Введение к работе
Актуальность проблемы.
Получение дешевых, высокоочищенных и стабильных препаратов биологически активных белков, важных для медицинской и сельскохозяйственной практики, является одной из основных задач биотехнологии. Для эффективного решения этой задачи в качестве продуцентов целевых белков чаще всего используют лабораторные штаммы Escherichia coli. Применение генно-инженерных методов в сочетании с микробиологическим синтезом позволило получить целый ряд биологически активных препаратов: гормоны, интерфероны, цитокины, ферменты и т.д. Однако для многих белков-антигенов, вакцинно-ценных белков, белков различной природы, имеющих большую молекулярную массу, используемые на ранних этапах подходы генной инженерии оказались неэффективны. С их помощью не удавалось освободиться от примесей токсичных липополисахаридов, хозяйской ДНК и решить проблему рефолдинга или восстановления нативной структуры синтезируемого бактериями белка. Эти проблемы были частично решены путем использования эукариотических систем наработки рекомбинантных белков. Однако в реальной практике белковые продукты, получаемые в культурах эукариотических клеток, обладали высокой стоимостью за счет дороговизны питательных сред, сложности оборудования для культивирования клеток эукариот, высоких требований к стерильности, медленного роста культур и т.д. Таким образом, разработка новых технологических решений и подходов, позволяющих получать различные рекомбинантные белки, является актуальной задачей современной биотехнологии.
Целью данной работы являлась разработка системы новых технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, с помощью методов генной инженерии и микробиологического синтеза. Использование данных разработок должно приводить к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов. Целью работы было также получение на основе разработанных решений новых биотехнологических продуктов, обладающих уникальными свойствами: стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, систем доставки лекарственных препаратов, антигенов, кандидатных вакцин.
Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
-
Разработка системы технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных биологически активных белков, приводящей к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.
-
На основе разработанной системы технологических решений создание препаратов рекомбинантных двух- и мультидоменных биологически активных белков, антигенов, ферментов, в том числе, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью разработки проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и других биотехнологических продуктов для применения в сельскохозяйственной и медицинской практике.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Научно-обоснованная система технологических решений, направленная на создание универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, приводящая к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.
-
Разработка мультидоменных белковых нанотранспортеров, обеспечивающих специфичную доставку лекарственных средств в клетки-мишени, интернализацию в них, выход из внутриклеточных везикул и доставку в ядро.
-
Разработка препарата-стимулятора роста с/х животных IV поколения «САТ-Сом», основанного на использовании двухдоменного гибридного белка, включающего соматостатин и белок-носитель для иммунокоррекции.
-
Нанобиотехнологический подход, основанный на получении гибридных белков, состоящих из домена целевого белка и аффинного домена, позволяющий повысить устойчивость целевого продукта к протеазам, существенно увеличить выход целевого белка, осуществлять самопроизвольное специфическое связывание с матрицей, высокоэффективную очистку, концентрирование, иммобилизацию и рефолдинг целевого белка на поверхности сорбента.
5. Разработка препаратов рекомбинантных двух- и мультидоменных антигенов, биологически активных белков и ферментов, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью создания проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, и других систем для использования в сельскохозяйственной и медицинской практике.
Научная новизна работы:
В настоящем исследовании разработана система научно-обоснованных технологических решений, использование которых позволяет в минимальные сроки получать эффективные биологически активные препараты на основе рекомбинантных белков, а именно: разработаны схемы направленной контролируемой полимеризации и сборки генно-инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами; создана коллекция белков-носителей и векторов, включающих гены данных белков, адаптированных для клонирования в них целевых фрагментов ДНК; разработана оригинальная технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полимерных матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков.
Практическая реализация вышеперечисленных технологических решений привела к получению ряда новых биотехнологических продуктов. Впервые генно-инженерным способом созданы мультидоменные белки (нанотранспортеры), обеспечивающие распознавание и доставку лекарственных средств, включая фотоактивные соединения, в раковые клетки. Методом микробиологического синтеза создан высокоэффективный рекомбинантный препарат - стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «САТ-Сом», применяемый для иммунокоррекции ингибитора роста животных соматостатина. Аналогов данного препарата в России и в мире не существует. Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабильность, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию). Полученные на основе данных технологических решений содержащие аффинные домены гибридные белки, такие, как бета-галактозидаза, различные антигены, факторы роста и цитокины, полностью сохраняют свою специфическую активность и могут быть использованы в самых различных областях практического применения.
