Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. БИОЛОГИЯ, КУЛЬТУРА IN VITRO И ВТОРИЧНЫЕ
МЕТАБОЛИТЫ PAEONIA ANOMALA L. (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).... 9
1.1. Биологические особенности P. anomala 10
1.2. Размножение P. anomala 18
1.3. Культура изолированных клеток и тканей in vitro 23
1.3.1. Индукция развития пазушных меристем 26
1.3.2. Эмбриоидогенез (соматический эмбриогенез) 30
1.4. Paeonia anomala L. - продуцент вторичных метаболитов 35
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
2.1. Объект исследования 46
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Метод культуры in vitro 47
2.2.2. Метод анатомо-морфологического исследования растительных тканей 51
2.2.3. Метод иммуноферментного анализа растительных тканей 52
2.2.4. Определение биологически активных веществ в тканях растений .. 54
2.2.5. Статистическая обработка полученных результатов 55
ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ PAEONIA ANOMALA L 56
3.1. Биоморфологические особенности почки возобновления P. anomala как исходного экспланта для культивирования in vitro 56
3.2. Клональное микроразмножение Paeonia anomala L. почками возобновления в культуре in vitro 65
3.3. Каллу сообразование и регенерация растений в культуре зародышей Paeonia anomala L 96
3.4. Каллусообразование и регенерация растений в культуре тканей зачаточного побегай цветка Paeonia anomala L 116
Глава 4. Оценка содержания вторичных метаболитов в дикорастущих и интродуцированных растениях, каллусе и растениях-регенерантах Paeonia anomala L 140
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 147
ВЫВОДЫ 154
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ 155
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 156
- Биологические особенности P. anomala
- Объект исследования
- Биоморфологические особенности почки возобновления P. anomala как исходного экспланта для культивирования in vitro
Введение к работе
Достижения в области культуры in vitro привели к созданию эффективных и экономически выгодных технологий клонального микроразмножения растений. В основе клонального микроразмножения лежит использование уникальной способности растительных клеток реализовать присущую им тотипотентность под влиянием экспериментальных воздействий и дать начало целому растительному организму. Реализация морфогенетического потенциала в культуре in vitro осуществляется путём как активации существующих в растении меристем, так и индукции возникновения почек или эмбриоидов (соматических зародышей) de novo непосредственно из тканей экспланта и из каллуса, образованного клетками экспланта. Используя в качестве объекта боковые почки, зародыши, молодые ткани, можно клонировать растения, т.е. получать растения, генетически идентичные исходному. Культивируемые клетки и ткани растений можно выращивать в виде неорганизованной клеточной массы (каллус), способной к синтезу видоспецифичных биологически активных соединений, и заменять ими традиционное растительное сырьё.
Актуальным направлением клеточных технологий в настоящее время является сохранение и воспроизводство редких и исчезающих видов растений. Пион уклоняющийся, марьин корень (Paeonia anomala L., семейство Раеопіасеае) в Башкортостане чрезвычайно редок (Кучеров с соавт., 1987), включен в «Красную книгу Республики Башкортостан» (2001), отнесен к категории 1 - виду, находящемуся под угрозой исчезновения. Достоверно установлено, что общее число учтенных особей во всех известных популяциях не превышает 500-600 экз. (Мулдашев с соавт., 2004). P. anomala представляет интерес как лекарственное растение, вошедшее в широкую медицинскую практику. Возрастающая потребность в сырье не может быть удовлетворена возобновлением вида в природных условиях.
Методы культуры изолированных органов, тканей и клеток растений in vitro в настоящее время широко используются для решения как теоретических, так и прикладных задач биотехнологии и физиологии растений (Бутенко, 1999; Носов, 1999; Razdan, 2003). Культивируемые клетки представляют собой пластичные системы, обладающие способностью менять процессы дифференциации под воздействием определенных физических и химических факторов. Это свойство дает возможность подобрать условия для максимальной реализации морфогенетического потенциала культивируемого экспланта, заканчивающейся формированием растений-регенерантов при разработке технологий размножения. Кроме того, регенерация растений в строго контролируемых экспериментальных условиях определяет и практическую значимость методов культуры in vitro.
Условия культивирования P. anomala in vitro изучены недостаточно. Сведения об экзогенной гормональной регуляции морфогенеза P. anomala в культуре ткани немногочисленны (Батыгина, Бутенко, 1981; Брюхин, 1993). Разработка технологии ускоренного размножения, основанная на изучении потенциальных возможностей культивируемых in vitro тканей P. anomala, является актуальной для решения проблемы сохранения ценных и редких генотипов и в тоже время - расширения сырьевой базы.
Как модельная система, культура клеток и тканей позволяет изучать такие вопросы, как соотношение между ростом и развитием клетки с одной стороны и образование, накопление в ней метаболитов - с другой. Культуры тканей и клеток являются перспективным источником получения вторичных метаболитов (Запрометов, 1981; Носов, 1999; Бутенко, 1999). В растениях Р. anomala содержатся специфические для этого вида биологически активные вещества: производные пеонифлорина, иридоиды и др. (Suzuki, 1984; Radix Paeoniae, 1998; Grayson, 1998; Koide et al., 2002; Tanaka et al., 2003). Возрастающий интерес к источникам альтернативного сырья для получения лекарственных препаратов обуславливает необходимость изучения вторичных
7 метаболитов в культивируемых in vitro тканях P. anomala (Hattori, Shu, 1985; Ding, 2000; Takechi, Oh et al., 2001; Tanaka, 2003).
Цель исследования состояла в выявлении особенностей морфогенеза Р. anomala в культуре in vitro и разработке технологии клонального микроразмножения вида. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи исследования:
выделить перспективные типы эксплантов для клонального микроразмножения;
определить морфофизиологическую активность эксплантов в культуре in vitro для клонального микроразмножения;
изучить влияние трофических и гормональных факторов питательной среды при культивировании in vitro на процессы микроразмножения;
провести сравнительное изучение содержания вторичных метаболитов в корнях и корневищах дикорастущих, интродуцированных особей, а также в корнях клонированных растений и в каллусах.
Научная новизна. Выявлена высокая морфофизиологическая активность боковых почек P. anomala в культуре in vitro, зависящая от места их расположения на побеге, эндогенного содержания фитогормонов и срока их изоляции. Показано, что оптимальными эксплантами для разработки технологии ускоренного размножения и увеличения выхода количества растений-регенерантов являются боковые почки и зародыши. Определены условия и получены растения-регенеранты путем экспериментального индуцирования эмбриоидов из каллуса зародыша, листовых пластинок и черешков листьев побега в период его внутрипочечного роста. Для эффективного микроразмножения разработаны следующие приёмы: а) активация боковых почек для мультипликации побегов; б) индукция эмбриоидов из тканей зародыша и каллуса; в) индукция морфогенного каллуса из листовых пластинок и черешков листьев побега в период его внутрипочечного роста. Результаты исследования вносят вклад в развитие
8 современных представлений об особенностях морфогенеза и клонального микроразмножения P. anomala. Показано, что экстракты, полученные из корней и корневищ растений-регенерантов и каллуса P. anomala, не уступают по содержанию фенольных соединений экстрактам из дикорастущих и интродуцированных растений.
Практическая значимость работы. Впервые разработана технология клонального микроразмножения редкого вида P. anomala методом культуры in vitro изолированных органов и тканей. Данная технология позволит успешно решить проблему сохранения этого редкого и исчезающего вида растения, сократив сроки получения массового посадочного материала. Биомасса каллуса P. anomala может служить альтернативным источником синтеза фенольных соединений.
Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах ВУЗов.
1. БИОЛОГИЯ, КУЛЬТУРА IN VITRO И ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ
PAEONIA ANOMALA L. (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
Род Paeonia, первоначально включенный в семейство Ranunculaceae, впоследствии был выделен в монотипное семейство Paeoniaceae и порядок Paeoniales (Тахтаджян, 1966). Основанием для этого послужил ряд характерных особенностей рода, выявленных в результате цитологических, эмбриологических, биохимических, микро- и макроскопических исследований. К этим особенностям относятся: уникальный тип эмбриогенеза (образование ценоцита), строение спермодермы, образование ариллуса, подземное прорастание семян, васкуляризация цветка, почти сидячие расширенные рыльца, мясистый нектарный диск (видоизмененная часть андроцея), центрифугальное развитие андроцея, остающиеся при плодах чашелистики, примитивное строение древесины (длинные членики сосудов с лестничной перфорацией; преимущественно диффузная древесинная паренхима), отсутствие алкалоидов, свойственных Ranunculaceae, наличие углевода амилоида, который отсутствует у представителей последнего, и ряд других признаков (Тахтаджян, 1966; Жукова, 1967; Барыкина, 1979; Немирович-Данченко, 1981; Верещагина, 1982; Игнатьева, 1995).
Семейство Paeoniaceae содержит около 40 видов (Тахтаджян, 1966; Немирович-Данченко, 1981; Успенская, 2003). Три наиболее примитивных вида - кустарники и полукустарники (P. arborea, P. lutea, P. delavayi). Остальные виды представлены травянистыми поликарпиками.
В филогенетическом отношении порядок Paeoniales обнаруживает ясно выраженные связи с наиболее примитивным порядком двудольных Magnoliales (Тахтаджян, 1966).
Пионы являются древней, тупиковой ветвью эволюции с крайне несовершенным аппаратом размножения (Немирович-Данченко, 1981). Исходный предок рода Paeonia представлял собой маленькое деревце или
10 кустарник, произраставший в третичных тенистых мезофильных лесах (Кемулария-Натадзе, 1961). Кустарниковые пионы дали начало многолетним пионам. Дальнейшая эволюция пионов шла по линии ксерофилизации, что выразилось в появлении видов с более рассеченными листовыми долями, опушенными плодами, а также с наличием сизого налета на листьях (Барыкина, 1979). Исследованиями М.С. Яковлева с соавторами (1986) показано, что по морфологии и экологии P. anomala занимает промежуточное положение между древнейшими типично мезоморфными видами, такими как пион крупнолистный - P. macrophylla, и более молодыми ксеромезоморфными - P. hybrida, Р. tenuifolia.
