Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы
2.1. Важнейшие этапы развития биотехнологии 14
2.2. Объекты биотехнологии 15
2.3. Прогресс биотехнологии при создании биопрепаратов и ферментов 16
2.4. Биотехнологические процессы микробиологических, вирусологических, ферментных производств и их вооруженность 18
2.5. Использование полимерных материалов в биотехнологии 56
3. Собственные исследования 67
3.1. Материалы и методы 67
3.1.1. Материалы 68
3.1.2. Оборудование 72
3.1.3. Методы 74
3.2. Результаты исследований 78
3.2.1. Усовершенствование технологии получения фермента трипсина 78
3.2.1.1. Разработка технологических процессов изготовления трипсина 78
3.2.1.2. Разработка технологической линии промышленного производства трипсина 97
3.2.1.3. Освоение опытно-промышленной технологии производства трипсина 101
3.2.1.4. Использование трипсина при культивировании клеток в производстве противовирусных вакцин 103
3.2.2. Разработка и применение полимерных композиций в технологии производства биопрепаратов 115
3.2.2.1. Разработка способа иммобилизации трипсина на полимерном носителе 115
3.2.2.2. Разработка полимерных материалов для биотехнологического оборудования 116
3.2.2.3. Определение токсичности полимерных материалов с использованием микроорганизмов и на культуре клеток 120
3.2.3. Усовершенствование способов культивирования клеток при культивировании вирусов 123
3.2.4. Усовершенствование способа глубинного культивирования золотистого стафилококка St.aures для получения протеина А 154
3.2.5. Усовершенствование технологии различных методов очистки биологических растворов 157
3.2.5.1. Применение материалов на безасбестовой основе для предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации биологических растворов 157
3.2.5.2. Применение микрофильтрации и ультрафильтрации для очистки биологических растворов 168
3.2.5.3. Применение электродиализа для очистки альбумина от солей сульфата аммония 188
4. Обсуждение 192
5. Выводы 204
6. Практические предложения 207
7. Список литературы
- Объекты биотехнологии
- Биотехнологические процессы микробиологических, вирусологических, ферментных производств и их вооруженность
- Разработка и применение полимерных композиций в технологии производства биопрепаратов
- Усовершенствование способа глубинного культивирования золотистого стафилококка St.aures для получения протеина А
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие биотехнологии обусловлено общим прогрессом науки и техники. Совершенствование промышленной технологии производства биопрепаратов наиболее успешно осуществляется при совместном решении биотехнологических и технических вопросов. Разработка биотехнологических процессов при культивировании клеток, вирусов и бактерий, выделении энзимов является актуальной проблемой при получении эффективных биопрепаратов (Грачев В.М., 1985; Спиер Р.Е. и Гриффитс Дж., 1989; Елинов Н.П., 1995; Дьяконов Л.П., 2000; Хапчаев Ю.Х., 2003; Жарникова И.В., 2004; Беклемишев А.Б., 2004; Албулов А.И., 2004; Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2005; Соловьев Б.В., 2005; Тихонов И.В., 2005; Гуславский А.И., 2007; Жданова Н.А., 2009).
Разработка современных технологий в производстве биопрепаратов требует переоснащения оборудования, использования высокоэффективных методов и перспективных материалов, что обеспечит выпуск конкурентоспособной продукции.
Одной из важнейших задач производства биопрепаратов является совершенствование методов культивирования (клеток, вирусов и бактерий) с использованием отечественного оборудования и учетом качественных характеристик препарата. Способ управляемого глубинного культивирования нашел широкое применение в производстве бактерийных препаратов, который за короткое время позволяет получить максимальное количество бактериальной массы. Одной из проблем при культивировании клеток животных и вирусов является поддержание жизнеспособности клеток. Наряду с распространенными стационарным и динамичным (роллерным) способами культивирования клеток и вирусов суспензионное культивирование привлекает внимание исследователей при изготовлении вакцин и диагностических препаратов для максимального накопления клеток и получения вируссодержащего материала (Новохатский А.С., 1979; Лукина В.А., Слепенко Т.Б., Сенько Е.Ф., 1981; Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я, 2005). Суспензионный и псевдосуспензионный (на микроносителях) методы культивирования микроорганизмов создают равноценные условия по всему объему сосуда, позволяют контролировать и регулировать необходимые параметры (рН, рО2, еН, t), осуществлять контроль роста клеток, исключать возможность контаминации, способствовать экономии питательной среды (Сергеев В.А., 1976; Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н., 1976; Осидзе Д.Ф., 1976; Новохатский А.С., 1979; Тарасов В.П., 1990; Гаврилюк Б.К., Сафронов В.П., 1981; Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков, 2000; В.И. Хапчаев Ю.Х., 2003; Тихонов И.В., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я, 2005; Жданова Н.А., 2009). Осуществление крупномасштабного культивирования клеток в суспензии и на микроносителях в реакторах специального назначения отечественного производства связано со сложностью обеспечения стерильности процесса. Исключение контаминации культуральной жидкости посторонней микрофлорой и попадания продуктов биосинтеза в окружающую среду, поддержание, контроль и регулирование процессом являются важнейшими факторами.