Впервые показано, что иммобилизация вакцинно-ценных белков на
полисахаридных сорбентах приводит к улучшению их иммуногенных
свойств. Используемая технология иммобилизации полностью сохраняет антигенные свойства целевого белка. При этом обеспечивается укрупнение, полимеризация антигена, полисахаридный сорбент выступает в роли адъюванта при иммунизации и стимулирует развитие более длительного и напряженного иммунного ответа на вводимые белки.
Впервые разработаны основанные на принципе самосборки подходы для получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. На основе этих подходов впервые получены кандидатные субъединичные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.
Научно-практическое значение работы:
-
Получены мультидоменные белки, обеспечивающие адресную доставку лекарственных соединений в раковые клетки. Практическим применением данных белков может быть создание на их основе нового поколения лекарственных препаратов, обладающих низкой токсичностью и высокой эффективностью в отношении распознавания и уничтожения опухолевых клеток.
-
Создан препарат «САТ-Сом» - высокоэффективный стимулятор роста IV поколения, обеспечивающий ускорение роста, увеличение привесов, надоев, размера шкуры и повышение коэффициента мясности сельскохозяйственных животных.
-
Показана перспективность использования двухкомпонентных белков, обладающих способностью к аффинной сорбции на целлюлозе и ферментативной активностью термостабильной р-галактозидазы, для создания проточных реакторов, позволяющих проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Полученная технология может быть внедрена и использована в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток. Данная технология может быть адаптирована для белков с другой ферментативной (синтетазной или гидролитической) активностью.
-
Получены препараты ряда важных для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии ростовых факторов и цитокинов: эпителиального фактора роста, фактора роста фибробластов, интерферона бета. Специфическая сорбция на аффинных матрицах обеспечивает одностадийную очистку препаратов белка до 95% чистоты.
5. Получены препараты гибридных белковых антигенов, соединенных с аффинными доменами, таких, как ESAT6, CFP10, Ag85A из Mycobacterium tuberculosis, TUL4 из Francisella tularensis, домены 1, 4 и 5 белка LigA из Leptospira interrogans, RTA и RTB рицина, иммобилизованных на аффинных матрицах. Эти препараты могут быть использованы в диагностических наборах различного формата: плашечном, сферических и планарных биочипах и т.д. На основе данных рекомбинантных антигенов разработана технология получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. Вакцины основаны на самосборке белковых антигенов на микро- и наночастицах полисахаридных матриц, которые выполняют функцию носителя, депо и адъюванта одновременно. Полисахаридный носитель обеспечивает укрупнение и полимеризацию антигена, и стимулирует развитие более напряженного и длительного иммунного ответа на вводимые белки. Иммунизация такими кандидатными вакцинами обеспечивает индукцию синтеза цитокинов, высокий титр специфических антител и формирование эффективного Th-І или Th-2 ответа, в зависимости от природы специфического антигена. На основе данной технологии разработаны кандидатные субъединичные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.
Апробация диссертации. Разработанный препарат «САТ-Сом» -стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения на основе рекомбинантного соматостатина - в настоящее время внедрен на крупных животноводческих, свиноводческих и птицеводческих комплексах РФ. Основные результаты работы доложены на 10 всероссийских и 7 международных конференциях, конгрессах, форумах, сессиях и совещаниях по фундаментальным и прикладным аспектам биотехнологии.
Объем и структура работы. Диссертация в виде научного доклада изложена на 56 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 18 рисунками, состоит из разделов «Общая характеристика работы», «Результаты исследований», «Заключение», «Выводы», списка работ по теме диссертации, включающего 51 статью в ведущих российских и зарубежных рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 16 авторских свидетельств и патентов, 1 заявку на патент, на которую получено положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
