Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1.1 Биологическая очистка сточных вод 8
1.2 Локальная очистка сточных вод 12
1.3 Методы скрининга микроорганизмов - продуцентов липаз и определение их липолитической активности.
1.4 Микробные липазы 20
1.5 Факторы, определяющие биосинтез липаз микроорганизмами 24
1.6 Применение микробных липаз 29
2. Объекты и методы исследований 35
2.1 Объекты исследований 35
2.2 Скрининг липолитически активных микроорганизмов 35
2.3 Изучение фенотипических характеристик выделенных культур. 36
2.4 Идентификация микроорганизмов 36
2.5 Определение липолитичекой активности 37
2.6 Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез липаз исследуемыми микроорганизмами 38
2.7 Исследование окислительной активности микроорганизмов
2.8 Исследование процесса биодеструкции растительных и животных жиров 39
2.9 Изучение эффективности процесса очистки модельных растворов жиросодержащих сточных вод 40
2.10 Статистическая обработка результатов 40
3. Скрининг и идентификация новых штаммов бактерий, проявляющих липолитическую активность 41
3.1 Выделение и фенотипическая характеристика новых штаммов продуцентов липазы 41
3.2 Идентификация исследуемых штаммов путем секвенирования 16S рРНК 53
4. Изучение липолитической активности новых штаммов бактерий рода serratia 58
4.1 Влияние источника углерода на продукцию липаз изучаемыми штаммами 58
4.2 Оптимизация состава питательной среды для увеличения липолитической активности выделенных штаммов 65
5. Исследование спектра окислительной активности новых штаммов бактерий рода serratia 74
6. Исследование процесса биодеструкции жиров растительного и животного происхождения бактерими рода serratia 82
7. Изучение эффективности процесса очистки модельных растворов жиросодержащих сточных вод бактериями рода serratia 91
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы
- Локальная очистка сточных вод
- Скрининг липолитически активных микроорганизмов
- Идентификация исследуемых штаммов путем секвенирования 16S рРНК
- Оптимизация состава питательной среды для увеличения липолитической активности выделенных штаммов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Развитие пищевых предприятий и расширение сети быстрого питания в России за последние годы, сделало особенно актуальным решение проблемы очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности от жиров, масел, белков и других органических загрязнений. Другой серьезной проблемой является удаление отложения жиров в канализационных системах предприятий и утилизация жира в жироуловителях.
Состояние водной среды, особенно в индустриально развитых регионах, заставляет разрабатывать и вводить в действие все более жесткие нормативы на сброс загрязнений в водоемы и городские коллекторы. Одним из перспективных способов решения этих проблем является биоферментная технология разложения органических веществ, в том числе жиров и растительных масел на локальных очистных сооружениях, находящихся непосредственно на предприятиях (Молоканов с соавт., 2005; Новохатко, Михельсон, 2006).
Биоферментные технологии по разложению и утилизации жиров в сточных водах основаны на использовании микробных липаз и микроорганизмов, способных к их продуцированию. Однако, на рынке Российской Федерации представлены лишь несколько препаратов зарубежного происхождения.
Таким образом, поиск активного продуцента липаз, который мог бы стать основой отечественного биопрепарата для локальной очистки жиросодержащих сточных вод, является весьма актуальным.
Цель исследования. Выделение новых штаммов микроорганизмов, обладающих высокой липолитической активностью, и их изучение в качестве основы биопрепарата для деструкции жиров.
4 Задачи исследования.
1. Выделить из природных и техногенных мест обитания новые
штаммы липолитически активных микроорганизмов.
2. Подобрать оптимальные питательные среды для культивирования
изучаемых штаммов с максимальным выходом липазы.
3. Определить спектр окислительной активности исследуемых микроорганизмов в отношении растительных и животных жиров, а также углеводородов различных классов.
4. Определить эффективность использования липолитически активных микроорганизмов для биологической очистки жиросодержащих сточных вод.
Научная новизна. Выделена и идентифицирована группа новых штаммов бактерий рода Serratia, проявляющих высокую липолитическую активность: Serratia marcescens ИБ 2-1, Serratia marcescens ИБ 2-2, Serratia species ИБ 1, Serratia species ИБ 3-1, Serratia species ИБ 3-3.