В производстве вирусных вакцин при дезинтеграции клеток используют в основном импортный протеолитический ферментный препарат трипсин. Совершенствование технологии с целью получения фермента высокой активности сопряжено с использованием методов очистки и сушки препарата, что позволит создать конкурентоспособную продукцию с заданными свойствами и провести импортзамещение.
Важными этапами при приготовлении питательных и защитных сред, сывороток, ферментов в производстве вирусных вакцин и бактерийных препаратов являются их очистка, разделение и концентрирование, стерилизация. Выбор методов их осуществления представляет сложную задачу, и зависит от качественной характеристики жидкости (Тихонов И.В., 2005). Применение мембранных способов очистки, разделения и концентрирования позволяет создать экологически безопасные, энергосберегающие технологические процессы (Фридлянский И.И., 1976; Дытнерский Ю.И.; 1986, Платэ Н.А., 1999; Тимашов С.Ф., 2000; Шапошник В.А., 2001; Дубяга В.П., Бесфамильный И.Б., 2005; Свитцев А.А., 2007; Гуславский А.И., 2007; Андреева И.С., 2009).
Таким образом, совершенствование технологии культивирования в биореакторах вирусных и бактерийных препаратов, получение отечественного препарата трипсина, разработка различных способов очистки, разделения, концентрирования биологических жидкостей с учетом современных достижений биотехнологии (в настоящее время) являются актуальными.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка и совершенствование биотехнологических процессов в производстве ферментов и биопрепаратов, при получении трипсина и культивировании клеток, при очистке и фильтровании биологических жидкостей с использованием современного оборудования и материалов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- усовершенствовать технологию промышленного производства трипсина;
- разработать способ иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определить токсичность полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;
- усовершенствовать способы культивирования клеток животных при получении противовирусных препаратов с применением современного оборудования и материалов;
- усовершенствовать способ глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;
- усовершенствовать технологию различных методов очистки биологических растворов при микрофильтрации, ультрафильтрации и электродиализе:
определить область применения безасбестовых материалов и мембранных фильтров для предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации, при разделении и концентрировании жидкостей с использованием отечественного оборудования;
разработать технологию получения очищенного альбумина, применяемого в качестве компонента питательной среды при культивировании лептоспир с помощью ультрафильтрации и электродиализа.
Научная новизна. - Усовершенствована технология производства трипсина с применением способов центрифугирования при разделении суспензии после экстрагирования и высаливания фермента и последующего распылительного или сублимационного высушивания, обеспечивающих высокое качество препарата, не требующих его дополнительного измельчения и просеивания препарата.
- Разработана промышленная технологическая линия производства трипсина с использованием современного оборудования. Технология испытана в опытно-промышленных условиях, получен патент РФ № 2403285 от 04.06.2009 “Способ получения трипсина” (оп. 10.11. 2010 бюл. № 31. – С. 743).
Усовершенствован способ очистки и концентрирования трипсина методом ультрафильтрации через разделительные модули на полых волокнах с обеспечением подачи жидкости центробежным насосом.
- Разработан способ иммобилизации протеолитического фермента трипсина, сохраняющего свойства при длительном хранении и обладающего активностью на уровне контроля, обеспечивающего получение жизнеспособных клеток, более высокий выход при культивировании в сравнении с нативной формой.
- Определены технологические параметры культивирования перевиваемых линий клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 в суспензии и псевдосуспензии на микроносителях в биореакторах с магнитным приводом и аэрацией культуры.
- Разработан модуль технологической обвязки для биореакторов (0,005; 0,025; 0,1; 0,25м3). Отработана технология культивирования перевиваемых клеток в биореакторах с использованием специализированного отечественного оборудования, оснащенного фильтрами тонкой очистки воздуха и пара с фильтрующими элементами из пористого титана; запорной малогабаритной и регулирующей арматурой, обеспечивающей осуществление технологических операций в автоматическом режиме.
- Разработаны полимерные композиции, которые применены в биологическом оборудовании в качестве конструкционного материала, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам (авторские свидетельства: № 384361 бюл. - 1973. - № 43. - С.167; № 701129 бюл. – 1979. - № 44. – С.193; № 770126 бюл. - 1980. - № 37. – С.308; № 783311бюл. - 1980. - № 44. – С.110).
- Впервые в отечественной ветеринарной практике разработана технология и использован метод обессоливания альбумина с помощью электродиализа для повышения эффективности процесса очистки растворов от солей.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований по разработке и усовершенствованию технологических процессов получения ферментов и биопрепаратов разработана нормативная и технологическая документация.
“Технологический регламент производства трипсина сухого для вирусологических целей”, утвержденный 01.06.1995 г., директором ВГНКИ и директором ГНУ ВНИТИБП.
