Введение к работе
Актуальность темы. Контаминация пищевого сырья и продуктов питания бактериями Bacillus subtilis на всех этапах технологического процесса – это серьезная проблема перерабатывающей промышленности. Эти почвенные сапрофиты встречаются повсеместно, отличаются высокой температурной устойчивостью, солетолерантны и способны продуцировать токсины (Крючков, 2006; Бахаровская, 2011). При контаминации бациллами пищевое сырье и выработанные из него продукты питания зачастую не изменяют свои органолептические свойства, поэтому определить их присутствие в пище невозможно до тех пор, пока у потребителя не появятся симптомы интоксикации (Мерчина, 2004; Калдыркаев, 2009). Пищевые токсикозы, вызванные бактериями B. subtilis, характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход (Мирзоева 1957; Пучкова, 2005, Медведев, 2010).
Учитывая сложность лабораторной диагностики, остается актуальной проблема унифицированной схемы бактериологического исследования, повышается значимость бактериофагов как высоко специфичного инструмента для индикации микроорганизмов, позволяющего точно идентифицировать пищевые контаминанты, а также осуществлять более детальную дифференциацию отдельных биотипов и фаговаров внутри вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия бактериофагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида (Ковалева, 2009; Шестаков, 2010). Поэтому все большее число исследователей предпочитают использовать фаговые тесты, как высокоспецифичный метод, способный дифференцировать близкородственные штаммы (Золотухин, 2007; Феоктистова, 2011).
Типовые высокоспецифичные бактериофаги – это биоиндикаторы, благодаря которым можно проводить определение бактерий отдельных видов, иметь возможность установить источник и путь передачи инфекционного заболевания, т.е. провести его эпидемиологический анализ. Так в Канаде в промежуток с 1986 по 1993 было отобрано 146 изолятов Bacillus cereus, причастных к 18 вспышкам пищевого отравления. Из них 142 штамма было разделено на 17 типов фагов (Ahmed, 1995).
В настоящий момент в Российской Федерации не разработаны методики фагоиндикации и фагоидентификации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора. Использование подобных методик позволит в сжатые сроки типировать бактерии вида B. subtilis, используя минимальное количество расходных материалов и трудозатрат в течение 25 часов.
Цель работы – разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания.
Задачи работы:
1. Изучить распространение бактерий B. subtilis в пищевых продуктах.
2. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий B.subtilis.
3. Селекционировать и изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.
4. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат.
5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий B. subtilis.
6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания титра фага с использованием созданного биопрепарата.
7. Разработать схему идентификации бактерий B. subtilis с помощью бактериофагов.
Научная новизна. Выделены из объектов санитарного надзора и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги B. subtilis, из них отобраны наиболее оптимальные специфические бактериофаги Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА для создания биопрепарата.
Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата и усовершенствована схема фагоиндикации B. subtilis в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов c применением созданного биопрепарата.
Усовершенствована схема выделения и идентификации бактерий вида B. subtilis в объектах санитарного надзора с помощью созданного фагового биопрепарата.
Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема фагоидентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать штаммы бактерий B. subtilis из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.
Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичных бактериофагов и усовершенствована схема индикации бактерий B. subtilis методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 25 часов.
По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 февраля 2010 г.) «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА для индикации и идентификации бактерий B. subtilis», «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов», для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
-
Схема выделения бактериофагов из объектов санитарного надзора применительно к бактериям B. subtilis, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.
-
Биопрепарат, созданый из селекционированных фагов бактерий B. subtilis и технологические параметры его изготовления.
-
Схема идентификации бактерий B. subtilis разработана с применением биопрепарата на основе фагов Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА ускоряющая определение видовой принадлежности B. subtilis.
-
Схема ускоренной индикации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора разработана с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) и использованием созданного биопрепарата.
Апробация работы:
Материалы диссертации представлены на: Международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК» (Москва, 2009); Международной научно–практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука ХХI века» (Ульяновск, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, включают 33 таблиц и 7 рисунков. Список использованных литературных источников включает 157 наименования, в том числе 30 зарубежных.