Для каждого штамма подобрана оптимальная питательная среда, на которой биосинтез липазы максимален. Выявлено, что штаммы S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 проявляют липазную активность намного превышающую показатели, известные для бактерий этого рода.
Определен спектр окислительной активности бактерий p. Serratia по отношению к жирам растительного и животного происхождения, индивидуальным углеводородам, нефти и продуктам ее переработки.
Практическая значимость.
Предложены новые штаммы Serratia sp. ИБ 3-1 и S. marcescens ИБ 2-2, которые могут быть использованы в качестве продуцентов липолнтических ферментов (Решения Роспатента о выдаче Патентов РФ от 1.03.2007 и от 11.04.2007, соответственно).
В модельных условиях выявлено, что исследуемые микроорганизмы способны осуществлять 100% био деградацию жиров растительного и животного происхождения. Показана возможность использования штаммов
5 S. marcescens ИБ 2-2 и Serratia sp. ИБ 3-1 для разработки биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных вод.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2004), Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени, и 2 патента Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части (5 глав), заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах, содержит 17 таблиц и 17 рисунков. Список использованной литературы включает 144 наименования, из них 71 на русском языке.
Локальная очистка сточных вод
В последние годы для получения различных ферментов находят широкое применение микроорганизмы, которые характеризуются ценнейшими свойствами, обеспечивающими им за короткий цикл развития на доступных питательных средах и в производственных условиях синтез ферментов, необходимых для народного хозяйства (Безбородов, 1991).
Биосинтез многих гидролаз можно регулировать и осуществлять направленно путем подбора соответствующих условий культивирования, и, прежде всего, состава питательной среды. Более того, многие микробные ферменты образуются в ответ на действие индуктора, вносимого в питательную среду, причем активность индуцированного фермента в ответ на добавление специфического субстрата возрастает в процессе роста микроорганизма многократно, тогда как на среде без соответствующего индуктора фермент образуется в минимальных количествах (Безбородов, 1984; Прист, 1987; Гореликова, 2004).
Особенность микроорганизмов заключается также в том, что при определенных условиях микробная клетка может осуществлять «сверхсинтез». Сказанное полностью относится и к липазам и в целом определяет перспективу микробиологического синтеза перед другими источниками ферментов (Давранов, 1994).
В настоящее время известно достаточно много потенциальных источников для выделения штаммов - продуцентов липаз. Большое количество штаммов, обладающих липолитической активностью, были выделены из реакторов по производству сыра (Рубан с соавт., 1978; Башкатова, Северина, 1979). Многие штаммы выделены из сырого и пастеризованного молока, сливочного и топленого масла (Глазунова с соавт., 1984; Дужак с соавт., 2000). Несколько штаммов обнаружено в почвах (Башкатова, Северина, 1978). Исследование микробиоты сточных вод рыбоперерабатывающего завода и мясокомбината также показало, что доминирующую роль в этом биоценозе играют липолитичеки активные микроорганизмы (Пономарева с соавт., 1994). V.A. Vargos с соавторами (2004) выделили 150 липолитически активных штаммов из озера Bogoria (Кения).
Липазы образуются микроорганизмами разных таксономических групп: бактериями, актиномицетами, дрожжами, микроскопическими грибами. Активные продуценты липаз выявлены среди различных родов грибов. У грибов родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Geotrichium, Sclerotinia и др. обнаружены экзолипазы, различные по активности и свойствам (Рубан, 1977; Заявка ПНР № 265870, Заявка Японии № 4-30833, Давранов с соавт., 1994; Rapp, 1995; HelistoHelisto, Korpella, 1998).
Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент липазы (Rapp, 1995). Данный штамм выращивают при температуре 30С в течение 150-200 часов на питательной среде, следующего состава: MgS04-7H20 - 0,5; КН2Р04 - 1,0; NaN03 - 3,0; пептон - 30,0; дрожжевой экстракт - 1,0; оливковое масло - 10,0. Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости липазной активности - 150 ед. акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком этого штамма является длительность культивирования (6-7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).