“Технические условия ТУ 9358.013.00008064-96 “Трипсин сухой для вирусологических целей”, утвержденные 04.03.1996 г., директором ВГНКИ и согласованные 07.03. 1996 г. Департаментом ветеринарии МСХ РФ.
“Наставление по применению трипсина сухого для вирусологических целей”, утвержденное 04. 03. 1996 г. № 13-6-2/540, Департаментом ветеринарии МСХ РФ.
Разработана технологическая схема производства трипсина. Технология изготовления трипсина освоена в ГНУ ВНИТИБП и НПО “Синтез” (г. Курган), на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах. Опытно-промышленные серии трипсина использованы для получения первичных и перевиваемых культур клеток при производстве противовирусных вакцин на Курской и Армавирской биофабриках, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах.
Определены условия культивирования клеток в биореакторах, разработан Технологический регламент “Культивирование клеток и вирусов с использованием экспериментальных образцов оборудования“, утвержденный директором ГНУ ВНИТИБП 28.12.1985 г. Разработана технологическая схема процесса культивирования клеток и вирусов в аппаратах (реакторах). Технология культивирования клеток и вирусов использована в производстве противовирусных вакцин и диагностических препаратов при ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС АВИ, бешенстве, болезни Марека (БМ).
- Разработаны и предложены в качестве конструкционного материала полимерные композиции, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам. Во ВНИТИБП организован участок по изготовлению полимерных материалов, предложен комплект пресс-форм для изделий биотехнологического назначения.
- Усовершенствована предварительная, тонкая и стерилизующая фильтрация биологических растворов с помощью материалов на безасбестовой основе. Определены условия и возможность использования в биопромышленности экологически безопасных, исключающих фазовые переходы, процессов микрофильтрации и ультрафильтрации; усовершенствован метод очистки альбумина с помощью электродиализа при получении питательной среды для культивирования лептоспир в промышленных условиях.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- технологические процессы изготовления трипсина;
- разработка способа иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определение токсичности полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;
- усовершенствование технологии культивирования перевиваемых клеток животных при получении вирусных препаратов суспензионным и псевдосуспензионным способами (на микроносителях) в биореакторах;
- усовершенствование глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;
- усовершенствование предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации биологических растворов (питательных сред, раствора трипсина, сыворотки крови и других) с помощью фильтровальных материалов на безасбестовой основе;
- совершенствование процессов микрофильтрации и ультрафильтрации в биопромышленности с использованием современных фильтровальных материалов и оборудования;
- технология обессоливания альбумина с помощью электродиализа в условиях промышленного производства.
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и использовании их в практике.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены:
- на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИТИБП (1980-2009 гг.) в виде ежегодных отчетов по заданиям научно-технической программы (НТП) (1980-2009 гг.), фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации (РФ) на 2006-2010 гг.;
- на 23 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских, совещаниях, семинарах, конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов и биотехнологии, проводившихся в Москве, Владимире, Щелкове, Волжске, Курске, Сергиев-Посаде, Покрове, Краснодаре, (1981-2009 гг.);
- на секции “Ветеринарная биотехнология” (2011 г).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 71 научной работе, в том числе 11 в рецензируемых изданиях, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторской диссертации. Получено 6 авторских свидетельства и патентов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 292 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, приложения, содержит 40 таблиц и 52 рисунка. Список литературы включает 457 наименований, из которых 358 отечественных и 99 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность работы, ее научную и практическую значимость.
Автор выражает признательность академику РАСХН А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.
Искреннюю благодарность за руководство НИР и ОКР автор приносит А.И. Гуславскому, Е.Э. Школьникову, В.П. Гайденко, Б.В. Соловьеву, И.Н. Матвеевой, а также В.А. Лукиной, В.С. Иванову, Е.А. Рубану.
Практическую и консультативную помощь в выполнении некоторых разделов диссертации оказывали сотрудники института Н.И. Гвозденко, Н.М. Пухова, Л.А. Скороходова, В.Н. Егорова, А.А. Раевский, А.А.Потемкин, В.Н. Качалов, Е.И. Ярыгина, Е.П. Сапегина, Ю.Д. Фролов, В.Н. Еремец, Л.В. Анисимова, С.М. Панферова, Н.И. Назаркина, И.Б. Пивикова, А.Б Абрамов, В.Е. Васько, М.А. Фролова, а также сотрудники ВГНКИ В.Т. Ночевный, Н.А. Башашкина, Ставропольской биофабрики - А.П. Сурмило, НПО порошковой металлургии - М.П. Анащенко, ВНИИ ЦБП - А.В. Канарский.
Объекты биотехнологии
Инактивированные вирусные диагностикумы используют в реакциях связывания комплемента, нейтрализации и торможения гемагглютинации [24, 30, 343].
Гриппозный диагностикум получают в виде взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов [30].
В работах Жарниковой И.В. показаны методические приемы конструирования иммуноферментных, иммунофлуоресцентных суспензионных диагностикумов, диагностические тест-системы: магноиммуносорбентные для ИФА, эритроцитарные, латексные, суспензионные, алюмосиликатные, иммуноферментные и иммунофлюорисцентные [112, 276].
