Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Влияние степени гликозилирования на биологическую активность белка 12
1.2. Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина 13
1.3. Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов 17
1.4. Краткая схема технологического процесса 18
1.5. Методы оценки качетва дарбэпоэтина альфа 22
1.6. Валидация аналитических методик в процессе биотехнологического производства лекарственных средств 25
2. Собственные исследования 34
2.1. Материалы и методы 34
2.2. Результаты исследований 40
2.2.1. Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства 40
2.2.2. Валидация разработанных хроматографических методик количественного определения дарбэпоэтина 57
2.2.3. Разработка методики оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина 79
2.2.4. Валидация методики установления подлинности дарбэпоэтина с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом. 82
2.2.5. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса 83
2.2.6. Стандартизация конечного продукта 89
2.2.7. Создание стандартного образца предприятия дарбэпоэтина 96
3. Обсуждение результатов 104
4. Выводы 109
5. Практическое использование научных результатов 110
6. Рекомендации по использованию научных выводов 110
7. Список литературы
- Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина
- Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов
- Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства
- Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса
Введение к работе
Актуальность темы. Создание эффективных и безопасных лекарственных средств с использованием методов генной инженерии на всех этапах фармацевтической разработки обеспечивается проведением аналитического контроля с применением надежных методов исследования. Вопросы контроля качества и стандартизации лекарственных средств особенно актуальны в связи с разработкой более эффективных генно-инженерных средств нового поколения (Дегтерев Е.В., 2002).
Одним из таких средств является дарбэпоэтин – гипергликозилированный аналог человеческого рекомбинантного эритропоэтина, применяемый для коррекции анемий различного генеза (SinclairA.M., 2005). В настоящее время на российском рынке представлен только оригинальный препарат дарбэпоэтина – Аранесп, производства фирмы Amgen, США. Для данного белка отсутствуют единые требования к стандарту качества, а также дарбэпоэтин не имеет доступных стандартных образцов.
Важной задачей в прикладной метрологии в биотехнологическом производстве является разработка стандартных образцов. Кроме того, необходимо систематизировать задачи аналитического контроля по этапам создания лекарственного средства (Дегтерев Е.В., 2002).
Таким образом, мониторинг качества наиболее важных параметров на разных стадиях биотехнологического процесса такого востребованного белка как дарбэпоэтин является актуальной задачей, решение которой позволит получать безопасный и эффективный рекомбинантный продукт.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы является разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработка и характеристика методов аффинной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при определении концентрации дарбэпоэтина альфа в культуральной жидкости, полупродуктах и продуктах.
2. Разработка методов оценки уровня гликозилирования дарбэпоэтина на различных этапах биотехнологического процесса.
3. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса.
3. Валидация методик оценки качества дарбэпоэтина альфа.
4. Стандартизация конечного рекомбинантного продукта в соответствии с выбранными критериями качества.
5. Разработка стандартного образца предприятия дарбэпоэтина альфа.
Научная новизна. Впервые в РФ разработан методологический подход к оценке качества готового биомедицинского продукта и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства субстанции и готовой лекарственной формы дарбэпоэтина (от получения клона-продуцента до готовой лекарственной формы), включающий применение таких методов как ОФ ВЭЖХ, изоэлектрическое фокусирование с дальнейшим иммуноблоттингом, капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ) и установление биологической активности.
Впервые показана целесообразность применения методики ОФ ВЭЖХ для количественного определения дарбэпоэтина альфа на первых стадиях технологического процесса производства, включая культивирование линии клеток продуцента.
Разработаны методики ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом, представляющие собой инструмент для контроля качества при идентификации дарбэпоэтина на фоне сложных смесей балластных веществ.
Разработан и охарактеризован по наиболее важным параметрам (молекулярный вес белка, концентрация белка, степень гликозилирования, специфическая активность и т.д.) стандартный образец предприятия дарбэпоэтина, позволяющий осуществлять метрологическое обеспечение контроля качества биотехнологического процесса.
Научная новизна работы подтверждена патентом России № 2523948.
Практическая значимость. Разработанные методики представляют собой готовый инструмент для обеспечения оценки качества на фармацевтическом производстве, проведения исследований в медицинских учреждениях, осуществления допинг-контроля, а также фундаментальных и прикладных научно-исследовательских работ.
