21
1.2.1. Метод детекции точечных мутаций, основанный на удлинении праймера на один нуклеотид 22
1.2.1.1. Анализ точечных мутаций с помощью капиллярного электрофореза 26
1.2.1.2. Анализ точечных мутаций с помощью флуоресцентной поляризации 27
1.2.1.3. Анализ точечных мутаций с помощью масе-спектрометрии 28
1.2.2. Метод детекции точечных мутаций на основе полимеразной цепной реакции
с детекцией в режиме реального времени 29
1.2.3. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования 31
1.2.4. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов 33
1.2.5. Методы детекции точечных мутаций, основанные на анализе конформационного полиморфизма ДНК 36
1.2.5.1. Гетеродуплексный анализ 36
1.2.5.2. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечпых фрагментов
ДНК 37
1.2.6. Методы детекции точечных мутаций, основанные на использовании
эндонуклеаз 38
1.2.6.1. Аллель-специфический анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции. 38
1.2.6.2. Анализ с использованием эндонуклеаз, специфичных к неспаренным
нуклеотидам в ДНК 40
1.2.7. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической поли-
меразноЙ цепной реакции 41
1.3. Практическая реализация технологии детекции точечных мутаций 43
1.3.1. Наборы реагентов, основанные на удлинении праймера на один нуклеотид.... 43
1.3.2. Наборы реагентов, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией
в режиме реального времени 46
1.3.3. Наборы реагентов, основанные на использовании аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов 47
1.3.4. Наборы реагентов, основанные на использовании эндонуклеаз и ферментов репарации 48
1.3.5. Наборы реагентов, основанные на аллель-специфической полимеразной цепной реакции 51
ГЛАВА 2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДИК. (Обсуждение результатов) 55
2.1. Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом 63
2.2. Создание системы детекции мутаций в генах факторов И (G20210A), V
(G1691 А) свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т)
человека методом АС-ПЦР 65
2.2.1. Идентификация генотипов методом секвенирования 67
2.2.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР 69
2.2.3. Клонирование фрагментов геномной ДНК человека, содержащих области с предполагаемыми мутациями в генах факторов II (G20210A), V (G1691 А) свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) 75
2.3. Создание системы детекции полиморфизмов М235Т, Т174М и G(-6)A в гене ангиотензиноген а человека методом АС-ПЦР 77
2.3.1. Идентификация генотипов методом секвенирования 78
2.3.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР 82
2.4. Создание системы детекции нуклеотидных замен в генах аі-коллагена типа I (G2046T), рецептора витамина D3 (G45082A) и эстрогенового рецептора а
человека (Т938С и A984G) методом АС-ПЦР 89
2.4.1. Идентификация генотипов методом секвенирования 91
2.4.2. Идентификация полиморфизма G45082A в гене рецептора витамина D3 с помощью эндонуклеазы рестрикции Bsm I. 96
2.4.3. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР 97
2.5. Анализ продуктов АС-ПЦР с помощью автоматических анализаторов ДНК с флуоресцентной детекцией 101
2.5.1. Флуоресцентные красители, используемые для мечения ДНК 101
2.5.2. Известные системы для автоматического анализа ДНК с использованием
флуоресцентной детекции (приборы и используемые флуорофоры) 103
ф 2,5.3. Анализ мутаций в генах ангиотензиногена, факторов II и V свертываемости крови, метилентетрагидрофолатредуктазы, рецепторов витамина D3 и эстрогенового (а), а также а 1-коллагена типа I человека 106
2.6. Влияние способов выделения геномной ДНК на точность идентификации
мутаций ПО
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 113
3.1. Реактивы и материалы 113
3.2. Приборы и методы 114
3.3. Общие методики 115
3.3.1. Выделение ДНК с использованием протеиназы К и фенольной экстракции.... 115
3.3.2. Выделение ДНК с использованием набора реагентов DIAtom DNA PreplQO фирмы «Биоком» 116
3.3.3. Выделение ДНК с использованием набора реактивов фирмы «Мсдиген» 117
3.3.4. Выделение ДНК с использованием сорбента Chelex 100 118
3.3.5. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция П8
3.3.6. Электрофорез вагарозном геле 119
3.3.7. Электрофорез в поли акрилам идиом геле 119
3.3.8. Капиллярный электрофорез 119
3.3.9. Секвенирование ПЦР-фрагментов с использованием Р-меченых праймеров
поСэнгеру 120
3.3.10. Секвенирование ПЦР-фрагментов с использованием Су5-меченых терминаторов по Сэнгеру 121
3.3.11. Приготовление стандартов длины 122
3.3.12. Проведение ферментативных реакций 123