Ферменты являются объектами биотехнологии. Наука, изучающая ферменты - энзимология. Инженерная энзимология изучает биологические процессы, в которых используется каталитическое действие ферментов. При этом необходимо решать основные проблемы и задачи: - способы выделения и очистки ферментов в зависимости от их топологии в биообъекте или при выделении в среду обитания; - определение состава и строения фермента; -особенности кинетики ферментативного действия в зависимости от внешних условий; - оценку активности ферментов в зависимости от их чистоты или от наличия примесей; - механизмы и пути регуляции синтеза и активности ферментов; - моделирование действия ферментов в иммобилизованном состоянии; - аппаратурное оформление ферментативных процессов; -экономичность процессов. Ферменты, синтезируемые в клетках, являются зимогенами или неактивными ферментами, и для трансформации их в активные формы необходим ограниченный (специфический) посттрансляционный протеолиз. При выделении экзофермента клетки продуцента становятся отходами, а культуральная жидкость (желудочный сок) - целевым продуктом -сырцом. В случае получения эндоферментов, клетки и ткани, содержащие их, измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют соответствующим растворителем, образуя полупродукт - сырец. Следующие этапы технологической схемы тождественны и могут быть использованы такие подходы, как высаливание, сепарирование, центрифугирование, мембранную фильтрацию, гельфильтрацию, аффинную хроматографию, ионный обмен и другие. В процессе выделения и очистки ферментов важен контроль температуры и рН, концентрации белка, ионной силы раствора. В последние годы растет интерес к внеклеточным ферментам микроорганизмов, поскольку микробы - продуценты относительно легко культивируются в контролируемых условиях.
Согласно классификации (КФ) ферменты подразделяются на шесть классов, каждый из которых включает подклассы и подподклассы: І.Оксидоредуктазьі (КФ1.) - катализируют окислительно-восстановительные реакции; И.Трансферазы (КФ2.) - катализируют реакции переноса функциональных групп (фосфатных, ацильных, гликозильных, альдегидных и других); III. Гидролазы (КФЗ.) - катализируют реакции гидролиза (перенос функциональных групп на молекулу воды); IV. Лиазы (КФ4.) - катализируют реакции присоединения по двойным связям и обратные реакции; V. Изомеразы (КФ5.) - катализируют реакции изомеризации, то есть перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм; VI. Лигазы (КФ6.) - катализируют реакции образования связей С-С, C-S и C-N, сопряженных с расходованием энергии АТФ или других нуклеозидтрифосфатов. Подкласс и подподкласс ферментов обозначают вторым и третьим числами; порядковый номер фермента - четвертым числом подподкласса. Эта классификация и номенклатура ферментов распространена на все ферменты независимо от источника их получения. Белки - ферменты подразделяют на две группы -простые ферментные белки и сложные ферментные белки, из которых сложные содержат в своем составе неорганические или органические небелковые структуры - коферменты. Коферменты могут обратимо или необратимо (простатические группы) связываться с белковой частью апоферментом. Полный комплекс называют холоферментом. Действие некоторых ферментов активизируется неорганическими ионами или атомами металлов и если воздействие не снимается полностью в их отсутствии, то такие активаторы называют кофакторами. Источником получения ферментных препаратов являются некоторые растения, отдельные органы животных и некоторые микроорганизмы, способные накапливать значительное количество ферментов. Промышленное производство ферментов растительного и животного происхождения лимитируется с одной стороны ограниченностью сырьевых ресурсов, а с другой стороны - относительно небольшим ассортиментом ферментов, которые могут быть из него получены. С этой точки зрения производство ферментов микробиологического происхождения перспективно, так как сырьевые ресурсы неиссякаемы и ассортимент ферментов чрезвычайно широк. Распространение получили два типа производств ферментных препаратов из культур микроорганизмов. Один основан на культивировании продуцентов на поверхности твердых сред (реже жидких), а второй на культивировании в глубине жидких сред, позволяющий автоматизировать и регулировать процесс. Ферментация предусматривает выращивание продуцента по схеме: лиофилизированная стандартная культура; рост в колбах на качалке до loq -фазы; затем в ферментере малой емкости. Инокулят через 10-80 часов (в зависимости от процесса) в const-фазе подают в промежуточный ферментатор - посевной аппарат; посевной материал в стационарной фазе засевают в головной ферментатор. В производственных условиях ферменты получают при периодическом культивировании продуцентов. Основная ферментация может продолжаться от одних до семи суток в зависимости от микроба и фермента. Перед завершением ферментации культуральную жидкость быстро охлаждают до +5С, при необходимости доводят рН до требуемого показателя; добавляют флокулянт, затем центрифугируют, проводят вакуум-упаривание, добавляют раствор электролита, чтобы освободиться от возможных загрязнителей. Далее раствор фильтруют на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем. Фильтрат поступает в рефрижератор, из которого для получения жидкого концентрата его подвергают ультрафильтрации, консервируют, пропускают через мембранный фильтр и фасуют. В другом случае раствор фермента из рефрижератора пропускают через мембранный фильтр, добавляют к нему электролит для высаливания ферментного белка, пропускают через фильтр-пресс. Фермент собирают и смешивают с раствором концентрата, полученную смесь высушивают в вакуум-распылительной сушилке. Полученный продукт стандартизируют по активности и подают на расфасовку и упаковку [35, 57, 58, 81, 107, 305, 333].