В республике Башкортостан P. anomala произрастает в Бурзянском (с. Кутаново и Мурадымово), Зианчуринском (гора Дур-Дур), Татышлинском районах (около сел Арибашево и Ст. Кайпан) (Красная..., 2001; Мулдашев с соавт., 2004), отнесен к 1 категории угрожаемого состояния - вид, находящийся под угрозой исчезновения, численность особей которых уменьшилась до критического уровня или число местонахождений сильно сократилось (Мулдашев и др., 1998). Общее число учтенных особей во всех известных популяциях не превышает 500-600 экземпляров (Мулдашев с соавт., 2004).
В других регионах категория угрожаемого состояния 3 - редкий вид, представленный небольшими популяциями, распространен на ограниченной территории или рассеянно на значительной территории (Редкие ..., 1980; Редкие ..., 1981; Фролов, 1999).
1.1. Биологические особенности P. anomala L.
Морфология. P. anomala - травянистое растение с горизонтально
расположенным корневищем длиной 8 (до 20) см и толщиной 2 (до 8) см с
прикрепленными к нему многочисленными веретеновидными утолщенными
корнями (Немирович-Данченко, 1981; Дудик, Харченко, 1987). На корневище
11 закладываются крупные с пурпурно-розовыми чешуями почки возобновления (Атлас ..., 1976). Мясистые придаточные корни располагаются на более старой части корневища беспорядочно, длина их 27-32 см. Подземные части с сильным запахом метилсалицилата, красновато-буро-коричневыс, на изломе белые, быстро темнеющие до розовато-бурых с лиловым оттенком по краям. Надземная часть представлена обычно 1-2 (до 75) толстыми, ежегодно развивающимися побегами. Побеги прямостоячие, облиственные, с выпукло ребристыми стеблями, в основании розово-пурпурные, с листовыми чешуями. Средняя высота вегетативных побегов 52-64 см, генеративных - 57-68 (до 150) см. Листья дважды тройчато раздельные, с широкими (до 25 мм) ланцетовидными долями, голые; листовая пластинка длиной до 30 см и почти такой же ширины. Цветки с 5 розово-красными лепестками, по одному на верхушке стебля, 8-13 см в поперечнике. Тычинки многочисленные, в 5 пучках. Пестиков 3-5, они с расширенными рыльцами, окружены мясистым нектарным диском. (Тахтаджян, 1966). Плод из 4-5 (2-5) крупных (2,5 см длиной), горизонтально отогнутых листовок, голых или густо опушенных (Шипчинский, 1937). В листовке несколько (обычно 8) семян, они округлые или округло-эллиптические, длиной до 7 мм, блестяще черные. Масса 1000 семян 80-110 г (Яковлев с соавт., 1986).
Е.В. Кучеровым с соавторами (1987) проведен морфологический анализ Р. anomala, растущего на опушке смешанного леса (елово-липово-березового) Татышлинского лесничества Башкирии. Высота растений колебалась от 83 до 100 см, на одном стебле было от 6 до 9 шт. листьев, плоды состояли из 3-6 листовок. В одном плоде находилось от 10 до 32 семян. Потенциальная семенная продуктивность на особь составила 105.5±13.5 семяпочек, а фактическая - только 31.6±4.5 семян (Мулдашев с соавт., 2004).
Жизненная форма. Пион уклоняющийся - многолетнее летнезеленое поликарпическое безрозеточное симподиальное корневищное растение с
12 придаточными долгоживущими корнями клубневидной формы и с монокарпическими побегами.
По системе жизненных форм И.Г. Серебрякова (1964) он относится к корнеклубневым поликарпикам с клубнями, образующимися из стеблеродных (придаточных) корней, возникающих на коротких корневищах. Корневые клубни являются только запасающими органами. Пион уклоняющийся относится к неявнополицентрической биоморфе (Смирнова с соавт., 1976). Взрослые особи представляют собой рыхлый куст с многочисленными полициклическими монокарпическими побегами.
Первые 3-4 года развивается как типичный геофит, далее - как криптофит. Жизненная форма Р. апотаїа в течение жизненного цикла изменяется. В первые годы это корнеплодное, затем - одновременно корнеплодное и корневищное, но после отмирания клубня корнеплода - корневищное (Игнатьева, 1995, 1996).
Экология. Р. апотаїа - преимущественно лесное растение, обитающее на достаточно хорошо обогреваемых осветленных лесных полянах. Мезофит, предпочитает речные долины, по которым заходит в горы. К югу на равнинах исчезает и встречается лишь в горных районах. Пион часто поселяется на богатых гумусом почвах. В горах наиболее обилен в редколесьях у верхнего предела растительности (Атлас ареалов, 1976; Верещагина, 1982; Лекарственные ..., 1991).
Онтогенез. В онтогенезе пиона уклоняющегося Р. М. Малышевой (1976, 1978) выделено шесть возрастных состояний: семена, ювенильные особи, имматурные, взрослые вегетативные, генеративные и сенильные особи. Исследованиями М.С. Яковлева с соавторами (1986) в онтогенезе пиона уклоняющегося выделено четыре периода и семь возрастных состояний. Возрастные состояния приводятся на основании комплекса качественных признаков, предложенных О.В. Смирновой с соавторами (1976) и
13 количественной характеристики некоторых из них. Индексы возрастных состояний приведены по А.А. Уранову (1967).
I. Период первичного покоя (латентный) представлен покоящимися семенами (Se). Для свежесобранных семян характерен глубокий физиологический покой эпикотиля - точки роста побега. В естественных условиях прорастание семян начинается через несколько месяцев, а нередко -через 1-2 года после посева, и появление всходов может растягиваться на несколько лет. Способность находиться в состоянии вынужденного или органического покоя предотвращает преждевременное прорастание семян, способствуя выживанию видов и созданию банка семян в почве.
Причины медленного прорастания семян пионов детально изучены Н.В. Цингер (1951). Семена P. anomala имеют недоразвитый зародыш, который отличается очень низким содержанием физиологически активных веществ и слабой активностью ферментов. Эндосперму семян также свойственна низкая физиологическая активность, но зародыш по этому показателю сильно уступает эндосперму и, следовательно, не может доминировать над последним. В этом, вероятно, и надо искать первопричину недоразвития зародыша в семенах. Семена с недоразвитым зародышем очень отличаются по биологии прорастания. Способность к прорастанию таких семян, как известно, в первую очередь связана с доразвитием зародыша. Поэтому в литературе дискутировался (и обсуждается до настоящего времени) вопрос о связи сроков прорастания семян с величиной их зародыша. Ряд авторов (Цингер, 1951; Поздова, Разумова, 1997) считают, что между этими показателями есть прямая зависимость. Другая более сложная проблема - длительность всего срока предпосевной подготовки (включающего доразвитие зародыша и нарушение покоя), приводящей в конечном счете к прорастанию семян с недоразвитым зародышем. У семян Р. anomala наблюдается морфофизиологический глубокий эпикотильный тип покоя (Николаева, 1982, 1985). Такой покой обусловлен сочетанием
14 пониженной активности (недоразвития) зародыша P. anomala и сильного физиологического механизма торможения (ФМТ) развития эпикотиля. Нарушение морфофизиологического покоя (Сосновец, 1965; Николаева с соавт., 1985), как правило, происходит в ходе двухэтапной стратификации: теплой (для доразвития зародыша) и холодной при 0-10С (для снятия ФМТ). Семена Р. anomala нуждаются в следующей двухэтапной стратификации: в тепле при 18 -30С в течение 1-2,5 месяцев семена прорастают и образуются корни (доразвитие зародыша и прорастание), затем холодная стратификация при 2С в течение 2-3,5 месяцев для появления способности к росту побега (устранение покоя эпикотиля). Семена характеризуются высокой грунтовой всхожестью при посеве осенью несозревшими (Иванова, 1969; Николаева с соавт., 1985). Слабая физиологическая активность приводит к приостановке развития зародыша на той или иной стадии. Низкий физиологический уровень и недоразвитость зародыша являются причиной затрудненного прорастания этого типа семян (Поздова, Разумова, 1997).
II. Прегенеративный (виргинильный) период представлен следующими возрастными состояниями: проростки (/?), ювенильные (/'), прематурные (im\ вегетативные (виргинильные) (v).
Прорастание семян подземное, обычно в мае - июне. Семядоли скрыты под кожурой, они бледные, зеленоватые, мясистые, эллиптические. Первый лист проростка тройчатый, с надрезанными долями, голый, на черешке длиной около 5 см. В июле - августе первого вегетационного периода особи становятся ювенильными. В таком состоянии они могут существовать в течение одного -трех вегетационных периодов. Их отличает один невысокий побег с одним слабо рассеченным небольшим листом. Для их подземной части характерно наличие главного корня и в большинстве случаев небольшого неразветвленного корневища.
В прематурном состоянии особи отмечены с двухлетнего возраста и до 6-7 лет. Они характеризуются одним нерозеточным более высоким побегом с одним - тремя рассеченными листьями на каждом. В подземных частях этих растений обязательно имеется корневище и в некоторых случаях еще сохраняется главный корень. Корневище маловетвистое, некрупное.
Вегетативные особи отмечены в возрасте от 3 до 13 лет. Они характеризуются одним - двумя безрозеточными побегами около 20-25 см высотой с тремя - четырьмя дважды тройчато раздельными листьями. Подземные органы представлены, главным образом, коротким слабоветвистым корневищем и небольшими клубневидными придаточными корнями.
Генеративный период. В генеративном состоянии (g) отмечены растения с 4-5 до 50 лет. Сюда же относятся временно нецветущие взрослые особи, так называемые взрослые вегетативные. Между взрослыми вегетативными и генеративными особями резких различий по морфобиологическим признакам нет. По сравнению с молодыми вегетативными особями, это крупные растения, надземная часть которых представлена в среднем двумя-тремя генеративными и одним - двумя вегетативными побегами в среднем около 60 см высотой с 4-Ю дважды тройчато раздельными листьями. Корневища у них крупные, многократно разветвленные, с большим количеством почек возобновления. У старых генеративных особей корневища в значительной степени разрушенные. Главный корень отсутствует. Хорошо развиты придаточные клубневидно-утолщенные корни.