ф 3.3.13. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 123
3.3.14. Трансформация клеток Е. сої і и анализ клонов 123
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
- Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека
- Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом
- Реактивы и материалы
Введение к работе
Возникновение многих заболеваний человека обусловлено наследственной к ним предрасположенностью, которая в большинстве случаев вызвана точечными нуклеотидными заменами (мутациями) в геномной ДНК. Наличие мутации в гомозиготном состоянии, а также доминантной мутации в гетерозиготном состоянии вызывает образование мутантного фенотипа, что обуславливает возникновение патологии или предрасположенности к ней, как в случае мультифакториальных заболеваний, возникновение которых происходит в результате совокупного влияния мутациий во многих генах и факторов окружающей среды. Поскольку мутации, обуславливающие наследственную предрасположенность, содержатся в геномной ДНК каждой клетки организма на протяжении всей жизни, то посредством их диагностирования можно узнать о предрасположенности к патологии задолго до ее развития. Это может помочь либо совсем избежать ее проявления, либо уменьшить риск возникновения осложнений во время болезни, назначить индивидуальное лечение, Таким образом, детекция мутаций является одной из важных задач современной медицинской диагностики.
Существующие методы детекции известных точечных мутаций можно разделить на две группы. В одной группе методов анализ мутаций проводится после амплификации исследуемого участка ДИК. Точечные мутации обнаруживают по расщеплению анализируемых фрагментов ДНК соответствующими рестриктазами, с помощью аллель-специфической гибридизации или удлинения праймера на один нуклеотид. Ко второй группе методов относятся те, в которых амплификация является частью системы детекции. Эти методы основаны на лигировании специфических олигонуклеотидных зондов в месте потенциальной мутации и аллель-специфической
полимеразной цепной реакции. Тем не менее, при всем существующем многообразий методов не один из них пока не является полностью подходящим для клинического использования. К общим недостаткам методов первой группы, ограничивающим их применение в клинической практике и крупномасштабных исследованиях, можно отнести: трудоемкость, наличие стадии пост-реакционной обработки продуктов амплификации (это способствует контаминации), долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации. Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т.к. они позволяют проводить генотип и рование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ. Эти методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования характеризуется низким выходом продукта реакции.
Таким образом, представляется актуальным разработка новых, удобных в эксплуатации, быстрых, высокопроизводительных и надежных методов детекции известных точечных мутаций в ДНК.
Целью данной работы была разработка метода для клинического использования на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции с применением автоматических анализаторов ДНК.
Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека
Система свертывания крови представляет собой каскад протеолитических реакций, в результате которых целый ряд прокоагулирующих белков переходит в активную форму, и в конечном итоге происходит образование фибринового сгустка (тромба). Сдерживает тромбообразование активированная форма белка С (АРС) - К-зависимой сериновои протеиназои, которая проявляет свою ингибирующую тромбообразование функцию путем протеолитического расщепления прокоагулирующих белков - факторов V и VIII системы свертываемости крови. Устойчивость этих факторов к АРС в результате присутствия мутаций в их генах лежит в основе генетической предрасположенности к тромбозам [1, 2]. Причиной наиболее распространенной устойчивости к АРС является точечная мутация G1691А в факторе V свертываемости крови, которая вызывает замену 506-й аминокислоты аргинина на глутамин [1] (рис. 1).
В норме фактор V инактивируется за счет расщепления пептидной связи, расположенной с СООН-конца от аргинина 506, за которым следует гидролиз пептидной связи, расположенной рядом с аргинином 306. Мутантная форма фактора V устойчива к гидролизу по аргинину 506. Инактивация этого белка происходит только за
Точечная мутация в гене фактора V свертываемости крови, выражающаяся в замещении G на А, приводит к тому, что в участке протеолиза активированной формой белка С происходит замена аминокислоты аргинина на глутамин.