Биотехнологические процессы микробиологических, вирусологических, ферментных производств и их вооруженность
Применение каучуков и резин при работе в агрессивных средах определяется их химической стойкостью, стабильностью свойств в агрессивных средах при повышенных и низких температурах, эластичностью. Их химическая стойкость зависит от природы и строения каучука. Резины на основе бутилкаучука (БК), наирита, фторкаучуков (СКФ), этиленпропиленовых (СКЭП, СКЭПТ) отличаются повышенной стойкостью в неорганических средах, а на основе сульфидных (тиоколов), уретановых (СКУ), фторкаучуков (СКФ), хлорсульфированного полиэтилена (ХСПЭ) - в органических средах. Большинство резин плохо сопротивляется окислению, в частности кислородом и озоном воздуха. Наиболее стойкими в этих условиях являются резины на основе ХСПЭ и БК. Из химически стойких резин на основе СКФ-26 и СКФ-32 изготавливают армированные манжеты и уплотнительные детали, рукава, трубки, защитные оболочки. Существенное влияние на свойства аминных вулканизатов оказывают акцепторы галогеноводородов, при уменьшении основности и увеличении дисперсности соединений свойства их улучшаются. Применение более устойчивых при хранении вулканизующих агентов азотосодержащих соединений позволяет улучшить комплекс свойств (сопротивление раздиру, морозостойкость, диэлектрические свойства). Резины на основе СКФ-26 и СКФ-32 могут длительно эксплуатироваться при температуре 200 С, а резины на основе СКФ-260 длительно при температуре 250С и кратковременно при температуре 250-300С. Для них характерно малое накопление остаточной деформации при длительном пребывании в напряженном состоянии, причем лучшие показатели имеют резины на основе СКФ-26 [62, 70, 145, 268, 270, 338, 340]. Последнее десятилетие характеризуется бурным развитием тканевой инженерии нового направления, возникшего на стыке физики, химии и биологии. Ведутся работы по созданию на основе синтетических полимеров и клеток разных типов тканевых аналогов, призванных скомпенсировать утраченные функции отдельных органов и даже восстановить орган искусственно. Новый подход к получению биосинтетических композиционных материалов использован при разработке биоматериала "искусственная кожа", заключающийся в использовании водных дисперсий синтетического фторкаучука, позволяющих вводить в состав полимерных пленочных материалов водные растворы биологически активных полимеров без нарушения структурной и функциональной целостности. Результатом исследований была разработка на основе латекса СКФ-26 и альгината натрия / метилцеллюлозы новых биоматериалов типа "искусственная кожа", которые по своим физико-химическим характеристикам не уступают современным раневым покрытиям, а по способности поддерживать адгезию клеток существенно их превосходят [90, ПО, 114]. Известно также получение эмульсий перфторсоединений, способных переносить кислород, которые могут быть использованы в качестве основы кровезаменителя - переносчика кислорода [218]. Резины на основе фторкаучуков по стойкости к органическим жидкостям превосходят резины из всех других каучуков. В кетонах и фторированных растворителях они избирательно набухают. Для фторэластомеров характерна высокая стойкость к атмосферным воздействиям, свету, озону, малое накопление остаточной деформации. Они негорючи, маслобензостойки, могут длительно эксплуатироваться при температуре 200-250С. Благодаря высоким эластическим свойствам в широком диапазоне температур, высокой стойкости к различным средам, устойчивости к биологическим объектам каучуки и резины получили широкое применение во многих отраслях народного хозяйства: в частности медицине, фармации, пищевой и биологической промышленности. Среди фармацевтических резин из самой массовой продукции являются укупорочные пробки, исчисляющиеся миллионами штук для флаконов с кровью и кровезаменителей и миллиард штук к флаконам с антибиотиками и инъекционными растворами. Силиконовые резины широко используются для имплантации, для изготовления протезов, мелких суставов, мягких тканей, изготовления трубок. Основными разработчиками медицинских и пищевых резин является НИИР и ВНИИСК. Ими была создана резина 52-336/4 на основе метилвинилсилоксанового каучука СКТВ-м для протезов, пробок, трубок. Для изготовления резиновых пробок использовали также бутиловый и хлорбутиловый каучуки в соотношении 4:1. Детали к бытовым приборам, эксплуатирующиеся при повышенных температурах, изготавливают из материалов стойких к тепловому старению на основе бутадиеннитрильного каучука. Черные резины (52-529, ПБ-8, ПБ-9) содержат 50 в.ч. технического углерода. Светлые резины на основе каучука СКН-26м, содержат в качестве наполнителей мел или каолин в сочетании с литопоном (ПРС-2, ПРС-3, ПРС-4) или титановыми белилами (52-530). В прокладках для консервирования используют резины на основе натурального каучука [77, 78, 80, 179, 180, 181, 195, 284]. Здесь следует отметить работы Шумской Н.