Постгенеративный (сенильный) период. Сенильные (s) особи отмечены в возрасте старше 25-30 лет. Они не имеют генеративных побегов или имеют один - два недоразвитых генеративных побега. Вегетативных побегов обычно не более одного - двух, показатели развития которых занимают промежуточное положение между молодыми и взрослыми вегетативными особями. Подземная часть значительно уступает по мощности развития генеративным особям.
Преобладают старые разрушенные части корневища, заметно уменьшается количество почек возобновления.
Онтогенетический морфогенез вегетативных органов P. anomala.
Изучение онтогенетического морфогенеза вегетативных органов P. anomala И.П. Игнатьевой (1995, 1996) в течение 12 лет в условиях культуры показало, что для него характерен ряд особенностей, не свойственных морфогенезу представителей более высокоорганизованных семейств двудольных. Ниже приводим данные И.П. Игнатьевой (1995, 1996), касающиеся детального исследования онтогенетического морфогенеза вегетативных органов P. anomala L.
Первые 3 года жизни верхушечная почка P. anomala перезимовывает в почве без защиты в виде почечных чешуи. В последующие годы жизни растений органами возобновления являются только закрытые почки. К концу лета - началу осени в почве полностью сформирован зачаток очередного годичного прироста вегетативной части побега или зачаток его репродуктивной части.
В течение репродуктивного периода развиваются побеги трёх типов -плодоносящие, побеги с зачатком цветка, который не развивается в нормальный цветок, но и не отмирает, оставаясь в жизнедеятельном состоянии вплоть до конца лета, и побеги с неполным циклом развития.
Образование побегов с неполным циклом развития репродуктивной части, на протяжении всего жизненного цикла растений начиная с первых лет жизни, по-видимому, запрограммировано в генотипе растений. Вероятно, это связано с крайне малым числом фотосинтезирующих листьев в прикорневой розетке главного побега и отсутствием их у побегов более высоких порядков. Этот вопрос детально обсуждается И.П. Игнатьевой (1995, 1996).
Для морфогенеза растений P. anomala характерно отсутствие четко выраженного закономерного изменения строения побегов, начиная с главного -
17 это касается как вегетативной, так и репродуктивной их части. Развитие почек в побеги и образование у последних репродуктивной части происходит неупорядоченно по годам жизни и не находится в прямой зависимости от их местоположения на вегетативной части главного побега и боковых побегов.
Очередность вступления побегов в репродуктивное состояние, т.е. образование у них репродуктивной части с неполным циклом развития, не имеет определенной закономерности. У одних растений она образуется в первую очередь у главного побега, но иногда одновременно и у 1-2 побегов 2-го порядка, у других главный побег остается в вегетативном состоянии, в то время как репродуктивная часть развивается у побегов в пазухах семядолей, почечных чешуи или срединных листьев годичных приростов вегетативной части. Объяснить это явление с позиций морфологии (и физиологии) не представляется возможным.
Важную роль в жизни P. anomala играют почки в пазухах семядолей, верхушечная меристема которых функционирует многие годы, гарантируя возобновление растений в конце жизненного цикла, а также в критических ситуациях. Характерной особенностью почек является ветвление, которое начинается на 4-й год жизни растений. Почки 3-го порядка образуются в пазухах отмирающих чешуи в акропетальной последовательности. Впоследствии, когда рубцы от почечных чешуи покрываются пробкой, эти почки приобретают вид возникших вполне самостоятельно и определить их происхождение становится невозможным.
При выращивании P. anomala в культуре в условиях отсутствия конкуренции корневой системе растений свойственны следующие особенности. В течение жизненного цикла растения тип корневой системы изменяется от системы главного корня к смешанной корневой системе и затем к системе придаточных корней. К концу 5-го периода вегетации в результате интенсивного ветвления многочисленных крупных корней 2-го порядка
18 формируется мощно развитая система главного корня с всасывающими корнями 3-го и 4-го порядков. К 10-му году жизни у хорошо развитых растений главный корень достигает 70 см в длину при диаметре 5-8 см. Базальная часть главного корня занимает ортотропное положение, но обычно на относительно небольшой глубине оно изменяется на плагиотропное.
Роль придаточных корней в жизни P. anomala очень велика. Первые из них появляются на 3-й год. Они развиваются вблизи основания почек вегетативной части главного побега в акропетальной последовательности. Число их в течение 3-5-го годов незначительно и размеры невелики. Важную роль придаточные корни начинают играть с 6-го года жизни, когда имеют длину 20-25 см при диаметре до 2,5 см; всасывающие корни представлены 3-5-м порядками и образуют густые мочки на их концах. К 10-му году жизни придаточные корни достигают длины ПО см при диаметре 3-6 см. Поскольку от корневищ они расходятся в радиальном направлении, общий диаметр корневой системы у растения превышает 200 см. Большинство придаточных корней расположено в слое почвы от 5 до 25 см и занимает плагиотропное положение.
1.2. Размножение Paeonia anomala L. Эмбриогенез сем. Paeoniaceae. Большой интерес для размножения Р. anomala представляет изучение эмбриогенеза. Ранее считалось, что первое деление в зиготе и последующие деления в проэмбрио и зародыше у всех цветковых растений сопровождаются образованием клеточных стенок. М.С. Яковлев (1958) впервые отметил, что развитие полового зародыша пиона протекает уникальным образом, не известным для покрытосеменных растений. Это позволило автору предложить новый тип эмбриогенеза - Paeoniaceae (= Paeoniad). Уникальность типа заключается в том, что первое деление в зиготе и последующие деления (более 1000) в «предзародышевом образовании» не сопровождаются заложением перегородок, в результате чего образуется
19 ценоцитная структура (Яковлев, Иоффе, 1957, 1965). Другой особенностью полового зародыша, по представлениям Яковлева и Иоффе (1965), является двухфазность его развития. Первая фаза начинается с деления зиготы и заканчивается заложением в ценоцитной структуре клеточных стенок. Вторая фаза развития полового зародыша характеризуется образованием «меристематических очагов» (до 25) по периферии ценоцитно-клеточного предзародыша. Преимущественное развитие получает лишь один из очагов, который, в конечном счете, и развивается в хорошо дифференцированный половой зародыш (Яковлев, 1983).
Открытие нового типа эмбриогенеза цветковых растений привлекло внимание эмбриологов (Москов, 1964; Батыгина с соавт., 1978; Батыгина, Бутенко, 1981). Большинство исследователей, занимающихся развитием зародыша различных видов пиона (Paeonia albiflora (= lactiflora), P. anomala, P. brownii, P. califomica, P. caucasica, P. delavayi, P. lutea, P. majko, P. officinalis, P. suffruticosa (= moutan), P. tenuifolia, P. veitchii (= beresowski), P. wittmanniana), согласились с точкой зрения Яковлева и Иоффе (1957, 1965) об уникальности первых этапов эмбриогенеза пиона, а также с тем, что у всех изученных видов они сходны. Тем самым они опровергли мнение индийской исследовательницы Murgai (по: Батыгина, 1997) о том, что клеточное деление зиготы пиона сопровождается заложением перегородки.
Однако, несмотря на это, многие исследователи пришли к выводу, что эмбриогенез пиона в связи с его уникальностью требует дальнейших детальных исследований, особенно его ранних этапов.
С позиции новых представлений о системе репродукции цветковых растений (Эмбриология цветковых растений ..., Т. 1-3, 1994, 1997, 2000), а также новых экспериментальных данных, полученных по развитию зародыша разных видов пиона в естественных условиях и в культуре in vitro (Батыгина с соавт., 1978; Васильева с соавт., 1978; Батыгина, Бутенко, 1981), Батыгина с
20 соавтотами внесли определенные коррективы в понимание эмбриогенеза пиона и дали новую интерпретацию природы зародыша, формирующегося в процессе развития семени пиона (Brukhin, Batygina, 1994; Батыгина, 1997).
Т.Б. Батыгина (1997) обосновывает выделение нового Paeoniad-тшіа. эмбриогенеза. Эмбриогенез Paeoniad-тшіг. характеризуется своей незавершенностью: половой зародыш заканчивает свое развитие на стадии ценоцитно-клеточной структуры, в которой формируется эпидермальный слой (единственный признак его гистогенной дифференциации), и не проходит стадии, свойственные большинству половых зародышей цветковых -двуклеточного проэмбрио, тетрады, квадрантов, октантов, формирования семядолей, апексов побега и корня. После обособления эпидермального слоя в ценоцитно-клеточном зародыше начинается дифференциация клеток -инициалей будущих соматических зародышей. Заложение эмбриоидов происходит преимущественно в апикальной части ценоцитно-клеточного полового зародыша, экзогенно за счет периклинальных делений клеток эпидермального слоя. Число эмбриоидов, время их заложения и темп развития у разных видов неодинаковы. Хотя закладывается большое количество эмбриоидов (25-27), обычно лишь один из них дифференцируется на органы, остальные гибнут на ранних стадиях развития (Батыгина, Васильева, 2002).
По концепции Т.Б. Батыгиной (1997), при развитии семени пиона имеет место своеобразная полиэмбриония - монозиготическая кливажная эмбриоидогения. Соматический зародыш, который получил преимущественное развитие среди других зародышей, образующихся на ценоцитно-клеточной структуре, проходит стадии развития, свойственные половому зародышу двудольного растения, т.е. глобулярную, сердечковидную и торпедовидную. С момента заложения и до завершения дифференциации соматический зародыш сохраняет связь с «породившей» его ценоцитно-клеточной структурой полового зародыша. Однако со стадии инициации эмбриоидов происходят постепенная
21 потеря тургора в ценоцитно-клеточной структуре, лизис внутренних клеток и уменьшение ее объема; в зрелом семени она, как правило, полностью дегенерирует.