Новые методики, разработанные для установления критических параметров дарбэпоэтина, были внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию и готовую лекарственную форму, а также опытно-промышленный регламент на субстанцию (№ 56882590-17-12) и на готовую лекарственную форму (№ 56882590-18-13) ООО «Фармапарк».
Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2008 в 2011-2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии ФГУП «ГосНИИгенетика».
Личный вклад соискателя. Разработка методик оценки качества дарбэпоэтина на каждом технологическом этапе производственного процесса получения биофармацевтического продукта, проводилась совместно с к.б.н. Мосиной А.Г., к.б.н. Стародубцевой Л.И., а также с лабораторий иммунологии ФГУП ГосНИИгенетика под руководством к.б.н. Юрина В.Л., за что им выражается глубокая благодарность. Автором проведены обоснование методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина, валидация разработанных методик, разработка спецификации на субстанцию и готовую лекарственную форму рекомбинантного дарбэпоэтина, вошедшая в проект фармакопейной статьи предприятия, а также разработка нормативно-технической документации на стандартный образец предприятия.
Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма – 2013: от науки к промышленности» (Будва, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2014).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Биофармацевтический журнал).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 99 источников, из них 70 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 23 таблицы, 38 рисунков и 9 страниц приложений.
Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина
Гликолизилирование является одной из наиболее важных посттрансляционных модификаций, определяющих структуру и функции большинства белков плазмы человека, в том числе ЭПО [17]. Высокий уровень гликозилирования обеспечивает эффективность его гемопоэтической активности in vivo [18, 19]. В то же время аффинность взаимодействия ЭПО с рецепторами на поверхности клеток-предшественников эритроидного ряда и стимуляция их дифференцировки полностью определяется только полипептидным каркасом молекулы ЭПО. Уровень гликозилирования ЭПО непосредственно влияет на скорость элиминации биологически активного белка из организма и на длительность его гемопоэтического действия, которая, тем не менее, остается крайне непродолжительной для эффективного терапевтического использования гормона при анемиях различного генеза [15, 20].
Кроме того ЭПО, как и другие гликопротеины плазмы, быстро подвергается энзиматической деградации, лишаясь сиаловых кислот, что приводит к короткому времени циркуляции в организме и необходимости частого введения белка для достижения максимального клинического эффекта [21-24]. Известно несколько стратегий повышения стабильности ЭПО in vivo, обусловленных двумя механизмами элиминации (выведения) ЭПО из организма. Это увеличение размеров молекулы ЭПО за счет генно-инженерного введения дополнительных лигандов, что приводит к снижению почечного клиренса [14, 25]. Возможно также введение в молекулу ЭПО дополнительных углеводных цепей, что приводит к увеличению количества сиаловых групп и снижению уровня элиминации ЭПО через экспрессируемые на клетках печени рецепторы для асиалированных белков - ASGR [26].
Один из аспектов гликоинженеринга – это введение N-связанных гликозилированных последовательностей в желаемую позицию в пептидной последовательности, чтобы произвести белок с большим количеством сиаловых кислот в углеводном остатке, увеличивая тем самым биологическую активность [16].
Как показано при создании коммерческого препарата на основе модифицированного ЭПО «Aranesp» компании Amgen, введение в молекулу ЭПО двух дополнительных сайтов N-гликозилирования увеличивает время выведения гормона из организма в 3-4 раза [27-30]. Для получения дарбэпоэтина альфа использована технология генетической модификации белковой структуры ЭПО. Молекула модифицированного ЭПО (дарбэпоэтин альфа) содержит 5 замен в аминокислотной последовательности, две из которых являются дополнительными сайтами N-гликозилирования. Высокая степень гликозилирования обеспечивает дарбэпоэтину пролонгированную биологическую активность и клинический эффект даже при сниженной в два раза, по сравнению с ЭПО, способности к аффинному взаимодействию со специфическим рецептором [22, 31].