М.З. Закировым (1975) описаны свойства термотолерантного гриба Rhizopus microsporus УзЛТ-1; исследованы некоторые свойства внеклеточной липазы из Rhizopus microsporus УзЛТ-3 (Давранов с соавт., 1995); выделен и идентифицирован штамм Penicillium camemberti II-PG3, гидролизующий различные масла с эффективностью 90-96% (Jiali et al, 1995); подобраны питательные среды для биосинтеза липазы Aspergillus awamori (Аренде с соавт., 1975).
Известен способ получения фермента липазы путем культивирования Rhizopus japonicus 1403 на среде следующего состава (%): соевый жмых -1,7; олеиновая кислота - 0,35; кукурузный экстракт - 0,7; (NH HPC - 0,4. Начальное значение рН среды 6,8 - 7,0; температура выращивания - 30С, продолжительность выращивания - 60 часов. Активность липазы в культуральной жидкости составляет 1350 ед. / см (Шеламова с соавт., 1984).
В 2004 году Воронежской государственной технологической академией запатентован способ получения комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы (Пат. РФ № 2233325). Способ получения реализуется при глубинном культивировании штамма-продуцента Rhizopus chinensis ВКМ F 1062 на питательной среде следующего состава, (мас.%): соевый жмых 2,5 - 3,5; подсолнечное масло 0,5 - 0,8; дрожжевой экстракт 0,9 - 1,4; NaH2P04 0,25 - 0,29; К2НР04 0,32 - 0,39.
Использование в качестве продуцентов липаз бактерий, а не грибов, ускоряет процесса культивирования, что делает процесс получения липазы экономически более выгодным. Среди бактериальных микроорганизмов липолитическая активность обнаружена у штаммов родов Pseudomonas, Arhromobacter, Serratia, Bacillus и тд. (Международная заявка № 91/00910; Заявка ЕПВ (WO)№ 0528828; Jaeger, 1997; Shibatani, 2000; Gupta, 2004) . Показано, что среди псевдомонад наиболее высокую ферментативную активность проявляют культуры видов Ps. aureofaciens, Ps. fluorescens, Ps. cepacia, низкую - Ps. maltophylia.
Скрининг липолитически активных микроорганизмов
Источниками выделения липолитически активных микроорганизмов послужили образцы почв, отобранные в различных областях Российской Федерации, а также образцы сточной воды и активного ила из аэротенков биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината.
Культивирование проводили в колбах Эрленмейера при аэрировании на качалке УВМТ-12-250 при 28С, используя среду Раймонда (Практикум по микробиологии, 1976) следующего состава, г/л: Na2C03 -0,1; СаС12 - 0,01; MnS04-7H20 - 0,02; FeS04-7H20 - 0,02; NaH2P04 - 1,5; К2НР04 - 1,0; MgS04-7H20 - 0,2; ЫЩЧОз - 2,0; источником углерода служили бараний или свиной жир в количестве 1,0 мас.%; вода дистиллированная - до 1 л. Накопительные культуры выращивали в течение 2-3 суток при микроскопическом контроле роста микробного сообщества. Выделение чистых культур проводили методом посева на среде МПА.
Первичное качественное определение липолитической активности, позволяющее установить наличие липазы, проводили на твердых жирах (бараньем и свином), окрашенных нильским голубым сернокислым (Методы общей бактериологии, 1984). На чашки Петри со средой МПА наносили культуральную жидкость исследуемых микроорганизмов, а затем каплями вносили окрашенный жир. В качестве положительной реакции рассматривали изменение цвета окрашенного жира с розового на сине-фиолетовый в процессе термостатирования чашек Петри при температуре 27С. За процессом наблюдали в течение семи суток.
Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик культур проводили по стандартным методикам, описанным в определителе бактерий (Определитель бактерий Берджи, 1997), в «Методах общей бактериологии» под редакцией Ф. Герхарда и др. (Методы..., 1984), а также в практикуме по микробиологии Н.С. Егорова (Практикум..., 1976). Морфологию клеток исследовали на препаратах 4, 24, 48 и 72 - часовых культур, выращенных на чашках Петри со средой МПА, и в жидкой культуре с использованием световой микроскопии.