Т.Б. Батыгина (2000) отмечает еще одну особенность полового зародыша пиона - тенденцию к бесполому (вегетативному) размножению, проявляющуюся в способности к клонированию. На базе ценоцитно-клеточной структуры в развивающемся семени образуется множество соматических зародышей (эмбриоидов), но только один сохраняется в зрелом семени. Автор полагает, что в результате блокировки нормальной клеточной, гистогенной и органогенной дифференциации происходит смена полового пути развития связанного с гетерофазной репродукцией на бесполый связанный с гомофазной репродукцией. Такой «метаморфоз» в системе репродукции привел к тому, что в зрелом семени пиона находится не половой, а соматический зародыш, нормально дифференцированный на органы (семядоли, апекс побега и радикулу) и развивающийся по типу Asterad. У представителей сем. Paeoniaceae переключение программы развития с гетерофазной репродукции на гомофазную произошло на очень раннем этапе эмбриогенеза - на стадии образования ценоцитно-клеточной структуры. Таким образом, в развивающемся семени можно наблюдать два типа последовательно образующихся, различающихся по происхождению зародышей: полового, не дифференцированного на органы зародыша, который прекращает свое развитие и уступает место формированию другого, соматического зародыша, дифференцированного на все основные органы (апексы побега и корня, семядоли). Несмотря на то, что зрелые семена пиона содержат только соматические зародыши, образующиеся из них растения в природных условиях развиваются без отклонений.
Некоторые экспериментальные данные, полученные по воздействию различных факторов (радиация, морфактины и т.д.) на развитие полового зародыша в культуре in vitro Eranthis сходны с явлением, описанным у пиона
22 (по: Батыгина, 1993). Очевидно, стрессовые ситуации в природе индуцируют образование соматических зародышей на базе гибнущего полового зародыша.
У одних таксонов, например Paeonia, этот процесс оказался закрепленным в ходе эволюции. У других (например, Eranthis) реализация эмбриоидогенного пути морфогенеза происходит спорадически, только в стрессовых ситуациях.
Семенное и вегетативное размножение. В природных местообитаниях пион уклоняющийся размножается семенным способом (Малышева, 1978; Мулдашев с соавт., 1998; Фролов, 1999; Боронникова, 2002). Вегетативное размножение в естественных ценозах отсутствует, так как полная дезинтеграция его особей не обнаружена. Частичная неспециализированная дезинтеграция, характерная для этого вида, приводит к образованию клона из стареющих партикул, связанных между собой участками главным образом отмершей ткани (Яковлев с соавт., 1986).
В интродукционной культуре пион уклоняющийся размножают как семенным, так и вегетативным способами.
Одним из способов сохранения вида является интродукция в ботанических садах. Вид интродуцирован во многих ботанических садах страны: в Сибирском (г. Томск, с 1885 г.) (Малышева, 1978), в Полярно-Альпийском (г. Кировск, с 1934 г.), в Главном ботаническом саду РАН (г. Москва, с 1948 г.), в Центральном сибирском (г. Новосибирск, с 1960 г.) (Интродукция ..., 1995; Семенова, 2001), в Уральском (Екатеринбург, с 1948 г.) (Южаков, Соловьева, 2001) и Башкирском (Уфа, с 1940 г.) (Кравченко, 1976) и других ботанических садах и опытных станциях.
Обширная литература о Paeonia посвящена в основном вопросам ускоренного проращивания семян, методам вегетативного размножения и технологии выращивания растений (Сосновец, 1965; Верещагина, 1971; Васильева, 1975; Горобец, 1974; Немирович-Данченко, 1981; Гаммерман с соавт., 1990; Миронова, Тухватуллина, 2002). Регенерационная способность
23 пионов различна, поэтому при их размножении пользуются разными методами: делением куста, отводками, укоренением стеблей зелеными (стеблевыми и листопочковыми) черенками, почками возобновления, корневыми и корневищными черенками. Кусты пиона разрастаются довольно медленно. Частые пересадки отрицательно влияют на их рост и развитие. В первые годы после пересадки растения угнетены. Массовое цветение наступает лишь на 4-5 год, поэтому обычно кусты пересаживают или делят через 8-Ю, а иногда и 15-20 лет (Дубовицкая, Кренке, 1950, 1952; Онищенко, 1964; Иванова, 1969; Кравченко, 1976; Васильева, 1975; Тельпуховская, 1974; Дудик, Харченко, 1987).
Для сохранения природных ресурсов ценных лекарственных растений, к которым относится P. anomala, наряду с применением традиционных методов вегетативного и семенного размножения актуальным является использование метода культуры органов, тканей и клеток.
1.3. Культура изолированных органов, тканей и клеток in vitro.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения - получения в условиях in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру (Бутенко, 1999). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность под влиянием экспериментальных воздействий и дать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ: получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от вирусов за счёт использования меристематической культуры; высокий коэффициент размножения (105 - 107 растений в год); ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
24 возможность проведения работ в течение круглого года; экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала (Атанасов, 1993; Бутенко, 1999; Сельскохозяйственная ..., 2003).
Существует несколько основных моделей клонального микроразмножения растений, характеризующихся различной степенью надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножения форм, универсальности для определенного круга растений, коэффициента размножения, повторяемости результатов.
Помимо ранее предложенных классификаций с выделением 3-6 методов в зависимости от характера морфогенетических процессов (Murashige, 1974, 1977; Vasil I., Vasil V., 1980) существует другой подход к классификации методов микроразмножения.
Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) считают возможным разделить процесс клонального микроразмножения на два принципиально различных типа:
1) активация развития уже существующих в растении меристем (апекс
стебля, пазушные и спящие почки стебля);
2) индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:
а) непосредственно из специализированных тканей экспланта (тканей
репродуктивных органов, эпидермиса, субэпидермальных тканей,
мезофилла чешуи листа и т. д.);
б) из первичного каллуса, образованного клетками экспланта;
в) из пересадочной каллусной ткани или клеток, растущих в
суспензионной культуре.
Основное отличие данной классификации от других в том, что в основу ее положено принципиальное различие между растениями, возникшими из меристемы, обеспечивающей им генетическую идентичность родительским формам, и растениями, образовавшимися из специализированных и каллусных клеток, для которых возникает возможность мутаций генома, которая еще более
25 увеличивается в пересадочной культуре таких тканей. Авторы считают целесообразным разделить каждый из трех методов и представить в виде двух вариантов в зависимости от характера морфогенетических реакций: индукция почек или эмбриоидов. На рис. 1 схематически изображена возможная классификация методов клонального микроразмножения растений, которая является наиболее естественной, и поэтому ценной для практики.
Эксплант
П
Первичный каллус
П
Пересадочный каллус
П
Рис. 1. Классификация методов клонального микроразмножения растений (по Катаевой, Бутенко, 1983).
а — активация существующих меристем; б — образование почек и эмбриоидов de novo; Э — индукция образования эмбриоидов, П — индукция образования почек.
В более поздних работах Р.Г. Бутенко (1999) и Т.А. Егорова с соавторами (2005) выделяют пять, а А. Атанасов (1993) и Л.А. Лутова (2003) - три основных способа клонального микроразмножения. В соответствии с тем, что все классификации, в том числе и предложенная Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко (1983), в той или иной мере основываются на известных морфогенетических процессах в культуре тканей, а в большинстве экспериментальных работ описываются конкретные морфогенетические реакции культивируемых тканей, кажется оправданным рассмотрение основных методов микроразмножения не в
26 рамках какой-либо одной классификации, а учитывая только генетические процессы.
Обязательным условием клонального микроразмножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса - от экспланта до растений. Этому условию удовлетворяют апексы и пазушные почки стеблевого происхождения. Меристемные ткани растений in vivo непрерывно поддерживаются в активно пролиферирующем состоянии. По мнению Р.Г. Бутенко (1999), они устойчивы к генетическим изменениям, возможно вследствие высокой активности систем репарации ДНК, а также негативной селекции изменившихся клеток. Можно предположить, что организация апикальных и пазушных меристем стебля в виде дискретных зон также вносит вклад в их генетическую стабильность. Генетически стабильные апексы и пазушные почки стебля являются в настоящее время наиболее предпочтительными объектами для клонального микроразмножения (Бутенко, 1999).
1.3.1. Индукция развития пазушных меристем
Метод клонального микроразмножения активацией пазушных меристем основан на снятии апикального доминирования или удалением главного побега и микрочеренкованием в пробирке, или введением в питательную среду цитокининов, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов, или, наконец, сочетанием того и другого. При этом во всех случаях развившиеся побеги отделяют друг от друга и повторно культивируют на питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.
Регенерация растений из пазушных почек в настоящее время широко используется при коммерческом размножении ценных генотипов луковичных, плодовых, древесных, овощных и других культур, которые трудно
27 размножаются вегетативно классическими методами. Получаемые при этом растения обычно фенотипически близки к исходным. Среди овощных культур работы в этом направлении ведутся с капустой, томатом, картофелем и другими культурами (Бутенко, 1975, 1978; Бургутин с соавт., 1994; Hayashi, Oka, 1995).
Из плодово-ягодных культур наибольшие успехи достигнуты у земляники, которая в настоящее время размножается в культуре in vitro в промышленном масштабе (Boxus et al, 1977). Стимулируя развитие пазушных почек физиологически активными веществами, успешно разработаны методы клонального микроразмножения земляники, голубики, малины, ежевики, смородины, вишни, сливы, яблони, груши, айвы, винограда и др. (Высоцкий с соавт., 1981; Avitia Gorcia, Castillo Gonzaler, 1992; Singh, Brar, 1993; Бартиш с соавт., 1994; Yepes, Aldwinckie, 1994; Karhu, 1995; Упадышев, Высоцкий, 1995; El-Morsy, Millet, 1995; Peixoto Paulo, Pasqual, 1995; Gribaudo, Restagno, 1995; Попович, Филипена, 1997; Батукаев, Смирнов, 2001; Говорова, 2001).