И., связанные с определением токсичности материалов (1986) [345, 348]. Токсикологические исследования резиновых изделий медицинского назначения проводят на различных биологических объектах (мелких дождевых червях, дафниях, тканевых культурах, белых мышах, кроликах) применяя разные способы контакта их с резиной. При этом используют прямой контакт с автоклавированным эластомером, измельченной резиной во флаконах с культурой клеток, имплантацию резин в мышцу, под кожу и брюшную полость. Одним из лучших и быстрых способов оценки биологической активности полимеров, в том числе каучуков и резин, многими авторами признается действие их на различные клеточные культуры. По данным разных авторов размеры испытуемых образцов колеблются от 1 до 33 мм3, сроки соприкосновения с культурой клеток от нескольких дней до месяца и более. Оценка культуры тканей (срок жизни клеток, их развитие и размножение, деструктивные изменения в клетках, адгезия клеток к стенкам стеклянных флаконов и другие), проводится по сравнению с контролем ткани, не соприкасающие с пластиками, или контактирующие с пластиками из нейтрального материала. Так токсические свойства резиновых пробок оценивались на первичной культуре клеток почек обезьян.
Токсичность пробок из резин на основе бутилкаучука зависит от типа каучука и от наполнения. Установлено, что бутилкаучук MA и БК -2045, заправленные неозоном Д, дают более токсичные резины, чем бутилкаучук БК-2045М не заправленный неозоном Д. Отмечено совпадение результатов исследования токсичности резин на теплокровных животных и культурах клеток [347].
Немаловажным фактором в создании резиновых изделий являются конструктивные отличия. Так при разработке отечественной пробки для лиофилизации биопрепаратов в пенициллиновых флаконах учитывались нестандартность отечественных флаконов. Поэтому размер герметизирующей части пробки УЛ-1 больше, чем у пробки "Барвил" [177, 307].
Разработка и применение полимерных композиций в технологии производства биопрепаратов
Применение современного оборудования позволило интенсифицировать процесс разделения суспензии по сравнению с методом фильтрования через марлевые фильтры, ткань Бета и фильтровальную бумагу.
На основании проведенных испытаний было показано, что для разделения суспензий после экстрагирования и высаливания фермента необходим тщательный подбор оборудования с учетом объема суспензии, ее исходных характеристик, а также технических показателей оборудования. В зависимости от массы исходного сырья нами рекомендовано использовать для разделения суспензии после экстрагирования: до 70 кг - нутч-фильтр и центрифугу ОФСст, от 70 до 100 кг - Рапид, ОФСст, более 100 кг - шнековую центрифугу ОГШ отдельно или совместно с центрифугой ОФСст для последующего осветления фильтрата.
В случае разделения суспензии после высаливания балластных веществ и трипсина следует использовать при массе исходного сырья 20-50 кг -центрифугу ОФСст, 20-100 кг - суперцентрифугу ОТР-101К, более 100 кг сепараторы для отделения балластных веществ и трипсина и суперцентрифугу для извлечения высола трипсина. При этом в 2-3 раза уменьшились затраты рабочего времени, количество обслуживающего персонала, повысилась культура производства и более чем на 20% возросла активность препарата. Использование центрифугального и фильтровального оборудования исключило из технологического цикла ручной длительный способ фильтрования суспензии, позволило механизировать процесс разделения, повысить его эффективность, снизить потери и улучшить качество препарата.
Определение методов высушивания трипсина. Сухие формы ферментов в наименьшей степени подвержены автолизу и сохраняют исходную активность в течение многих лет хранения. Напротив жидкая форма трипсина (рН 7,2- 7,0) нестабильна и препарат хранят в замороженном состоянии или при рН 2,6-3,0.
Из существующих методов наиболее перспективно распылительное высушивание ферментов. Трипсиносодержащая жидкость (20 %) подвергалась сушке на распылительной установке "Минор" фирмы "Ниро-Атомайзер" или отечественной установке РСЦ-1,2/09 БК РСЦ-10". Проведенные испытания показали, что сохранение активности фермента в процессе распылительной сушки обеспечивалось при температуре теплоносителя 130-140С на входе и 60-75С на выходе (табл. 10). Данный способ сушки позволил довольно быстро обрабатывать большие массы ферментных растворов и получать сразу измельченный сухой препарат.
Параллельно с распылительным методом испытывали сублимационный и кондуктивный (калориферный) методы высушивания трипсина. Сублимационный метод высушивания также позволил получить высококачественный препарат, обладающий пониженным процентом влажности (2-2,5 %), высокой активностью препарата (455+9,0 ЕД).