счет гидролиза по аргинину 306, однако, эта реакция происходит на порядок менее эффективно в отсутствие предварительного расщепления по аргинину 506. Таким образом, мутация Leiden фактора V определяет феномен устойчивости к антикоагуляторному действию АРС.
Данная мутация встречается с частотой 5-9 % среди европейского населения [3]. Среди пациентов с венозными тромбозами ее частота увеличивается до 40% [4], в случае венозных тромбозов и тромбоэмболии, имеющих место во время беременности, частота ее варьируется от 43,7 [5] до 60 % [3], Известна также связь данного полиморфизма с предрасположенностью к тяжелому осложнению беременности -преэклампсии [б], а также к инфаркту миокарда [7]. В последнем случае частота встречаемости мутации Leiden возрастает до 23,8 %.
Протромбин является предшественником сериновой протеиназы - тромбина, который является ключевым ферментом процесса гемостаза и тромбообразования. Он обладает прокоагулянтной, антикоагулянтной и антифибринолитической активностями [8]. Мутация G20210A в З -нетранслируемой области гена протромбина встречается у 2-4 % популяции [6, 8] и ассоциирована с увеличением концентрации протромбина в плазме. Механизм такой зависимости пока не ясен, но способствует повышенному образованию тромбина и ухудшает инактивацию фактора V с помощью АРС [9].
Наличие данной мутации является одним из главных факторов риска для предрасположенности к образованию венозных тромбозов [10], венозных тромбоэмболии [11]. Среди пациентов с венозными тромбозами ее частота увеличивается до 18 %, при этом, в 40 % случае венозных тромбозов встречается также и мутация Leiden [8]. В случае тромбозов, имеющих место во время беременности, частота ее варьируется от 9,3 [3] до 16,9% [5]. Одновременно мутации фактора V Leiden и G20210A встречаются у 9,3 % беременных женщин, страдающих тромбозами и такое сочетание мутаций отсутствует в группе женщин с нормальным течением беременности [5].
Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом
Для того чтобы идентифицировать в ДИК человека исследуемые мутации, мы разработали для каждой из них два аллель-специфических праймера: AS-WT, специфичный к нормальной ДНК, и AS-MT, специфичный к ДНК, содержащей мутацию, а также один общий праймер, которые использовали в одной реакционной смеси. Праймеры AS-WT и AS-MT различались З -концевыми нуклеотидами. В этом случае специфичность праймера к аллелю зависит от того, насколько сильно ингибирует его удлинение пара, которую образуют З -концевой нуклеотид праймера и соответствующий нуклеотид ДНК-матрицы. По способности ингибировать удлинение праймера пары, состоящие из З -концевого нуклеотида праймера и соответствующего нуклеотида ДНК-матрицы располагаются в следующий ряд: С-С, A-G, G-A, G-G А-А Т-С, С-Т, Т-Т » А-С, С-А » G, T-G. Таким образом, наиболее неблагоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин [23, 156]. Тем не менее, вероятность удлинения праймера сохраняется даже в случае самой неблагоприятной для удлинения пары нуклеотидов. Поэтому, для того, чтобы увеличить аллельную селективность праймеров, были введены дополнительные некомплементарные матрице нуклеотиды на их З -концах [24, 157]. Они вводились в одно и тоже положение (-1 или -2), что важно для получения сравнимой эффективности амплификации для двух аллель-специфических праймеров [38]. Кроме того, дополнительные неспареные нуклеотиды на 3 -конце, в случае, если они различаются для парных аллель-специфических праймеров, приводят к большему различию образуемых ПЦР-продуктов, что также снижает вероятность неспецифического отжига праймеров на них [157] Методология конструирования аллель-специфических праймеров. Зеленым цветом выделены анализируемые нуклеотиды, голубым - комплементарные им, красным -некомплементарные матрице нуклеотиды.
Чтобы выявить гетерозиготное состояние мутации праймеры AS-MT, определяющие специфичность к мутантному аллелю, были удлинены на 12 нуклеотидов (некомплементарных матрице) с 5 -конца, что приводит к образованию ПЦР-продуктов большей длины. При этом, в структуре праймеров AS-WT два 5 -концевых нуклеотида были заменены на некомплементарные матрице с тем, чтобы в случае образования гетеродуплексов между короткими и длинными ПЦР-продуктами не происходило «ложного» накопления более длинного «мутантного» ПЦР-продукта (рис. 14).
