Введение к работе
Актуальность темы. В последней трети XX века, несмотря на определенные успехи в борьбе с инфекционными болезнями, значение инфекционной патологии, как одного из основных критериев здоровья, признано всем мировым сообществом.
Сегодня можно констатировать, что суммарная распространенность инфекционных (и паразитарных) болезней, несмотря на предпринимаемые усилия, направленные на борьбу с ними, не только не сокращается, но даже возрастает. Так, если в начале девяностых годов в России ежегодно регистрировалось в среднем 30 млн. случаев инфекционных заболеваний, то в последние годы эта величина превышает 40 млн. (М.Г.Шандала, 2005).
Мировой опыт борьбы с болезнями животных показал, что в системе мероприятий обеспечения здоровья всех видов животных специфическая профилактика занимает важное место. Это связано с тем, что активная иммунизация является наиболее эффективным средством предотвращения многих болезней вирусной и бактериальной этиологии (М.Г. Шандала, 2003; Т.А. Костюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова, 2005; Л.Г. Пантелеева, 2002).
С начала девяностых годов ХХ века во многих странах мира были зарегистрированы вспышки заболевания респираторного тракта кур и индеек, вызванных Ornithobacterium rhinotracheale. Отмечалось увеличение смертности и снижение продуктивности у бройлеров приблизительно с 28-дневного возраста и длилось до конца периода откорма (Van Beek et al., 1994; De Rosa, 1996). Ornithobacterium rhinotracheale выделен во многих странах мира и инкриминирован, как возможный, дополнительный, причинно-обусловленный агент в комплексе респираторных болезней (Van Veen et al., 2000; Sakai et al., 2000).
Следует отметить, что, не смотря на то, что за последние годы в России расширился ассортимент разрешенных к применению средств воздействия на микроорганизмы и вирусы: в период 2001-2005 гг. в РФ зарегистрировано более 100 инактиваторов (М.Г.Шандала, 2006, 2007; Т.А.Костюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова, 2005; Пантелеева, 2002), арсенал экологически безопасных препаратов, разлагающихся в природных условиях до продуктов, не загрязняющих окружающую среду, ограничен (М.Р.Саврилов, 2004; Л.Г. Пантелеева, 2005, 2006). Поэтому изучение антибактериальных и антивирусных свойств соединений различных классов, с целью разработки новых нетоксичных, высокоэффективных, экологически безопасных антимикробных препаратов, используемых в качестве бактерицидов для создания инактивированных вакцин, представляет собой весьма актуальную задачу для науки и практики (А.Э.Высоцкий, 2005; В.Н.Аржаков, М.М.Ермакович, П.В.Аржаков, 2003, 2004). Безопасные инактивированные вакцины – это компромисс в настоящее время в создании вакцинных препаратов.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка биотехнологических параметров создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза.
Поставленная цель решалась следующими задачами:
1. Изучить основные биологические свойства бактерий O. rhinotracheale.
2. Выбрать оптимальную питательную среду накопления для культивирования бактерий O. rhinotracheale.
3. Разработать схему использования теотропина в качестве инактиватора бактерий O. rhinotracheale.
4. Изучить возможность создания вакцинного препарата против орнитобактериоза.
5. Изучить безвредность, аректогенность созданного вакцинного препарата.
Научная новизна. Опираясь на биологические свойства бактерий вида O. rhinotracheale, подобрана питательная среда и параметры культивирования для наработки максимально возможного количества бактериальной массы данного микроорганизма. Разработаны схемы инактивации бактерий различных морфологических форм с помощью препарата теотропина. На основании полученных данных предложена схема инактивации теотропином бактерий O. rhinotracheale с целью создания инактивированного вакцинного препарата. В результате экспериментов доказана сложность в конструировании вакцины против орнитобактериоза с использованием адъювантов и предложена схема создания инактивированной орнитобактериозной вакцины, основанной на новых биотехнологических методах, в частности, ультразвуковой дезинтеграции и инактиватора теотропина.
Практическая значимость. Предложена схема инактивации бактерий с помощью препарата теотропина. Разработано «Временное наставление по применению теотропина для профилактики и лечения инфекционных болезней птиц», рассмотренное на научно-техническом совете и утвержденное первым проректором – проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (15.05.2012). Полученные данные позволяют утверждать, что указанный препарат можно использовать в качестве инактиватора для производства инактивированных вакцин.
Разработаны параметры ультразвуковой дезинтеграции бактерий Ornithobacterium rhinotracheale, позволяющие получать протективный антиген для изготовления вакцин.
Доказана возможность создания вакцинного препарата для профилактики орнитобактериоза на основе дезинтеграта бактериальной массы указанных бактерий и инактиватора теотропина.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму, установлены тинкториальные свойства бактерий Ornithobacterium rhinotracheale - это небольшие грамотрицательные палочки с круглыми концами, спор и капсул не образуют. Установлены ферментативные свойства, отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; не зависимо от вида донора гемолитическая активность (разрушения эритроцитов) не выявлена.
2. Опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащённых средах PPLO-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. По результатам экспериментов пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода – глюкозу. По результатам опытов сконструирована оптимальная питательная среда накопления для культивирования бактерий O. rhinotracheale
3. Результаты исследований свидетельствуют, что из использованных доз (5,0; 7,5 и 10мг/мл) изучаемого препарата теотропина дозы 5,0 и 7,5 мг/мл обладают бактериостатическим, но не бактерицидным действием, а доза 10 мг/мл после 18 часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией 1010 микробных тел является бактерицидной для всех изучаемых микроорганизмов и может быть использованы в качестве инактиватора бактерий O. rhinotracheale для производства инактивированных вакцин.
4. Эксперименты позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий, инактивированные теотропином, обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Полученные данные убеждают, что дезинтеграт с дозой иммунизации по белку в 2,0 и 2,4 мг обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт с меньшими дозами инъекций.
5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий Ornithobacterium rhinotracheale не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный инактивированный вакцинный препарат.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009). Международной научно-практической конференции «Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции» (Димитровград, 2009, 2010, 2011).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 115 страницах, включают 11 таблиц и 27 рисунков. Список использованных литературных источников 171 (в том числе 58 иностранных).