Наиболее широкое промышленное применение наряду с ягодными культурами методы клонального размножения нашли среди декоративных культур. Работы по клональному микроразмножению декоративных культур широко ведутся во многих лабораториях ряда стран. Достигнуты большие успехи в коммерческом размножении как двудольных, так и однодольных растений, разрабатываются методы размножения в культуре ткани для ириса (Болтенков, 2002); фреезии (Катаева, Бутенко, 1983); гладиолуса (Takayama, Akuma, 1994); лилии (Чурикова с соавт., 1994; Байбурина с соавт., 2004); герберы (Катаева, Бутенко 1983); розы (Marcelis-van Ac, Scholten, 1995; Zhu Hong et al, 1995; Samyn, 1995); орхидеи (Lakshmanan et al., 1995; Куликов, 1995; Черевченко, 2003) и других родов.
По мнению Р.Г. Бутенко (1999), три области применения клонального микроразмножения являются важными и значение их со временем будет возрастать.
Первая - это быстрое клональное микроразмножение in vitro лучших экземпляров взрослых древесных растений, особенно хвойных. В этой области достигнуты определенные успехи (Родина, 1989; Байбурина, 1998; Молканова, Коновалова, 2003).
Вторая область - использование техники in vitro по отношению к гетерозиготным, расщепляющимся при скрещивании растениям.
Третья область - для сохранения редких и исчезающих видов. В лаборатории культуры ткани и морфогенеза Института физиологии растений РАН с 1960 года ведутся работы по культивированию клеток лекарственных растений женьшеня настоящего (Panax ginseng), дихроа противомолярийного (Dichroa febrifugd), барвинка розового (Vinca rosea), раувольфии змеиной (Rauwoljia serpentina) (Саркисова с соавт., 1971; Носов, 1991; Бутенко с соавт., 1992;Бутенко, 1999).
В Главном ботаническом саду РАН им. Н.В. Цицина разработаны и усовершенствованы высокоэффективные технологии клонального микроразмножения редких и ценных видов растений более 700 различных генотипов, 85 видов из 28 семейств. Среди исследованных семейств наиболее устойчивой пролиферацией, независимо от типа экспланта, характеризовались Gesneriaceae, Iridaceae, Liliaceae. Самыми трудно регенерирующими (с низким морфогенетическим потенциалом) оказались Araliaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae (Молканова с соавт., 2003). В Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева разработано клональное микроразмножение редких и исчезающих видов луковичных растений (Миронова, Калашникова, 2001; Кириченко с соавт., 2001).
Проблема сохранения генофонда лекарственных растений, в том числе редких и исчезающих, в настоящее время становится актуальной в результате нерационального использования природных ресурсов, интенсивных заготовок без учета рекомендуемых объемов, ухудшения экологической обстановки. В
29 результате всего этого естественные фонды растительного сырья истощаются, в ряде случаев популяции некоторых видов исчезают, что, например, случилось в Башкортостане с родиолой иремельской.
В лаборатории морфогенеза и биотехнологии растений Ботанического сада-института УНЦ РАН разработаны способы и технологии микроразмножения родиолы розовой и иремельской (Ишмуратова, 1998), синюхи голубой (Ишмуратова, Зарипова, 2000), а также интродуцированных в условия Башкортостана леспедецы двуцветной (Ахметова, Байбурина, 2003), левзей сафлоровидной (Репях с соавт., 1996; Ахметова, Байбурина, 2002) - видов, находящих широкое применение в медицинской практике.
Ограниченное использование пазушных почек для гемикриптофитов и геофитов может быть связано как с их дефицитом, так и с трудностью осуществления успешной поверхностной стерилизации при введении в культуру in vitro. Это относится к таким видам, как синюха голубая, пион уклоняющийся, родиола розовая.
Таким образом, анализ литературных данных показывает, что к настоящему времени накоплен большой объем знаний по изучению морфогенеза в культивируемых in vitro пазушных почек растений, принадлежащих к различным семействам. Однако, сведения о размножении растений, относящихся к семейству Раеопіасеае, в культуре in vitro немногочисленны.
Особенностям развития изолированных почек девяти сортов пиона травянистого в условиях in vitro посвящена работа Г.А. Талалаевой (1983, 1984) Целью работы автора являлось определение способности к клональному микроразмножению сортов пиона разных сроков цветения, принадлежащих к видам пиона молочноцветкового, пиона лекарственного и гибридов, полученных с участием этих видов. Автором выявлены перспективные типы эксплантов, разработаны приемы получения стерильной культуры первичных эксплантов. Изучена реакция эксплантов на экзогенные регуляторы роста, а
также на трофические и физические факторы культивирования. Г.А. Талалаевой получены микрорастения сортовых пионов, однако отмечены трудности в укоренении микропобегов.
Французскими учеными изучено размножение in vitro Paeonia suffruticosa Andr. сорта Mme de Vatry почками (Bouza et al., 1994). Авторы изучали действие гормонов на размножение на МС-среде пиона из почек. Эффективными оказались только бензиламинопурин и гибберелловая кислота.
В опытах японских исследователей (Takashi et al., 1989) с травянистым пионом {Paeonia lactiflora Pall.) за 1 месяц культивирования удалось получить 2-3 дополнительных побега. Следовательно, за год из одного экспланта можно вырастить от 300 до 700 растений.
1.3.2. Эмбриоидогенез (соматический эмбриогенез)
Этот тип клонального микроразмножения характеризуется тем, что зародышеподобные структуры (соматические зародыши-эмбриоиды) развиваются асексуально вне зародышевого мешка из соматических клеток культивируемых тканей путем, напоминающим нормальный зиготический эмбриогенез. Соматический зародыш, в отличие от почки, как убедительно показано Т.Б. Батыгиной (1997), представляет собой биполярную структуру, у которой одновременно развиваются апексы стебля и корня. Соматические клетки культивируемых тканей экспланта и каллуса при определенных условиях стимуляции дают начало зародышеобразным структурам. Первое описание соматического эмбриогенеза принадлежит Стюарду (по: Бутенко, 1964), который наблюдал глобулярные, сердцевидные, торпедовидные стадии развития соматического зародыша в культуре каллусных клеток моркови. Несколько позднее, независимо от него, Рейнерт описал соматический эмбриогенез в суспензионной культуре клеток моркови. В настоящее время
31 соматический эмбриогенез используется как один из типов метода клонального микроразмножения растений (Лутова, 2004).
По мнению Т.Б. Батыгиной (1993, 1997) и Р.Г. Бутенко (1999), соматический эмбриогенез - это образование в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов, т.е. зачатков растения, способных развиваться во взрослое растение.
Эмбриоидогенез лежит в основе микроразмножения большинства растений из семейств Orchidaceae и Rutaceae. Для них характерны все типы соматического эмбриогенеза: образование соматических зародышей в тканях экспланта, в каллусе, а также «деление» возникших в культуре тканей эмбриоидов (возникновение адвентивных эмбриоидов в тканях первичных соматических зародышей) (Катаева, Бутенко, 1983). Эмбриоидогенез in vitro изучен у многих видов растений из различных семейств (обзоры: Круглова с соавт., 1995; Ferrie et al., 1995; Palmer, Keller, 1997; Raghavan, 1997; Reynolds, 1997; Datta, 2001; Pechan, Smykal, 2001; Круглова с соавт., 2005). Показано, что эмбриоиды могут возникать и в естественных условиях in vivo экзогенно или эндогенно на разных органах растений, произрастающих в разных экологических зонах, на разных стадиях онтогенеза начиная с зиготы (Батыгина, 2000). Эмбриогенез и органогенез в культуре зародышей P. anomala L. описаны В.Б. Брюхиным и Т.Б. Батыгиной (1993). Соматический эмбриогенез и регенерация растений получены в культуре семядолей P. albiflora Pall. (Kim, Lee, 1995, 1996). Изучена регенерационная способность P. mlokosewitschii Lorn, и P. tenuifolia L. на различных типах эксплантов (Orlikowska et al., 1998).
Для эмбриоида характерно образование собственной новой оси (по отношению к материнскому организму), соединяющей полярно формирующиеся побеги апекса и корня. Как правило, эмбриоид не имеет общей сосудистой системы с материнским организмом (закрытый
32 радикулярный полюс). Генезис эмбриоида, также как и его форма и размеры, таксоноспецифичны (Батыгина, 1997, 2000).
В течение ряда лет Т.Б. Батыгиной разрабатывается концепция об эмбриоидогении как новой категории вегетативного размножения; рассматривается роль этого явления в системе репродукции цветковых растений (Батыгина с соавт., 1978; Батыгина, 1997). Согласно этой концепции, эмбриоидогения - один из типов гомофазной репродукции Цветковых растений in situ, in vivo и in vitro, элементарной структурной единицей которой является эмбриоид. Основным тезисом концепции эмбриоидогении является универсальность морфогенеза эмбриоидов и зиготических (половых) зародышей, образующихся в естественных условиях и в экспериментальных - в культуре in vitro.
При прорастании эмбриоида сразу же «рождается» новая особь, причем у некоторых видов отмечена кратковременная связь с материнским организмом. Продолжительность контакта и стадия развития эмбриоида, на которой этот контакт осуществляется, различны у разных видов растений.
В основе эмбриоидогении лежит исключительное свойство растительной клетки - ее тотипотентность. Тотипотентность - свойство клетки, имеющей все морфогенетические возможности (т.е. весь потенциал), присущие данной особи и реализующиеся различными путями морфогенеза (Бутенко, 1991, 1999).
Конечный результат этого свойства, его способы и формы реализации могут быть различными, они обусловлены степенью тотипотентности клетки. Степень тотипотентности (Батыгина, 1987) клеток видоспецифична и определяется совокупностью факторов и в первую очередь системой (ткань, орган, организм), из которой была взята клетка. Успех реализации тотипотентности культивируемых клеток в процессах морфогенеза от клетки до растения определяют генотипические характеристики исходного растения,
33 особенности дифференцировки инициальной ткани и условия воздействия in vitro; последние в большинстве случаев являются решающими.
В зависимости от происхождения и положения эмбриоидов на материнском растении Т.Б. Батыгиной (1993, 1997, 2000) выделяются две основные формы эмбриоидогении. Репродуктивная (флоральная) эмбриоидогения включает эмбриональную (монозиготическую кливажную) - на базе зиготы или зародыша и овулярную (интегументальную и нуцеллярную) - из клеток интегумента и нуцеллуса семязачатка. Вегетативная эмбриоидогения -образование эмбриоидов на вегетативных органах - включает фолиарную (на листе), каулигенную (на стебле) и ризогенную (на корне).