Идентификацию штаммов выделенных микроорганизмов ИБ 1, ИБ 2-1, ИБ 2-2, ИБ 3-1, ИБ 3-3 проводили на основании определителя бактерий (Определитель..., 1997)и путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК.
Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК бактерий проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы "Applied Biosystems" (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.0».
Секвенирующую реакцию проводили при следующем режиме: 96С -10 сек., 53С - 10 сек., 60С - 4 мин. Количество циклов 25-30. Состав реакционной смеси включал 4 мкл «Terminator Ready Reaction Mix», 10-15 нг амплифицированной ДНК-матрицы, 3.2 пкм праймера. Смесь до конечного объема 10 мкл доводили деионизованной водой.
Очистку от избытка невключившихся меченых дидезокситерминаторов проводили с помощью набора «Centri-Step» "Applied Biosystems" (США).
Были секвенированы по 2 фрагмента гена каждого штамма. Далее было проведено сравнение этих фрагментов со всеми известными последовательностями, депонированными во Всемирной базе генов (GenBank).
Липолитическую активность микробной биомассы определяли по модифицированному методу Ota и Yamada (Ota et. al., 1966). Культуры выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 100 мл среды на качалке со скоростью вращения 180 об/мин при 28-29С. В качестве субстрата использовали 40% эмульсию оливкового масла в 2%-ном растворе поливинилового спирта. Реакционная смесь включала следующие компоненты: 1 мл культуральной жидкости, 4,5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 8,0, 5 мл эмульсии оливкового масла. Гидролиз проводили в течение часа при 37С, после чего добавляли 10 мл этанола и продукты гидролиза оттитровывали 0,05 М раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора тимолфталеина. Контрольные образцы титровали сразу же без выдерживания в термостате, добавив этанол. Активность липазы выражали в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости. Расчет специфической липолитической активности (ЛА) производили по формуле: (V-Vk)-K t-Ve где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование тест-пробы, мл; Vk - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование контрольной пробы, мл; К - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М №ОН(К=50),мкМоль; t - время реакции, час; VE - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл. Титр культуры определяли посевом на МПА.
При исследовании факторов, влияющих на секрецию липаз, переменными величинами являлись источник углерода (крахмал, свиной и бараний жир, соевая мука (ТУ - 9146-002-43327088-00) следующего состава, (%): белки 52,3; жиры 5,3; углеводы 30,4; минеральные вещества 6), источник органического азота (пептон, дрожжевой экстракт, автолизат пивных дрожжей). Составы сред изложены в главе 4.
Окислительную активность исследуемых микроорганизмов определяли по выделению углекислого газа. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах объемом 500 мл. В качестве питательной среды использовали 250 мл минеральной среды с добавлением 1% источника углерода и 5 мл суточной культуры микроорганизмов с содержанием клеток 1,0-109 КОЕ/мл. Состав минеральной питательной среды, г/л: К2НР04 -1; (NH SCV- 5; вода дистиллированная до 1 л. С помощью компрессора-дозатора со скоростью 520 мл/мин в герметично закрытые колбы подавали стерильный атмосферный воздух. Аэрируемый воздух, прошедший через колбу с микроорганизмами, окисляющими субстрат, улавливали поглотителем углекислого газа, в качестве которого использовали 200 мл 0,1 н. NaOH. Из колб с поглотителем посуточно отбирали аликвоту 10 мл и оттитровывали ОД н. НС1. Окислительную активность определяли по количеству образованного углекислого газа, оттитрованного кислотой. В качестве контроля использовали колбы, не засеянные микроорганизмами. Длительность эксперимента составляла 3 суток.
Процесс биодеградации растительных и животных жиров исследуемыми микроорганизмами изучали средах, основой которых служила среда Раймонда. Варьировали концентрации соевой муки (0-2,5 мас.%) и автолизат пивных дрожжей (3-9 мас.%), а также их сочетания. Жиры и масла вносили в количестве 1 мас.%. Культуры микроорганизмов вносили петлей с агаризованной питательной среды (МПА). Микроорганизмы культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 100 мл питательной среды на качалке при температуре 35С, со скоростью вращения 180 об/мин в течение 24-96 часов.