Рекомбинантные ЭПО первого поколения, ЭПО альфа и бета, по своей химической структуре идентичны нативному ЭПО и представляют собой гликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа. В структуре молекулы ЭПО выделяют единую полипептидную цепочку из 165 аминокислот, имеющую в своем составе 2 дисульфидных мостика и четыре сайта гликозилирования (Рисунок 1) [14, 32, 33]. Молекула ЭПО имеет четыре карбогидратных цепи, три из которых связаны с пептидной цепью через азот аспарагина (N-гликозилирование), а одна – через кислород серина (O-гликозилирование). При этом гликолизильные цепи составляют около 40% от молекулярного веса молекулы [16, 22, 34, 35]. Каждая из трех N-углеводных цепей (Asn 24, 38 и 83) состоит из 2 - 4 ветвей. Для O-углеводных цепей (Ser 126) характерно наличие 1 -2 ветвей. Углеводная цепь может завершаться остатком сиаловой кислоты. Таким образом, максимальное количество сиаловых кислот в молекуле ЭПО равно 14, что придает всей молекуле ЭПО отрицательный заряд, лишает ее возможности связаться с ASGR-рецепторами гепатоцитов и, соответственно, увеличивает время циркуляции в организме [26].
Известно, что в результате посттрансляционных модификаций образуется смесь различных изоформ, определяемых по числу свободных сиаловых остатков. N-связанные боковые углеводные цепи предсинтезируются различными энзимами и являются доступными для посттрансляционного добавления к полипептиду ЭПО. Каждая изоформа обладает собственной биоактивностью. Наибольшей эритропоэтической активностью обладает изоформа 14 [14, 36, 37]. С другой стороны, изоформы с меньшим числом остатков сиаловой кислоты имеют большее сродство к рецептору ЭПО, но более короткий период циркуляции. Очищенные коммерческие препараты ЭПО альфа и бета состоят из смеси изоформ от 9 до 14 (Рисунок 2) [36].
Аминокислотная последовательность дарбэпоэтина отличается от таковой у человеческого ЭПО в 5 положениях, что и позволило осуществить присоединение дополнительных ветвей углеводов к аспарагиновым остаткам в положениях 30 и 88 без разрушения общей конформации молекулы (Рисунок 4). Таким образом, дарбэпоэтин отличается от ЭПО высоким содержанием углеводов и сиаловых остатков, более высокой молекулярной массой и увеличенным отрицательным зарядом [39].
Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов
Доля воспроизведенных лекарственных препаратов на современном фармацевтическом рынке по разным данным составляет от 77% до 88-95% [49-51]. В соответствии с определением понятия «воспроизведенный препарат», представленном в действующем Федеральном законе РФ, обязательным условием эквивалентности состава воспроизведенного лекарственного препарата оригинальному является идентичность фармацевтической субстанции и лекарственной формы [52]. Согласно определению Директивы ЕС, воспроизведенный медицинский продукт (generic medical product) – продукт, который имеет тот же, что и препарат сравнения качественный и количественный состав действующих веществ (active substances) и лекарственную форму, биологические свойства которых подтверждены в исследованиях биоэквивалентности [53]. Для взаимозаменяемых продуктов должна быть представлена дополнительная информация, подтверждающая их терапевтическую эквивалентность и отсутствие отличий по профилю безопасности воспроизведенного препарата (generic) и препарата сравнения [54].
Необходимо отметить, что для иммунобиологических препаратов при установлении их химической эквивалентности необходимо учитывать сложный состав биофармацевтических продуктов, зависимость профиля безопасности от уникальности производственного процесса, определяющего чистоту продукта, конформацию белка, степень гликозилирования [55].
Основными этапами исследований безопасности и эффективности лекарственных средств в настоящее время являются дорегистрационный (доклинические, клинические исследования) и пострегистрационные этапы. Каждый этап чрезвычайно важен для решения вопроса о возможности продолжения исследований лекарственного препарата и применения его в медицинской практике, однако каждый этап имеет свои особенности и ограничения в оценке безопасности [49].
Таким образом, оценка качества, как конечного продукта, так и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства лекарственного средства является одной из первых и важных стадий подтверждения эффективности и безопасности воспроизводимого препарата.
Данную работу можно рассматривать как часть разработки дорегистрационного этапа проверки эффективности и безопасности с помощью ряда физико-химических и биологических методик для лекарственного средства дарбэпоэтина альфа.