Для того, чтобы иметь возможность разделять продукты разных реакций в одном капилляре, что повышает производительность процесса и сокращает время анализа, праймеры планировались таким образом, чтобы длины продуктов разных реакций лежали в разных диапазонах длин. В рамках данной работы нами были выбраны три диапазона длин предполагаемых амплификатов: 120-140 п.н., 170-190 п.н. и 230-250 п.н. Это позволяет повысить производительность за счет анализа в одном капилляре сразу нескольких мутаций.
Реактивы и материалы
ОлИтонуклеотиды. используемые в работе, были синтезированы ЗАО "Синтол" (г, Москва) на автоматическом ДПК-синтезаторе ASM-102U (г. Новосибирск).
В работе использовали ферменты: Taq ДНК-пол имеразу, Т4-полинуклеотидкиназу, Т4 ДНК-лигазу фирмы Promega (США); AmpliTaqGoId ДНК-полимеразу фирмы Applied BioSystems (США); Taq Platinum ДНК-полимеразу фирмы Invitrogen (США); термосеквеназу фирмы Amersham Bioscicnces (США), эндонуклеазы рестрикции EcoRI, Mspln PctI фирмы Fermentas МВІ (Литва).
Образны крови беременных с гестозом различной степени тяжести, варикозной болезнью и с неосложненным течением беременности были предоставлены Научным центром акушерства, гинекологии и перинатологии РАМП (г. Москва), образцы крови больных с постменопазуальной и сениальной формами остеопороза были предоставлены ОАО «Медицина» (г. Москва) и ГУН ЦИТО им. Н.Н. Приорова (г, Москва).
Реактивы: этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), мочевина фирмы Merck (Германия); К,№-метиленбисакриламид фирмы BDH (Великобритания); красители-маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС), акриламид фирмы Serva (Германия); глицерин, тритон Х-100 фирмы Sigma (США); агароза, персульфат аммония и тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) фирмы Promega (США); набор реактивов для секвенирования ThermoSequenase Cycle Sequencing Kit, набор реактивов для секвенирования Су5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, спин-колонки MicroSpin S-300 Columns фирмы Amersham BioSciences (США); Chelex 100 фирмы Bio-Rad (США); флуоресцентные красители JOE и ROX фирмы Molecular Probes (США); набор реактивов для выделения ДНК «DIAtom DNA Ргер\00», набор реактивов для элюции фрагментов ДНК из агарозного геля «Diatom DNA elution» фирмы Биоком (Россия); набор реактивов для выделения ДНК фирмы Медиген (Россия); аденозин-5 -[у-32Р]-трифосфат триэтиламмонийная соль с удельной активностью 5000 Кюри/ммоль (ВО «Изотоп», Обнинск, Россия); дІІТФ фирмы Медиген (Россия).
Бактериальные штаммы и питательные спелы: в работе был использован лабораторный штамм Е. coli DII5a. Для выращивания бактерий использовали среду LB (Лурия-Бертани). 1 л среды содержал 10 г Бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г хлорида натрия (рН 7,5). Для приготовления агаризованных сред непосредственно перед автоклави рованием добавляли бакто-агар (15 г/л).
Плазмидный вектор: для клонирования продуктов полимеразной цепной реакции использовали pGEM вектор фирмы Promega (США).
Буферные растворы: А) лизирующий буфер: 0,2М Трис-HCl (рН 8.0), 50мМ ЭДТА, 0,5% ДСП. Б) буфер для Taq ДНК-полимеразы:50 мМ Трис-HCl (рН 8.8), 2 мМ MgCl2,100 мМ КС1 Д) ТАЕ-буфер: 50 мМ Трис-ацетат (рН 8.3); 1 мМ ЭДТА. Е) ТВЕ-буфер: 50 мМ Трис-борат (рН 8.3); 1 мМ ЭДТА.
Ж) Буфер для рестриктазы Mspl: 33 мМ Трис-ацетат (рН 7.9); 10 мМ ацетат магния; 66 мМ ацетат калия. 3) ТЕ-буфер: 50 мМТрис-HCl (рН 8.0); 1 мМ ЭДТА
Используемые кислоты, щелочи, соли и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации "хч", дополнительно очищенные по стандартным методикам.
Похожие диссертации на Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК
