Введение к работе
Актуальность темы.
Одним из наиболее ярких и убедительных достижений современной биотехнологии стало создание и бурное развитие новой области мировой экономики — биофармацевтической промышленности и промышленности биоматериалов, направленной на производство принципиально нового класса лекарств — рекомбинантных белков медицинского назначения и уникальных материалов
Различные интерфероны, эритпропоэтины, факторы роста, антитела, вакцинные белки, промышленные ферменты, доступные ранее лишь в аналитических количествах, входят теперь в перечень жизненно-важных медицинских препаратов, производятся в объемах до нескольких тонн в год, и прочно вошли в повседневную практику современной медицины, пищевой и фармацевтической промышленности (Higo К. et al., 1993; ZhuZ. et al., 1994; Matsumoto S. et al, 1995).
Одним из перспективных направлений биотехнологии в настоящее время является создание растений - биореакторов, способных продуцировать рекомбинантные белки. Системы, производящие подобные белки, на основе растений могут быть безопасной и экономически конкурентоспособной альтернативой традиционным системам экспрессии, - культурам клеток микроорганизмов и животных. Так в отличие от бактериальных систем, в растениях возможно осуществление посттрансляционных модификаций, которые в ряде случаев являются необходимым этапом получения функционального белка (Terashima М. et al., 1999). Кроме того, получение рекомбинантных белков в системах на основе растительных клеток являются более безопасными в виду отсутствия рисков переноса инфекционных заболеваний, поскольку растения и человек не имеют общих патогенов (Scheller J. et al., 2004). Это является значительным преимуществом перед системами экспрессии на основе культур клеток млекопитающих.
Lemna minor (ряска малая) - однодольное покрытосеменное растение семейства Рясковые. Благодаря своей способности к быстрому, причем вегетативному размножению, позволяющему увеличивать биомассу вдвое за 36 часов и высокой доли белка в биомассе, ряска представляет интерес как потенциальная биофабрика для производства рекомбинантных белков, таких как вакцинные белки, сывороточный альбумин, гемоглобин и коллаген и др (Stomp A.M., 2005).
Растения Lemna можно выращивать в асептически закрытых емкостях с контролируемыми условиями культивирования. Для роста растениям
необходимы лишь вода, неорганические питательные вещества и СОг. (EdelmanM. etal., 1998).
Таким образом, искусственная и полностью закрытая среда культивирования в сочетании с быстрым ростом, высоким содержанием белка в биомассе и преимущественно вегетативным способом размножением делают такую систему уникальной и легко контролируемой. Следовательно, система экспрессии, созданная на основе Lemna, обладает огромным потенциалом и преимуществами перед существующими системами экспрессии в связи с тем, что представляет собой новый тип эукариотической растительной высокопродуктивной системы для получения рекомбинантных белков.
Создание такой системы экспрессии возможно только с использованием методов генетической инженерии, которые для Lemna minor до сих пор остаются малоэффективными и трудоёмкими.
Все сказанное выше показывает актуальность разработки системы генетической трансформации растений ряски малой с целью создания растений-продуцентов рекомбинантных белков.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось изучение регенерационной и трансформационной способности растений ряски малой {Lemna minor) и разработка эффективной системы генетической трансформации. Применение данной системы позволит создать трансгенные растения ряски, экспрессирующие рекомбинантные белки медицинского назначения.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Определить оптимальную комбинацию регуляторов роста растений и тип экспланта с целью получения регенерации с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.
Подобрать условия эффективного селективного отбора трансформированной ткани.
Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации растений ряски малой.
Получить трансгенные растения ряски малой, несущие ген bar.
Провести молекулярный анализ полученных растений.
Научная новизна. Подобраны условия для культивирования, индукции каллусообразования и регенерации растений из каллуса для популяции Lemna minor, распространенной в водоемах Московской области. Показано, что наиболее эффективный эксплант для каллусообразования — целый интактный л истец.
На основе подобранных условий была разработана система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens.
Получены трансгенные растения ряски со стабильной экспрессией гетерологичного гена bar.
Практическая значимость полученных результатов. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений Lemna minor с генами, кодирующими терапевтически ценные белки.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 10-ой и 11-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2006, Пущино, 2007); на Российско-польском симпозиуме (Москва, 2008); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008); на молодежном симпозиуме V-го Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано одиннадцать печатных работ, в том числе одна статья в ведущем рецензируемом научном журнале.
Структура и объем работы. Диссертация включает: введение; обзор литературы; описание материалов и методов исследования; результаты и их обсуждение; выводы; список литературы.