Получение ГЛФ – процесс весьма длительный, проходящий в несколько этапов, таких как получение и культивирование клона продуцента, выделение целевого белка из культуральной жидкости с помощью различных хроматографических методов биотехнологической очистки белка (здесь, как правило, несколько стадий), приготовление субстанции. Из чего следует, что в конце каждого этапа имеется полупродукт, который необходимо охарактеризовать. Таким образом, на каждом этапе следует осуществлять оценку качества полученного белка, который в дальнейшем передается на следующий этап.
Первая стадия – это получение клона продуцента и его культивирование. На данном этапе имеется сложная смесь - культуральная жидкость, которая включает в свой состав огромное количество различных компонентов (целевой белок, клетки, продукты жизнедеятельности клеток, не целевые белки, агрегаты белков, продукты деградации белков и т.д.) [56]. Охарактеризовать целевой белок в такой смеси достаточно сложная проблема. Однако на данном этапе оценка белка по всем параметрам не требуется. Необходимо установить наиболее важные параметры белка, несоответствие которых установленным спецификациям может привести в дальнейшем к получению продукта ненадлежащего качества. В случае с дарбэпоэтином основным параметром является наличие высокосиалированных форм белка и концентрация целевого белка в культуральной жидкости. Контроль концентрации белка позволяет говорить о качестве проведенного процесса культивирования, при этом высокая концентрация белка еще не говорит о качественном процессе культивирования, поскольку в полученной смеси должны присутствовать высокосиалированные форм белка, поскольку именно они и определяют дальнейшую эффективность лекарственного средства [57-60].
Таким образом, для дальнейшего биотехнологического выделения целевого белка из культуральной жидкости необходимо установить минимум информации, а именно количество белка в культуральной жидкости и его изоформенный состав [57].
После стадии культивирования линии клеток продуцента культуральная жидкость, содержащая целевой белок, передается на стадию биотехнологического выделения белка, где в несколько этапов происходит очистка дарбэпоэтина от компонентов, присутствующих в культуральной жидкости и не представляющих никакой ценности для дальнейшего биомедицинского препарата [57].
Культуральная жидкость представляет собой смесь большого количества белков, липидов, протеаз и других биологических соединений, тогда как концентрация целевого белка в среде невысока [57]. Существует большое количество способов выделения белков, одним из самых популярных методов для выделения целевого белка из культуральной жидкости является аффинная хроматография, которая достаточно широко применялась при выделении близкого родственника дарбэпоэтина – ЭПО [61]. Поскольку принцип метода основан на специфическим взаимодействии белка с антителами к данному белку, то выделение белка проходило с достаточно высокой эффективностью. В аффинной хроматографии в основном применялись мышиные моноклональные антитела к ЭПО. Однако в дальнейшую технологическую схему приходиться вносить большое количество дополнительных этапов очистки полученного раствора белка от моноклональных антител, поскольку попадание таких антител с лекарственным средством в организм человека может привести к серьезным проблемам со здоровьем [62-64]. В связи с этим в последнее время проводилось большое количество разработок технологического процесса без такого затратного шага, как аффинная хроматография.
Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства
Поскольку обе методики относится к методикам установления количественного содержания активного компонента, то они были валидирована по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость, промежуточная прецизионность, ПКО, диапазон применения и робастность [78, 80].
Валидация методики количественного определения дарбэпоэтина с помощью аффинной хроматографии. Определение специфичности. Для подтверждения специфичности сравнивали результаты анализа проб культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина, культуральной жидкости дарбэпоэтина и в качестве стандарта образец сравнения Аранесп.
Анализ профилей полученных хроматограмм показал, что пик дарбэпоэтина достоверно определяются на фоне компонентов стандартно присутствующих в образцах культуральной жидкости. Разница во времени удерживания пика аналита на хроматограммах испытуемого образца культуральной жидкости и образца сравнения Аранесп составляет менее 0,2 минут. Типичные хроматограммы культуральной среды, образца сравнения и образца культуральной жидкости дарбэпоэтина представлены на рисунке концентрацией дарбэпоэтина 10 мг/л (А), культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина с помощью аффинной хроматографии (Б), образец культуральной жидкости дарбэпоэтина (В). Время выхода пика дарбэпоэтина лежит в диапазоне от 9,7 до 10,3 минут.