Наименее эффективным для практического использования был кондуктивный (калориферный) метод высушивания фермента. Длительность данного метода высушивания составила 24-30 час. Активность препарата в 2,1 раза ниже контроля при массовой доле влаги 4,25+1 Д1 %.
Трипсин после кондуктивной (калориферной) сушки необходимо измельчать и просеивать, что связано с дополнительными трудозатратами и удлинением процесса получения фермента, его потерям и снижением растворимости трипсина в связи с неоднородностью размеров дисперсных частиц.
Сравнительная оценка влияния методов высушивания на ферментативную активность трипсина Метод высушивания Температура режима высушивания, С Время сушки, ч Характеристика препарата на входе на выходе массовая доля влаги % активность ЕД Распылительный 130-140 60-75 2 1,56±0,37 443±28,6 Сублимационный -40 30 30 2,30±0,24 455±9,0 Кондуктивный (калориферный) 35-37 24-30 4,25±1,11 232±17,6 Конвективный 35-37 24-30 3,85±0,82 294+25,0 Нативный препарат-высол трипсина - - - 50,00+3,24 492±26,2 Длительный процесс может привести к обсеменению фермента, а для подачи свежего воздуха и удаления отработанных газов необходимо использовать вентилятор или же использовать конвективные сушилки. На основании проведенных исследований пришли к заключению, что наиболее эффективным методом высушивания по скорости процесса, а также по качеству однородности получаемого активного препарата, является распылительный метод, позволяющий быстро сушить большие объемы раствора трипсина.
При сублимационном методе высушивания получали высокоактивный фермент без инактивации препарата в процессе сушки. Данный способ не требовал специального приготовления раствора, и высол трипсина поступал на сушку в виде пасты. Сублимационный метод предлагается, как альтернативный для небольших партий фермента. При необходимости можно использовать раствор трипсина, расфасованный в ампулы или пенициллиновые флаконы. В случае отсутствия распылительных и сублимационных установок сушка препарата проводится в конвекционной сушилке или установке смешанного типа (кондуктивную сушилку, оснащенную вентилятором для смены порций воздуха).
Таким образом, для получения высокоактивного трипсина рекомендуется использовать распылительный или сублимационный методы сушки, исключающие измельчение и просеивание препарата. Исследование влияния технологических факторов на эффективность получения трипсина по всем стадиям позволило определить условия экстрагирования и высаливания фермента, отработать способы разделения суспензии после экстрагирования и высаливания, определить условия концентрирования, очистки и обессоливания растворов трипсина, отработать режимы сушки.
Совершенствование методов контроля качества трипсина. Физико-химическая свойства, протеолитическая и диспергирующая активность опытно-промышленных серий ТС производства ВНИТИБП, НПО "Синтез", Омского и Алма-Атинского биокомбинатов изучены в сравнительном аспекте, в соответствии с требованиями ФС 42-131ВС-88, ТУ 10.07.194-91, РСТ Латвийской ССР 424-84 ТУ ОКП 921.828. 1500. Трипсин фирмы "Дифко" испытан в качестве контроля. Результаты производственных серий трипсина ТС и контроля представлены в табл. 11. Исследуемые серии трипсина отличались по содержанию влаги (2,0-3,7%), протеолитической активности (50-450) по Шоу-Петиколас и растворимости (2,0-20 мин). Содержание нерастворимых примесей у некоторых образцов достигало 10-30%.
Отмечено также, что растворы ТС отличались при визуальной оценке по показателям прозрачности. В соответствии с требованиями ФС 42-131ВС-88 раствор трипсина должен быть бесцветным, прозрачным и без признаков опалесценции. Примеси снижали активность фермента на 20-30%.
Усовершенствование способа глубинного культивирования золотистого стафилококка St.aures для получения протеина А
Используемую среду удаляли и заливали 1 л фосфатно-буферного раствора без кальция и магния, содержащего 0,02% версена (рН 7,6) и промывали микроноситель в течение 5 мин. После осаждения сливали буферный раствор и микроноситель ресуспензировали в 0,25% растворе трипсина (200-250 мл) в течение 15 мин при 37С. Клетки, оставшиеся на поверхности частиц микроносителя, снимали при легком встряхивании. Прекращение действия трипсина осуществляли путем добавления 180-200 мл ростовой среды, содержащей 10% сыворотки КРС. Клетки от микроносителя отделяли путем сбора надосадочной жидкости после декантации в течение 15-20 мин, получая при этом до 85-90% клеток. Для полного сбора клеток, суспензию фильтровали через сита с размером ячеек 100 мкм. Полученные и снятые с микроносителя клетки являлись посевным материалом для 0,025 м3 ферментера. Суспензию микроносителя, покрытого клетками, использовали для заражения вирусом. При получении клеток перевиваемых линий использовали клетки от депонента, которые оттаивали после заморозки в водяной бане (37С), стерильно переносили в сосуд с ростовой средой (матрас объемом 1,5 л). Через сутки роста клеток в матрасах проводили смену среды для удаления криозащитной среды. Выросшие в матрасе клетки, отвечающие требованиям, снимали и рассаживали с учетом коэффициента рассева. Полученную культуру (1-2 пассажа) снимали и замораживали. Эти клетки являлись исходной расплодкой и хранились в сосудах Дьюара. Из ампулы с исходной расплодкой клетки засевали в матрас. После 3-4 пассажей полученную массу клеток замораживали, контролировали, 2 и 3 ступени банка готовили также. В процессе роста клеток в матрасах проводили визуально макроскопический и микроскопический контроль. Снятые с матрасов клетки проверяли на наличие бактерий и контаминантов. Заложенные в банк клетки проверяли на чувствительность к вирусам.
