Введение к работе
Актуальность проблемы. Туляремия – природно-очаговая инфекция, относящаяся к особо опасным инфекционным болезням, крупные вспышки и спорадические случаи которой периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе в России (Никифоров В.В., Кареткина Г.Н., 2007; Splettsfoesser W.D., Tomaso H., Al Dahouk S. et al., 2005).
Природные очаги туляремии отличаются длительностью существования, стойкостью и способностью проявлять активность через много лет эпизоотического и эпидемиологического спокойствия. Особенностью эпидемиологии туляремии является большое разнообразие источников, носителей, переносчиков, факторов передачи возбудителей, механизмов заражения, входных ворот инфекции (Олсуфьев Н.Г., 1975; Новиков Н.Л., Попов В.П., Жуков В.И. с соавт., 2003; Онищенко Г.Г., Дроздов И.Г., Федоров Ю.М. с соавт., 2003; Онищенко Г.Г., 2006; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009 и др.). Возбудитель туляремии обладает высокой экологической пластичностью и вследствие этого высокой устойчивостью в объектах окружающей среды, а по своим биологическим свойствам отнесен к высшей категории «А» среди наиболее опасных патогенных микроорганизмов – потенциальных агентов биологического оружия (Мещерякова И.С., Демидова Т.Н., Горшенко В.В., 2007; Романова Л.Н., 2008).
Диагностика туляремии складывается из индикации и идентификации возбудителя или его специфических антигенов и определения сывороточных антител у человека и восприимчивых животных, при этом, как правило, на практике предпочтение отдается иммунодиагностике, характеризующейся экспрессностью, высокой специфичностью и чувствительностью. К настоящему времени для диагностики туляремии отечественными и зарубежными учеными предложено значительное количество эффективных иммунодиагностических тестов. Однако большая их часть – экспериментальные разработки (Сырова Н.А., Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л., 2008).
В связи со сказанным, исследования, направленные на совершенствование и разработку туляремийных иммунодиагностикумов, налаживание производственного выпуска сертифицированных препаратов, не утрачивают своей актуальности.
Цель исследования – разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для идентификации Francisella (F.) tularensis и лабораторной диагностики туляремии.
Основные задачи исследования:
-
Осуществить подбор штаммов F. tularensis для получения специфических антигенов (водорастворимый белковый комплекс и липополисахарид (ЛПС)).
-
Получить специфические, высокоактивные гипериммунные сыворотки при различных схемах иммунизации кроликов-продуцентов и выделить из них иммуноглобулины класса G (IgG).
-
Разработать производственную биотехнологию получения эритроцитарных туляремийных диагностикумов (иммуноглобулинового и антигенного) и разработать стандартный образец (СО) ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной.
-
Получить флуоресцирующие иммуноглобулины для идентификации возбудителя туляремии в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и иммунопероксидазные конъюгаты для выявления F. tularensis и сывороточных антител против возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА).
-
Разработать иммуномагнитные сорбенты (МИС) для мониторинга возбудителя туляремии в объектах окружающей среды.
-
Провести лабораторные и полевые испытания разработанных медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), определить их диагностическую ценность.
Научная новизна работы. Разработанные методические подходы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров, лигандов и твердофазных носителей позволяют унифицировать биотехнологию производства МИБП для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя: диагностикумов эритроцитарных, тест-систем иммуноферментных, иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих, тест-системы диагностической магноиммуносорбентной. Для мониторинга открытых водоемов на наличие возбудителя туляремии с применением МИС сконструировано техническое устройство «Аквадиамаг», на которое получен патент РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды».
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования по конструированию иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и детекции ее возбудителя, базирующиеся на особенностях антигенной структуры туляремийного микроба и иммунного ответа животных при инъецировании его антигенов, свойствах матриц биотической и абиотической природы, позволили составить алгоритм микробиологических и биотехнологических манипуляций процесса производства и контроля различных туляремийных диагностических препаратов.
Разработаны производственные биотехнологии ряда МИБП для идентификации F. tularensis и диагностики туляремии, стабильно отвечающие требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам. На все разработанные МИБП составлена нормативная документация: промышленный регламент (ПР) № 1879-07 и фармакопейная статья предприятия (ФСП) № 9168-08 на диагностикум эритроцитарный туляремийный антигенный жидкий; ПР № 1313-03 и ФСП № 9169-08 на диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуноглобулиновый жидкий; получены регистрационные удостоверения от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2011/10270 от 05.03.2011 г. и № ФСР 2011/10271 от 05.03.2011 г., соответственно; пусковой регламент (ПУР) № 01897080-07-09 и Технические условия (ТУ) 9388-010-018978-2009 на Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (протокол № 7 от 09.06.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора), № ФСР 2010/06744 от 05.02.2010 г.; СО № 001-9389-2008 ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной адсорбированной сухой (одобрен Ученым советом и утвержден директором института, протокол № 4 от 16.04.2009 г.); ПУР № 01897080-10-10 и ТУ 9389-017-01897080-2010 на иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие (протокол № 6 от 28.05.2010 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора); ПУР № 01897080-04-09 и ТУ 9388-006-17897080-2009 на тест-систему диагностическую магноиммуносорбентную для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (протокол № 4 от 16.04.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанные биотехнологии обеспечивают получение высококачественного биологического сырья, пригодного для производства туляремийных МИБП.
-
Сконструированные эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуоресцентные, магноиммуносорбентные туляремийные диагностикумы отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам.
-
Лабораторные и полевые испытания разработанных туляремийных МИБП демонстрируют их высокую чувствительность, специфичность, соответствие нормативной документации, что позволяет наладить производство сертифицированных препаратов.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010); III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011).
Апробация диссертации состоялась 6 апреля 2011 г. на расширенном заседании научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жарниковой И.В., к.б.н. Ждановой Е.В., д.м.н. Зайцевым А.А.
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР (№№ Госрегистрации 01.2008 02135; 01.2009 52158; 01.2009 52157) и федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)», контракт №117-Д от 11.08.2009 г., отражено в 11 научных работах, две из которых опубликованы в журналах, рекомендуемых «Перечнем ВАК».
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 187 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения; иллюстрирована 28 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 288 источников, из них 181 - отечественных и 107 - зарубежных.