Результаты, полученные в ходе установления рассматриваемого параметра, позволили сделать вывод о специфичности методики.
Определение линейности. Для оценки линейности проводили анализ серии из 7 растворов образца сравнения Аранесп с концентрациями в диапазоне от 5 до 20 мг/л. Растворы готовили путем разведения исходного раствора образца сравнения с помощью подвижной фазы А. Каждый образец анализировался в трех повторностях. На основании полученных данных, представленных в таблице 4, были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой вида y=b x+a методом наименьших квадратов, где у – значение измеренной площади пика дарбэпоэтина (Counts/1000000), рассчитанное по трем хроматограммам, х – внесенное количество дарбэпоэтина (мг/л). Таблица 4. Установление линейности методики количественного определения дарбэпоэтина с помощью аффинной хроматографии
Уравнение и график регрессионной прямой для дарбэпоэтина приведены на рисунке 22. Рисунок 22. Калибровочный график зависимости площади пика дарбэпоэтина от его концентрации в образце
Квадрат линейного коэффициента корреляции (r2) характеризует степень соответствия между регрессионной моделью и исходными данными. В данном случае 99,84% изменений зависимой переменной описывается регрессионным уравнением. Коэффициент корреляции (r) для дарбэпоэтина равен 0,9992. Поскольку коэффициенты корреляции положительные и превышают 0,9900, между измеренной площадью пика и концентрацией аналита в образце существует прямая линейная зависимость.
Были рассчитаны регрессионные остатки и построены графики зависимости остатка от концентрации аналита (Рисунок 23). Остатки рассчитывали как разницу между измеренным значением площади пика и значением, рассчитанным по уравнению регрессионной прямой. Значения остатков приведены в таблице 4. Рисунок 23. График зависимости величины остатка от концентрации дарбэпоэтина
Как видно на рисунке 23, не наблюдается зависимость величины остатков от значения концентрации аналита, то есть рассеяние данных возле линии регрессии одинаково при всех значениях переменной х.
Определение правильности. Для оценки правильности для всех растворов, проанализированных в ходе установления линейности, рассчитывали величины степени извлечения (Recovery, %) по формуле:
Recovery = 100 Cизм/Стеор , (4) где Сизм – среднее значение измеренного количества аналита, рассчитанное по трем повторностям, мг/л, Стеор – внесенное количество аналита, мг/л.
Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значений приведены в таблице 5. Таблица 5. Оценка правильности и сходимости методики количественного определения дарбэпоэтина с помощью аффинной хроматографии
Внесенное количество дарбэпоэтина (Стеор, мг/л) Измеренное количество дарбэпоэтина (мг/л) Среднее значение измеренного количествадарбэпоэтина (Сизм, мг/л) Recovery (степень извлечения), % RSD, %
Полученные значения степени извлечения для каждого аналита лежат в диапазоне от 95 до 105 %, что свидетельствует о высокой степени соответствия между истинным значением аналита и его значением, полученным по данной методике.
Определение прецизионности. Для характеризации прецизионности методики при ее выполнении в одних и тех же условиях в течение небольшого промежутка времени для всех растворов, проанализированных в ходе установления линейности в трех повторностях, рассчитывали величину относительного стандартного отклонения значений измеренной концентрации аналита (RSD, %) по формуле:
Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса
Дарбэпоэтин альфа – один из широко используемых рекомбинантных белков, применяемый в качестве эффективного средства при лечении анемий различного происхождения [12-15, 20, 28-31, 46, 48]. В настоящее время на фармацевтическом рынке представлены лишь зарубежные препараты рекомбинантного дарбэпоэтина, в связи с этим организация производства отечественного белка является приоритетной задачей.
Представленная работа была направлена на разработку процесса оценки качества дарбэпоэтина на всех этапах процесса производства субстанции дарбэпоэтина. Для достижения поставленной цели был осуществлен индивидуальный подход к данному белку, учитывающий особые физико-химические и биологические свойства белка, его сверхгликозилирование и повышенную биологическую активность. В результате были выбраны наиболее важные контролируемые параметры белка и способы их оценки на разных стадиях производственного процесса.
