Введение к работе
Актуальность темы. Известно, что заболеваемость острыми кишечными инфекциями в нашей стране в настоящее время остается довольно высокой, но лабораторное подтверждение кишечных заболеваний в среднем не превышает 50-60% и значителен удельный вес кишечных инфекций с невыясненной этиологией. В то же время данные литературы последних лет свидетельствуют, что этиологическим фактором при кишечных заболеваниях могут быть многие малоизученные родовые группы семейства кишечных бактерий, к которым относятся и бактерии рода Providencia. Интерес, проявляемый в последние годы к малоизученным группам семейства Enterobacteriaceae, в том числе и к бактериям рода Providencia вызван тем, что эти бактерии рассматриваются как возможный этиологический фактор в возникновении кишечных заболеваний (Львов, 1968; Sedlak, Rische, 1968; Авдеева и соавт., 1970 и др.). Представители рода Providencia широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи животных и человека. Бактерии рода Providencia патогенны для разных видов лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, кроликов, хомяков). Имеются литературные данные о заболеваниях людей: диареи, гастроэнтероколиты у детей, урологические заболевания, вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, внутрибольничные инфекции вызванные бактериями рода Providencia (Батуро 1988; Романенко, 1989; Venieri D.,Vantarakis A., Komninou G., Papapetropoulou M., 2006). Бактерии рода Providencia способны вызывать у животных и людей самостоятельные или в ассоциации с другими микроорганизмами заболевания. Известно о случаях обнаружения вида Providencia rettgeri в фекалиях больных диареей поросят-сосунов и новорожденных телят в период массовых желудочно-кишечных заболеваний молодняка (Кононенко, Бритова, Каврук, 1994; Золотухин с соавт., 1999, 2004).
Выделение и идентификация бактерий рода Providencia в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Providencia. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из-за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов недоступны для большинства лабораторий. В связи с выше изложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Providencia.
Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Габрилович, 1981; 1983; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Натидзе с соавт., 2005; Золотухин, 2005, 2007) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов. Метод фагодиагностики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.
Выделением и изучением бактериофагов рода Providencia занимались (Габрилович с соавт., 1998). Однако в арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют бактериофаги рода Providencia. Поэтому получение специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Providencia и их применение с целью индикации и идентификации, является актуальным.
Целью исследований является выделение бактериофагов, активных в отношении штаммов бактерий рода Providencia и разработка на их основе диагностического биопрепарата для индикации и идентификации гомологичных энтеробактерий.
Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить ареал распространения бактерий рода Providencia.
-
Выделить и селекционировать из патологического материала и объектов ветеринарного надзора бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий рода Providencia.
-
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
-
Разработать технологические параметры изготовления фагового биопрепарата и сконструировать на основе выделенных штаммов новый биопрепарат – диагностикум.
-
Разработать схему идентификации бактерий рода Providencia с помощью бактериофагов.
-
Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.
Научная новизна. Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Providencia, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов.
Впервые разработаны биотехнологические параметры для фагоидентификации и фагоиндикации Providencia в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.
Практическая значимость работы. Селекционированы два изолята бактерий рода Providencia F – 67 УГСХА и F – 87 УГСХА, обладающие выраженными биологическими свойствами, соответствующие требованиям, предъявляемым к производственным штаммам фагов, которые можно использовать для изготовления диагностических фаговых препаратов.
По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Providencia из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением специфических бактериофагов F-67 УГСХА и F-87 УГСХА» (рассмотрены на заседании НТС ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина и утверждены первым проректором-проректором по науке В.А. Исайчевым 29.11.2012г.).
«Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) энтеробактерий рода Providencia в патологическом материале, кормах, пищевых продуктах и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов F-67 УГСХА и F-87 УГСХА» (рассмотрены на заседании НТС ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина и утверждены первым проректором-проректором по науке В.А. Исайчевым 29.11.2012г.).
Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных фагов бактерий рода Providencia F – 67 УГСХА и F – 87 УГСХА» (рассмотрены на заседании НТС ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина и утверждены первым проректором-проректором по науке В.А. Исайчевым 29.11.2012г.).
На базе ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» проведены производственные испытания с положительным результатом по оценке эффективности реакции нарастания титра фага проб фекалий, полученных от поросят свинокомплекса «Поволжский» Чердаклинского района Ульяновской области на наличие бактерий вида Providencia с помощью специфических бактериофагов F – 67 и F – 87 серии УГСХА. Исследования проводились с 18 ноября по 23 ноября 2012 года (акт производственных испытаний утвержден директором ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» Р.М. Юсуповым 23.11.2012г).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйственных животных, бактерии рода Providencia распространены в 44% случаев.
-
Из общего количества исследуемых проб (120) патологического материала и объектов ветеринарного надзора выделены 14 изолятов бактериофагов бактерий рода Providencia, соответствующих требованиям для изготовления диагностического фагового биопрепарата.
-
Выделенные бактериофаги имеют литическую активность по Аппельману от 10-5 до 10-10, по Грациа – от 4,2 х 107 ± 0,1 х 107 до 8,3 х 109 ± 0,2 х 109; спектр литической активности варьирует от 14,3 до 85,7%; строго специфичны по отношению к Providencia rettgeri; устойчивы к температуре до 67 С; обработка бактериофагов F-87 УГСХА, F-67 УГСХА хлороформом, выявила выраженную устойчивость к воздействию данного агента в течение 40 минут.
-
Разработанные технологические параметры изготовленного фагового биопрепарата позволяют получить специфический биопрепарат с высокой литической активностью.
-
Разработана схема фагоидентификации бактерий рода Providencia, которая позволяет выделить и идентифицировать эти микроорганизмы за 48 часов.
-
Разработанная схема ускоренной индикации бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ позволяет обнаружить бактерии рода Providencia в концентрации 103 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18-22 часа.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина».
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Международной научно-практической конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006), II-ой открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь XXI века» (Ульяновск, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), Всероссийском совете молодых ученых аграрных образовательных и научных учреждений (Москва, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных (Покров,2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования (Ульяновск, 2009), III Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), IV Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, состоящих из объекта, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 146 страницах (в том числе приложения на 7 страницах), включают 30 таблиц и 13 рисунков. Список использованных литературных источников включает 233 наименования, в том числе 97 зарубежных авторов.