Отработку режимов культивирования перевиваемых клеток в суспензии на начальных стадиях проводили в лаборатории "Процессы и аппараты" на спиннерной установке, представленной на рис. 16, где предусмотрена очистка газовой смеси, автоматическое титрование БАТ.
Разработку крупномасштабного суспензионного и псевдосуспензионного культивирование клеток проводили в лаборатории "Механизации" при участии сотрудников отделов "Вирусологии и культур клеток", "Автоматизации", лабораторий "Питательных сред" и "Процессов и аппаратов" и сотрудников "Промавтоматики".
Для осуществления процессов культивирования клеток в биореакторах разработана и смонтирована технологическая обвязка, включающая: - линии очистки и стерилизации воздуха и газовой смеси /воздух+С02/; - линии обезвреживания отработанных газов; - линии загрузки питательной среды и засевной культуральной жидкости; - линии отбора проб; - линии выгрузки культуральной жидкости; - линии термостатирования. На рис. 17 приведена технологическая схема обвязки биореактора объемом 0,005 м , а на рис. 18 -биореактора объемом 0,025 м .
Технологическая схема обвязки биореактора объемом 0,005 м : 1 - биореактор для культивирования клеток; 2 - емкость для инактивации отходящих газов; 3 - емкость для раствора титранта; 4 - фильтр выходной; 5 -холодильник; 6 - емкость для питательной среды (выгружаемой культуральной жидкости); 7 - емкость для засевной культуральной жидкости; 8 - ротаметр; 9 -клапан УПГФ; 10 - УПГФ; 11 - ресивер; 12 - микрокомпрессор; 13 - БПДУ; 14 - система термостатирования; 15 - фильтр входной; 16 - фильтр головной.
Биореактор объемом 0,005 м стерилизовали в автоклаве при 0,15 МПа в течение 1 часа. Аппараты объемом 0,025 м и более стерилизовали вторичным паром, образующимся в результате нагрева паром через рубашку дистиллированной воды; трубопроводы стерилизовали острым паром. При достижении в биореакторе давления Р = 0,15-0,2 МПа (120-132 С) выходили на режим. Стерилизовали биореактор одновременно с трубопроводами в течение 1 часа.
В работе использовали систему автоматического контроля и регулирования технологических параметров (СК и РТП- 1) глубинного культивирования микроорганизмов и клеток для измерения, записи и регулирования температуры, рН, еН, р02 и управления электроприводом мешалки (Рубан Е.А., Раевский А.А., Абрамов А.Б, Потемкин А.А, Мельниченко В.В.).
Диапазон регулируемых температур составлял от +36С до +39С (погрешность измерения температуры ±0,5С). Диапазон измерения: рН от (2 -12ед.) рН; еН - (-250 - 0- 250) мв. Допустимая погрешность: рН ±0,04 ед. рН; еН ± 4 мв. Диапазон измерения рСЬ составил от 0-155 мм рт. ст. или 0-100% (погрешность ±%).
Культивирование клеток на микроносителях в 0,005 м3 биореакторе проводили после отработки режимов перемешивания. Микроноситель (акрилекс) после трехчасового набухания в ФБР рН 7,4 перемешивали различными типами мешалок: трехлопастной с углом поворота лопастей 90 и 45, а также шестилопастной турбинной. Данные по влиянию типа мешалки на распределение микроносителя в суспензии представлены в табл. 28, 29, 30.
Пробы микроносителя отбирали в пристенном и среднем положении от мешалки и рядом с мешалкой одновременно в трех точках по высоте столба суспензии (20%, 50%, 80%). При этом определяли изменение распределения в зависимости от числа оборотов мешалки и от времени перемешивания. Проведенные исследования показали, что микроноситель распределялся неравномерно по высоте столба жидкости. Наилучшее распределение было отмечено при использовании трехлопастной мешалки с углом поворота лопастей а=90. При повышении скорости перемешивания от 40 до 60 об/мин улучшалось распределение частиц по всей массе. При 80 об/мин распределение МН такое же, как при 40 об/мин. Увеличение времени перемешивания с 2 часов до 5 часов улучшало распределение микроносителя, а увеличение времени до 10 часов несколько снижало этот процесс.