Таким образом, эмбриоидогения - высокоспециализированная форма вегетативного размножения, при которой размножение осуществляется либо самими эмбриоидами, либо миниатюрными проростками, развивающимися на растении из эмбриоидов, либо семенами, в которых формируются эмбриоиды.
Т.Б. Батыгиной и Р.Г. Бутенко (1981) изучены морфогенетические потенции зародыша покрытосеменных растений на примере представителей рода Paeonia сем. Paeoniaceae, пути морфогенеза in vivo и in vitro, стадии автономности у зародышей различных видов пиона. Авторами было выявлено, что зародыши разных видов пиона, извлеченные на сердечковидной и более поздних стадиях развития на безгормональной питательной среде Мурасиге-Скуга и Хеллера, давали нормальные проростки обычно через 45-50 дней, на среде, индуцирующей каллусообразование, начинают образовывать каллус через 10-14 дней. Каллусы, полученные из зародышей различных видов пиона, могут быть использованы для микроразмножения (Васильева с соавт., 1978).
Данные по культивированию зародышей разных видов растений (Батыгина, Бутенко, 1981; Батыгина, 1997; Батыгина, Васильева, 2002) показали, что в ходе эмбриогенеза имеются переломные моменты - критические фазы. Они характеризуются специфическими для каждого вида морфологическими
34 изменениями зародыша: определенным размером, формой и строением (дифференциация эмбриодермы, точки роста, семядолей и т. д.); определенными соотношениями и взаимосвязями между зародышем и окружающими его структурами семяпочки (исчезновение крахмала из тканей интегументов, нуцеллуса и появление его в зародыше и т. д.). Одной из наиболее важных критических фаз онтогенеза, по мнению авторов, является та фаза, с которой зародыш становится относительно автономным, т. е. способным пройти дальнейший эмбриогенез и развиваться без материнского организма в нормальное растение (Батыгина, Васильева, 2002). Можно полагать, что именно к этому моменту полностью сформировалась сложная система нового организма, способного на простой безгормональной среде вступить на самостоятельный путь развития. У зародышей пиона такой критической фазой оказалась ранняя сердечковидная, т. е. фаза начала дифференциации семядолей, при этом точка роста морфологически еще не выражена, но уже началась ее гистологическая дифференциация. С этой стадии зародыш пиона при определенном режиме обычно развивается нормально и образует нормальный проросток.
Таким образом, сравнительное изучение зародыша различных видов пиона в естественных условиях и в условиях культуры in vitro позволило впервые выявить важный этап в онтогенезе растения - автономность развития зародыша.
Показано, что зародыши видов рода Раеопіа на разных стадиях развития, а также все органы проростка (на среде, индуцирующей каллусообразование) способны образовывать каллус, в котором при определенных условиях начинается морфогенез (Васильева с соавт., 1978; Батыгина, Бутенко, 1981; Брюхин, 1993).
Относительно путей морфогенеза в культуре in vitro существуют различные, противоречивые точки зрения (Батыгина, Васильева, 2002). На основании литературных и цитоэмбриологических данных авторы полагают, что
35 независимо от типа культивируемых клеток (зигота, клетки зародыша, нуцеллуса, микроспоры и т. д.) морфогенез как in vivo, так и in vitro может осуществляться четырьмя самостоятельными путями: эмбриогенез, эмбриоидогенез, органогенез (геммогенез, ризогенез, гемморизогенез) и гистогенез, не считая аномалий (Батыгина с соавт., 1978; Батыгина, 1997; Батыгина, Васильева, 2002). По мнению Т.Б. Батыгиной (1997), необходимо разграничивать процессы эмбриогенеза и эмбриоидогенеза как in vivo, так и in vitro, в силу таких отличительных особенностей последнего, как отсутствие закономерностей в направлении первых делений, замедленная дифференциация и т. п.
Идентичность развития соматического зародыша in situ (в семени) и соматических зародышей пиона в культуре in vitro подтверждена экспериментальными данными (Брюхин, 1993; Батыгина, 1997).
1.4. Paeonia anomala L. - продуцент вторичных метаболитов
Вторичные метаболиты растений часто являются носителями высокой биологической активности и имеют высокую практическую значимость. Они успешно применяются в медицине, парфюмерии, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве. Полной ясности нет по поводу физиологических функций вторичных метаболитов и их жизненной необходимости для растений. Для изучения этой проблемы может применяться метод изолированных клеток и тканей, который позволяет исследовать обмен веществ высших растений на клеточном уровне. Как модельная система, культура клеток и тканей позволяет изучать такие вопросы, как соотношение между ростом и развитием клетки с одной стороны и образование, накопление в ней метаболитов - с другой. Облегчается также изучение влияния различных факторов на синтез вторичных метаболитов (Носов, 1999; Мальцева, 2003).
История изучения вторичного метаболизма в культуре клеток растений начинается с 1940 г., когда Дж. Боннер сообщил о синтезе каучука клетками гваюлы (по: Носов, 1994). Начало 70-х годов стало поворотной точкой в технологии культивирования клеток. В это время возросло число сообщений о синтезе значительного количества вторичных метаболитов в культуре клеток. Резко расширился круг веществ, получаемых в культуре in vitro. Становилось очевидным, что практически все классы соединений вторичного обмена могут быть синтезированы культивируемыми клетками растений (Фаулер, 1987; Носов, 1991).
Основанием для использования культуры клеток высших растений в качестве альтернативного пути синтеза вторичных соединений являются следующие специфические особенности клеток в условиях in vitro (Бутенко, 1986; Фаулер, 1987):
-возможность возникновения новых путей синтеза уже известных
соединений;
-способность к синтезу совершенно новых веществ, которые не
образуются в интактном растении;
-биотрансформация дешевых предшественников синтеза в ценные
конечные продукты. Однако, в культивируемых клетках растений, как правило, происходит снижение содержания вторичных соединений, что, вероятно, связано с частичной потерей или ослаблением генетической информации о вторичном обмене (Запрометов, 1981). Для увеличения биосинтеза вторичных метаболитов в культивируемых клетках применяются так называемые факторы "запускания" (Лукнер, 1979; Запрометов, 1981; Носов, 1991). С одной сороны, это факторы физиологической регуляции вторичного синтеза: условия культивирования, применение предшественников, использование элиситоров, воздействие стрессов и др. (Бутенко, 1999). С другой стороны - факторы генетической
37 регуляции: использование трансформированных клеток, мутагенов, селекция на клеточном уровне и др. (Widholm, 1977; Каранова с соавт., 1986; Булгаков, Журавлев, 1992).
Фармацевтические продукты, ароматические вещества, пряности, красители, биостимуляторы, полученные из высших растений, играют важную роль в жизни человека. Примерно из тысяч используемых природных веществ -около 80 % составляют продукты растительного происхождения. Четвертая часть всех фармацевтических препаратов изготовлена на базе растительных веществ (Атанасов, 1993). Сотрудники ВИЛАР рекомендуют углублённые исследования пиона уклоняющегося, ставя его на первое место среди видов растений, применяемых в медицине России как гепатопротекторное и противоопухолевое средство при раке печени и желудка (Рабинович, 2001).
Подземные органы P. anomala содержат иридоиды, производные пеонифлорина, эфирное масло, гликозиды салициловой и бензойной кислот, сесквитерпеновые лактоны, кумарины, сапонины, моно- и тритерпеноиды, тритерпеновые гликозиды, витамин С, дубильные вещества (до 10 %), стерины, крахмал (до 78 %), углевод амилоид, сахара (до 10 %), большое количество различных микроэлементов (хром, стронций, висмут и др.). Найдены флавоноиды (апигенин-глюкозид, рейфолин, кемпферол-2-глюкозид, пионозид и др.) (Тахтаджян, 1966; Алпысбаева, Никонов, 1982; Растительные..., 1986; Гаммерман с соавт., 1990; Минаева, 1991; Ronn et al., 1998; Turner, 1999).
Лечебные эффекты корня пиона уклоняющегося связаны с наличием в нем 1,10-1,59 % эфирного масла, содержащего более чем 30 компонентов (Kumar, Motto, 1986), в частности пеонола. По антиоксидантной активности пеонол превосходит рутин и феруловую кислоту (Zhang et al., 1999). Считают, что ведущую роль в фармакологической активности экстрактов Paeonia играет монотерпеновый' (пинановый) гликозид - пеонифлорин, содержание которого
38 колеблется от 0,05 до 6,01 % (Harada et al., 1984; Suzuki, 1984; Radix Paeoniae, 1998; Grayson, 1998; Papandreou, 2002).
Монотерпеновые гликозиды (рис. 2) представляют собой пролонгированные, полифункциональные антибиотики, при расщеплении которых высвобождаются как соединения бензойной и галловой кислот, подавляющие патогенную кишечную микрофлору, так и монотерпеноиды, оказывающие антиспастическое и противовоспалительное действие (Hattori, Shu, 1985; Kang et al., 1991; Ding, 2000). Производные пеонифлорина как в свободном виде, так и в форме соединений с галлотанинами ингибируют агрегацию тромбоцитов вызванную тромбином, арахидоновой кислотой и коллагеном. Пентагаллоилглюкозид из корней пиона обладает антивирусной и противоопухолевой активностью (Takechi, Tanaka, 1985; Oh et al., 2001).
В Японии подлинность сырья оценивается по наличию пеонифлорина и его бензоил- и оксипроизводных (Koide et al., 2002), рассматриваемых как перспективное средство профилактики старческого слабоумия (Hayashi et al., 1985; Ohtaetal., 1994).
Фенольные соединения пионов представлены различными производными эллаговой кислоты (Myoung Gun Choung et al., 2000). Высокой физиологической активностью обладают димерные и мономерные комплексы эллаговой кислоты - пеонианины А- Е (Wu, 1990; Tanaka et al., 2003).