Поскольку объект исследования – дарбэпоэтин альфа – является сверхгликозилированным белком, что в свою очередь отражается в увеличенной биологической активности белка, именно эти факторы оказались определяющими при оценке качества продуктов и полупродуктов на разных производственных стадиях.
Для получения белка использовалась клеточная линия СНО, как хорошо изученная и наиболее широко применяемая в мире для производства гликозилированных рекомбинантных белков [97-99]. Для выделения целевого белка из культуральной жидкости был осуществлен подход включающий ряд биотехнологических методов, таких как ультрафильтрация, анионообменная хроматография, гель-фильтрация и т.д. [56, 57, 65]. Каждый этап технологического процесса производства связан с последующим. Для получения продукта надлежащего качества и снижения экономических затрат, в случае плохой эффективности процесса, необходимо проводить оценку качества полупродукта на каждом этапе технологическогоь процесса по наиболее важным свойствам белка.
Так как в нашем случае эффективность лекарственного средства зависит от активности белка, которая напрямую связана со степенью гликозилирования, то нами были разработаны подходы для идентификации изоформенного состава целевого белка еще на стадии культивирования клеток продуцента. Для идентификации гликоформ дарбэпоэтина использовались два метода анализа – изоэлектрическое фокусирование и КЗЭ. Однако в случае с культуральной жидкостью применение метода КЗЭ невозможно, поскольку концентрация целевого белка в смеси достаточно низкая, а также невозможно проводить идентификацию пиков изоформ дарбэпоэтина на фоне пиков неспецифических примесей с аналогичной подвижностью. В результате для полупродуктов дарбэпоэтина был оптимизирован метод изоэлектрического фокусирования с последующей окраской раствором Кумасси. Дальнейшие предвалидационные эксперименты показали, что данный метод не применим для образцов культуральной жидкости в связи с недостаточной чувствительностью на фоне неспецифических примесей. В этом случае было принято решение проводить стадию иммуноблоттинга с применением специфических антител к ЭПО после стадии изоэлектрического фокусирования. Проведенная валидация методики продемонстрировала пригодность методики для ее применения к образцам культуральной жидкости дарбэпоэтина.
На данном этапе также немаловажным параметром оценки качества проведения процесса культивирования являлась продуктивность. Для выбора оптимальных условий культивирования необходимо было разработать методику установления концентрации целевого белка в образцах культуральной жидкости. Поскольку культуральная жидкость – это смесь большого количества различных компонентов (клетки, нецелевые белки, продукты жизнедеятельности клеток и т.д.), то перед нами стояла задача разработать такую количественную методику, которая позволила бы идентифицировать именно дарбэпоэтин на фоне балластных компонентов и определить его концентрацию в образце. Такой популярный и простой метод как спектрофотометрическое определение белка в нашем случае является неподходящим, поскольку данный метод применим исключительно к читым растворам белков. В свою очередь применимый в случаех сложных смесей метод ИФА также не мог быть применим, поскольку на данный момент не существует разработанных коммерческих систем для дарбэпоэтина. В связи с изложенным выше, нами был разработан новый подход к установлению количественного содержания дарбэпоэтина в культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии. Данный метод был разработан и валидирован в соответствии со всеми международными требованиями к валидации разработанной методики. Методика показала валидность применительно к образцам культуральной жидкости дарбэпоэтина. Однако было установлено, что данная методика является экономически невыгодной.
В связи с этим была разработана другая альтернативная методика количественного определения дарбэпоэтина в различных образцах на базе ОФ ВЭЖХ. В ходе разработки и валидации методики были установлены критические параметры методики и проведена ее валидация, которая подтвердила возможность ее применения для образцов дарбэпоэтина и получение результатов с необходимой точностью. При этом методика ОФ ВЭЖХ показала себя более точной и экономически выгодной в сравнении с аффинной хроматографией.
Таким образом, все образцы на стадии получения и культивирования клона продуцента оценивались по двум параметрам - продуктивность и изоформенный состав с помощью ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом соответственно.