В цветках пионов обнаружены антоцианы - пеларгонидин 3-О-глюкозид, пеларгонидин 3,5-ди-О-глюкозид, цианидин-3-О-глюкозид, цианидин 3-О-глюкозид, цианидин-3,5-ди-0-глюкозид, пеонидин -3-О-глюкозид, пеонидинЗ,5-ди-О-глюкозид (Wang et al., 2001).
он он
R;
Me—О—Р у С
О Me—О—<' \
Н
Me-
о-/ \\
Н
Рис. 2. Монотерпеновые гликозиды Раеопш suffruticosa Anhr. муданпионозид-А (1), -В (2), -С (3), -D (4), -Е (5), -F (6), пеонифлорин (7), оксипеонифлорин (8), бензоилпеонифлорин (9), бензоилоксипеонифлорин
(10) (по: Lin Hang-Ching et al., 1996).
40 Противоречивы данные о содержании в пионах циклических монотерпеноидов с так называемым иридановым скелетом (1-изопропил-2,3-диметилциклопентаном) (рис. 3).
Рис. 3. Иридановый скелет (1-изопропил-2,3-диметилциклопентан) (по: IUPAC Compendium of Chemical Terminology,
1997)
Иридоиды (рис. 4) обычно встречаются в растениях в виде гликозидов. Это бесцветные кристаллические или аморфные вещества, легко растворимые в воде и низших спиртах и плохо растворимые в органических растворителях.
По данным Н.А. Некратовой с соавторами (1988) содержание их в пионе уклоняющемся во время плодоношения достигает 2,0 %. Содержание иридоидов в зависимости от возраста пиона колеблется в подземных органах от 1,6 до 2,64 %, в надземных - от 1,66 до 2,31 %. М.В. Колпаковой и Д.М. Поповым (1994) подобраны условия выделения иридоидов из корневищ с корнями и надземной массы пиона уклоняющегося и разработаны методы определения их в экстракте пиона, рассчитываемые по раствору пеонифлорина стандартного образца и по удельному показателю поглощения. Содержание иридоидов, определенное авторами в корнях и корневищах, колеблется в пределах 0,9-1,3 %, в листьях - 0,5-0,8 %, в настойке - 0,04-0,06 %.
В то же время убедительных доказательств наличия иридановых гликозидов в пионе нет. Н.А. Некратова с соавторами (1988) оперирует
РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ КИБЛИОТЕКА |
О'
Комплекс цианогенного гликозида
С02Ме
H-y-V
но2с J
O-b-D-GIc
10-карбоксилоганин
Дигидрооксиминтлактон
=\
Моноенол ацетат иридоида
С02Ме
hVhT
Ме O-b-D-GIc
Непетанудозид
Рис. 4. Структура растительных иридоидов (по: Grayson David
Н., 1998)
42 данными, полученными в 1988 году колориметрическим методом после обработки экстрактов гидроксиламином и хлоридом железа. Эта же методика используется в ВФС 42-58-98. Очевидно, что реакция неспецифическая. Как указывает Н.А. Тюкавкина с соавторами (2001), подобный способ количественного анализа вряд ли имеет какие-либо теоретические обоснования и его появление de facto обусловлено исключительно потребностями аналитической практики.
Большинство исследователей рассматривают пеонифлорин как пинановый гликозид, что подтверждается методами высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектроскопией (Ivanova et al., 2002; Wu et al., 2002; Zhao, Sun, 2003).
Применение. P. anomala - лекарственное растение, рекомендованное фармакологическим Комитетом Министерства здравоохранения РФ к применению в медицинской практике. В государственный реестр лекарственных средств в качестве сырья включены корневища с корнями и надземные органы P. anomala. (Государственный..., 2000). В научной медицине используется 10 %-ная настойка из равных по массе (1:1) сухих надземных и подземных частей как седативное средство при неврастении с повышенной возбудимостью, бессоннице, ипохондрии (Турова, Сапожникова, 1982). Лечебный эффект обусловлен суммой иридоидов (Алпысбаева, Никонов, 1982). Фармакологическими исследованиями установлено, что препараты из подземных органов улучшают пищеварение, незначительно повышают кислотность желудочного сока, действуют как обезболивающее средство (Гаммерман и др., 1990; Лекарственные ..., 1991). Испытания, проведенные в ряде неврологических и психиатрических клиник г. Москвы, установили, что препараты пиона оказывают положительный эффект при различных поражениях ЦНС: улучшается сон, у больных шизофренией снижается депрессия (Верещагина, 1982; Рабинович, 2001).
В традиционной медицине растение применяется под названием «Марьин корень» в качестве противовоспалительного, протистоцидного, бактерицидного средства при желудочно-кишечных заболеваниях (Гаммерман с соавт., 1990; Минаева, 1991), для лечения злокачественных заболеваний (Рабинович, 2001; Oh et al., 2001), в гинекологии (Wu, 1990). P. anomala, входящий в состав биологически активной добавки «Нейростабил», рекомендован при нарушениях функциональной активности желудка и печени, нервных и простудных заболеваниях (Пилат, Иванов, 2002).
Виды рода Paeonia издавна используются в китайской, монгольской и тибетской медицине. Пионы официнальны в Японии и Китае (Pharmacopoeia..., 1992; The pharmacopoeja..., 1996), где наиболее популярны P. suffruticosa, Р. lactiflora, P. veitchii, P. obovata (Paeony, 2001). Наряду с корнями используют и другие органы растения, в частности семена и цветки. Так, цветки P. officinalis и P. mascula, известные под названием «цветки бенедектинской розы» входят в состав отхаркивающих и противоэпилептических чаев (Teedrogen, 1997). Пионы широко применяются в составе гепатопротекторных и противоопухолевых сборов (Oh et al., 2001; Мс Collouch et al., 2002). Экстракты корня пиона снижают токсические эффекты от воздействия четыреххлористого углерода (Radix Paeonia, 1998).
* * *
Анализ литературных источников свидетельствует о том, что к настоящему времени накоплен достаточно большой объем знаний, касающийся вопросов изучения биологических особенностей и морфогенеза травянистых пионов. Обширная литература о пионах относится, главным образом, к двум видам -Paeonia lactiflora и P. officinalis, а также к многочисленным сортам декоративных пионов, родоначальниками которых они являются. Значительно меньше работ, содержащих сведения о дикорастущих пионах, в том числе и Р.
44 anomala. Исследования в основном посвящены вопросам ускоренного прорастания семян и методам вегетативного размножения растений, относящихся к роду Paeonia.
Известны работы, касающиеся изучения биологических особенностей и морфогенеза в условиях in vivo травянистых пионов (Горобец, 1974; Васильева, 1975; Назарова, 1983; Игнатьева, 1995, 1996). Биоморфологические особенности пионов описаны по строению почек возобновления и корневой системы, годичного цикла морфогенеза (Дударь, 1966), морфологии подземных частей растения (Верещагина, 1971), экологической морфологии (Нухимовский, Нухимовская, 1978), онтогенетическому морфогенезу вегетативных органов (Игнатьева, 1995, 1996). Возрастные этапы в онтогенезе пиона уклоняющегося описаны P.M. Малышевой (1976). В области изучения эмбриогенеза P. anomala детально выяснены пути становления и дифференцировки клетки, ставшей на путь эмбрионального развития (Яковлев, Иоффе, 1957, 1965; Brukhin, Batygina, 1994; Батыгина, 1997; Батыгина, Васильева, 2002).
В литературе имеются сведения о возможности размножения in vitro сортов видов P. suffruticosa Andr. (Bouza et al., 1994), P. lactiflora Pall. (Талалаева, 1984; Takashi et al., 1989), P. officinalis L. (Талалаева, 1983) почками. В доступной литературе не удалось встретить сведений о размножении P. anomala с использованием в качестве эксплантов боковых почек. Описаны эмбриогенез и органогенез в культуре зародышей P. anomala (Брюхин, 1993). Технология клонального микроразмножения вида не разработана.
По последним литературным данным ведущую роль в фармакологической активности экстрактов Paeonia играет монотерпеновый (пинановый) гликозид -пеонифлорин, содержание которого колеблется от 0,05 до 6,01 % (Suzuki, 1984; Hattori, Shu, 1985; Takechi, Tanaka, 1985; Ohta et al., 1994; Radix Paeoniae, 1998; Grayson, 1998; Ding et al., 1999; Oh et al., 2001; Papandreou, 2002; Koide et al., 2002; Sang et al., 2004). Обширна литература, касающаяся исследований по
45 содержанию пеонифлорина у интактных растений различных видов рода Paeonia. Исследований монотерпеновых гликозидов в каллусных тканях Р. апотаїа не обнаружено.
Из-за непрерывного уменьшения природных запасов Р. апотаїа возникает необходимость сохранения и разработки эффективных технологий размножения редкого вида. Несомненный интерес представляет использование метода культивирования органов, тканей и клеток растений для расширения сырьевой базы и разработки технологий ускоренного размножения растений. Возрастающий интерес к источникам альтернативного сырья для получения лекарственных препаратов обуславливает актуальность изучения вторичных метаболитов в культивируемых in vitro тканях Р. апотаїа.
class1 БИОЛОГИЯ, КУЛЬТУРА IN VITRO И ВТОРИЧНЫЕ
МЕТАБОЛИТЫ PAEONIA ANOMALA L. (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).. class1
Биологические особенности P. anomala
Род Paeonia, первоначально включенный в семейство Ranunculaceae, впоследствии был выделен в монотипное семейство Paeoniaceae и порядок Paeoniales (Тахтаджян, 1966). Основанием для этого послужил ряд характерных особенностей рода, выявленных в результате цитологических, эмбриологических, биохимических, микро- и макроскопических исследований. К этим особенностям относятся: уникальный тип эмбриогенеза (образование ценоцита), строение спермодермы, образование ариллуса, подземное прорастание семян, васкуляризация цветка, почти сидячие расширенные рыльца, мясистый нектарный диск (видоизмененная часть андроцея), центрифугальное развитие андроцея, остающиеся при плодах чашелистики, примитивное строение древесины (длинные членики сосудов с лестничной перфорацией; преимущественно диффузная древесинная паренхима), отсутствие алкалоидов, свойственных Ranunculaceae, наличие углевода амилоида, который отсутствует у представителей последнего, и ряд других признаков (Тахтаджян, 1966; Жукова, 1967; Барыкина, 1979; Немирович-Данченко, 1981; Верещагина, 1982; Игнатьева, 1995).
Семейство Paeoniaceae содержит около 40 видов (Тахтаджян, 1966; Немирович-Данченко, 1981; Успенская, 2003). Три наиболее примитивных вида - кустарники и полукустарники (P. arborea, P. lutea, P. delavayi). Остальные виды представлены травянистыми поликарпиками.
В филогенетическом отношении порядок Paeoniales обнаруживает ясно выраженные связи с наиболее примитивным порядком двудольных Magnoliales (Тахтаджян, 1966).
Пионы являются древней, тупиковой ветвью эволюции с крайне несовершенным аппаратом размножения (Немирович-Данченко, 1981). Исходный предок рода Paeonia представлял собой маленькое деревце или кустарник, произраставший в третичных тенистых мезофильных лесах (Кемулария-Натадзе, 1961). Кустарниковые пионы дали начало многолетним пионам. Дальнейшая эволюция пионов шла по линии ксерофилизации, что выразилось в появлении видов с более рассеченными листовыми долями, опушенными плодами, а также с наличием сизого налета на листьях (Барыкина, 1979). Исследованиями М.С. Яковлева с соавторами (1986) показано, что по морфологии и экологии P. anomala занимает промежуточное положение между древнейшими типично мезоморфными видами, такими как пион крупнолистный - P. macrophylla, и более молодыми ксеромезоморфными - P. hybrida, Р. tenuifolia.
В республике Башкортостан P. anomala произрастает в Бурзянском (с. Кутаново и Мурадымово), Зианчуринском (гора Дур-Дур), Татышлинском районах (около сел Арибашево и Ст. Кайпан) (Красная..., 2001; Мулдашев с соавт., 2004), отнесен к 1 категории угрожаемого состояния - вид, находящийся под угрозой исчезновения, численность особей которых уменьшилась до критического уровня или число местонахождений сильно сократилось (Мулдашев и др., 1998). Общее число учтенных особей во всех известных популяциях не превышает 500-600 экземпляров (Мулдашев с соавт., 2004).
В других регионах категория угрожаемого состояния 3 - редкий вид, представленный небольшими популяциями, распространен на ограниченной территории или рассеянно на значительной территории (Редкие ..., 1980; Редкие ..., 1981; Фролов, 1999).
Объект исследования
Материалом для работы служили растения P. anomala генеративного возрастного состояния, произрастающие в природных условиях и пересаженные из Татышлинского района республики Башкортостан на участок редких и исчезающих растений лаборатории морфогенеза и биотехнологии Ботанического сада-института Уфимского научного центра РАН. В качестве эксплантов использовали боковые почки, листовые пластинки, их черешки и стебли зачаточного побега, лепестки, тычинки, цветоложе, изолированные с цветка в фазу бутонизации средневозрастного генеративного растения, а также зародыши P. anomala, изолированные из семян на разных стадиях развития (26-50 сут после опыления). Для изучения содержания вторичных метаболитов в качестве объекта исследования, кроме интактных дикорастущих и интродуцированных растений, использовались культивируемые in vitro каллусные ткани и полученные из нее растения-регенеранты.
Выбор P. anomala в качестве объекта для изучения основывался на том, что вид является редким и исчезающим в Республике Башкортостан, отнесен к I категории угрожаемого состояния (Красная книга , 2001). P. anomala на территории Башкортостана обнаружен в трех районах (Бурзянском, Зианчуринском, Татышлинском), находится под угрозой исчезновения, численность особей которого уменьшилась до критического уровня (Мулдашев с соавт., 1998, 2004).
Кроме того, P. anomala - ценное лекарственное растение, рекомендованное к применению в медицинской практике. Лекарственным сырьем служат все части растения, как надземные, так и подземные, в которых содержатся углеводы (крахмал - до 78.5 %, сахар - до 10 %, амилоид), органические кислоты, эфирное масло, моно- и тритерпеноиды, стероиды, витамин С, дубильные вещества, флаваноиды, салицин, микроэлементы (хром, стронций, висмут и др.) (Растительные..., 1986;
Гаммерман с соавт., 1990; Минаева, 1991). Растение издавна используется в китайской, монгольской и тибетской медицине. Спектр применения широк. Препараты известны как успокаивающие, противосудорожные, обезболивающие, противовоспалительные, бактерицидные и тонизирующие. В китайской медицине растение входит в состав противоопухолевых сборов. В России официальное медицинское признание получила настойка из корневищ, корней и травы P. anomala, применяемая при неврастенических состояниях, бессоннице, вегетативно-сосудистых нарушениях различной этиологии (Верещагина, 1982; Гаммерман с соавт., 1990; Рабинович, 2001).
class3 ТЕХНОЛОГИЯ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ
PAEONIA ANOMALA L class3
Биоморфологические особенности почки возобновления P. anomala как исходного экспланта для культивирования in vitro
В связи с зависимостью культивирования in vitro эксплантов от морфофизиологического состояния исходного растения возникла необходимость изучения биоморфологических особенностей органов возобновления исследуемого объекта.
Известно, что морфогенез эксплантов в культуре in vitro зависит от типа экспланта, времени изолирования первичного экспланта и от его биоморфологических особенностей (Митрофанова с соавт., 1994; Чуб с соавт., 1994). Необходимость изучения особенностей формирования и развития почек возобновления возникла в связи с выбором их в качестве исходного экспланта для культивирования in vitro.
У многих растений морфогенетическая способность изолированных тканей, и в частности почек, зависит от расположения их на побегах (Сельскохозяйственная ..., 2003). Для того чтобы объяснить, почему так происходит, необходимо изучение особенностей морфогенеза in vivo эксплантов. Замечено, что виды растений, хорошо размножающихся вегетативно, обычно проявляют высокую регенерационную способность в культуре in vitro. Физиологический возраст исходного экспланта имеет несомненное значение в проявлении способности к морфогенезу. К физиологическим факторам также относится и время (сезонность) изоляции экспланта. Ткани и органы, изолированные в момент вегетации растений, обладают более высокой чувствительностью к составу питательной среды и способны с высокой частотой образовывать адвентивные почки, формировать побеги и укореняться, чем ткани, изолированные в период глубокого и вынужденного покоя (Сельскохозяйственная ..., 2003).
Для P. anomala характерно наличие вегетативных и генеративно-вегетативных (смешанных) почек возобновления закрытого типа. Почки расположены на корневище на уровне почвы или слегка погружены в неё, т.е. изучаемый вид относится к группе гемикриптофитов. Взрослые генеративные растения P. anomala, как и многие другие травянистые многолетники, представляют собой симподиальную систему побегов последовательных порядков, сменяющих друг друга. Надземная часть этих побегов ежегодно отмирает, а базальные участки с почками возобновления остаются в почве, образуя многолетнее корневище. На корневище закладывается множество почек возобновления, часть из них превращается в спящие и пробуждается в случае повреждения растущих почек. Новые почки возобновления образуются в пазухах покровных чешуи крупных материнских почек {рис. 5, 6).
Вначале появляются замкнутые покровные чешуи, число которых по мере роста почки достигает пяти - шести. На следующий год после цветения Р. anomala почки значительно увеличиваются в размерах, приобретают заостренную форму и к концу вегетации в них формируются зачатки стеблевых листьев и цветка. Эти почки прорастают весной третьего года. У некоторых же продолжается формирование зачатков округлых мелких чешуи, и они остаются спящими (рис. 7).
В конце вегетации в значительно увеличивающейся (до 3 см длины и 1 см толщины) почке возобновления пиона уклоняющегося (рис. 8) полностью сформирован генеративный побег будущего года с бутоном, прикрытый зачатками листьев. Снаружи зачаточный побег защищен покровными чешуями. Они имеют хрящеватую консистенцию, широкое основание. В пазухе каждой покровной чешуи к осени формируется боковая (пазушная) почка, то есть образуются «почки в почке». Образование боковых почек происходит не под каждой чешуей материнской почки возобновления, однако в пазухах чешуи всегда имеются участки меристематической ткани, сохраняющие в течение длительного времени способность формировать боковые почки. Таким образом, почке возобновления P. anomala характерно внутрипочечное ветвление - формирование боковых почек на побеге в период его внутрипочечного роста.
Нами выявлено, что пазушные почки пиона уклоняющегося, располагаясь от основания до верхушки по оси почки возобновления, не остаются равнозначными. Они различаются размером, числом покровных чешуи, временем закладки и обладают различной способностью к пробуждению. В связи с этим мы выделяем три группы боковых почек:
I группа - спящие почки. Располагаются в пазухах мелких нижних покровных чешуи (рис. 8). Нижние почки закладываются в конце июня, образуют 2-3 покровные чешуи и к октябрю при длине 0.5 мм остаются спящими.
II группа - дочерние или собственно почки возобновления. Развиваются в пазухах срединных покровных чешуи (5-8-я снизу). Закладываются в начале июля, к октябрю имеют длину 1-2 мм и шесть покровных чешуи (5-я и 6-я) или четыре покровные чешуи и два листовых примордия (7-я и 8-я).
III группа - резервные почки. Формируются в пазухах верхних чешуи (9 - 12-я). Почки закладываются в середине июля как резервные, к октябрю имеют длину 2.0-3.5 мм, состоят из одной чешуи и трех листовых примордиев (9-я и 10-я) или имеют только два примордия листа (11-12-я). Пазушные почки особенно хорошо различимы весной, когда почка возобновления развивается в побег (рис. 9). Весной при отрастании побега из почки возобновления нижние покровные чешуи (с 1-й по 4-ю от основания стебля к вершине) остаются сильно сближенными. Пазушные почки под ними остаются в таком же состоянии (спящими), что и перед уходом в зиму. В течение вегетации спящие почки почти не увеличиваются в размерах, к осени у них формируются две - три зачаточные чешуи. В последующие годы эти почки незначительно увеличиваются в размерах и могут пробуждаться и обеспечивать восстановление куста через 3-5 и более лет.