Идентификация исследуемых штаммов путем секвенирования 16S рРНК
В ходе первичного скрининга были выделены 34 изолята: 16 из почвенных образцов, отобранных в различных областях Российской Федерации и 18 из образцов сточной воды и активного ила из аэротенков биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината.
Первичное качественное определение липолитическои активности, позволяющее установить наличие липазы, проводили на твердых жирах (бараньем и свином), окрашенных нильским голубым сернокислым (рис. 1). Величину липолитическои активности оценивали визуально по принятой нами 4-х бальной шкале (рис. 2).
В результате исследований изолятов, выделенных в ходе первичного скрининга, были отобраны 13 культур микроорганизмов, обладающих липолитическои активностью. Нужно отметить, что среди штаммов, выделенных из биологических очистных сооружений, липолитически активных культур оказалось почти в два раза больше, чем среди почвенных. Причем пять из изолятов обладали сравнительно высокой липолитическои активностью как на свином, так и на бараньем жирах. Это выражалось в изменении цвета всей массы окрашенного жира с розового на сине-фиолетовый уже на 2-3 сутки, в то время как для других изолятов полное изменение окраски наступало только на 5-6 сутки термостатирования, либо наблюдалось частичное изменение окраски жира. Таким образом, для дальнейших исследований были отобраны пять наиболее активных изолятов 1, 2-1, 2-2, 3-1, 3-3, выделенных из сточной воды. Для удобства № 1 был присвоен изоляту 16 (рис. 1 б). В ходе культивирования изоляты 2 и 3 оказались состоящими из двух отличающихся штаммов, которым были присвоены номера 2-1, 2-2, 3-1,3-3 соответственно. зк"
Обнаружение активных изолятов в стоках мясокомбината, очевидно, отражает специфику поступающих в аэротенки субстратов, которые содержат большое количество жиров (Kubicki, Niewiadomska, 1987; Donnerhork, 1991).
Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик липолитически активных штаммов проводили стандартными методами.
Морфологию колоний исследуемых штаммов определяли на МГЛА после 4-х суток роста при 28С (табл. 1). Данные, характеризующие физиолого-биохимические свойства, представлены в таблице 2. Поверхность шероховатая гладкая гладкая радиально-складчатая гладкая Профиль изогнутый слегка выпуклый плоский выпуклый слегка выпуклый Блеск и прозрачность блестящая, непрозрачная блестящая, непрозрачная блестящая, прозрачная блестящая, непрозрачная блестящая, непрозрачная Цвет малиново-красный с металлическим блеском белый грязно-белый (бесцветный) сверху: оранжево-красный, снизу: малиновый в центре: бледно-розовый, по краям: белый Край гладкий гладкий гладкий волнистый гладкий Структура крупно-зернистая однородная однородная однородная однородная Консистенция мягкая мягкая мягкая мягкая, слегка тягучая мягкая
Способность микроорганизмов расти на средах с высоким содержанием хлорида натрия определяли в жидкой культуре (МПБ). Результаты исследований представлены в таблице 3. Как видно из таблицы все выделенные штаммы хорошо развивались при концентрации NaCl 8%, лишь изоляты ИБ 1 и ИБ 3-1 были способны выдерживать более жесткие условия. Известно, что стоки мясокомбинатов отличаются высоким содержанием поваренной соли, очевидно именно этим обусловлены выявленные особенности исследуемых штаммов (Тимофеева, 1993).
Изучение использования питательных субстратов исследуемыми штаммами показало, что рост всех штаммов на таких углеводах, как глюкоза, ксилоза, арабиноза, сахароза, манноза, галактоза, фруктоза, мальтоза, инозит, сорбитол, сопровождался образованием кислоты (табл. 4). Напротив, при выращивании всех штаммов на целлюлозе, рамнозе и раффинозе образование кислоты не наблюдалось. Ряд органических соединений избирательно усваивался данными штаммами: так, образование кислоты при росте на ацетате несвойственно только штамму 3-3, штамм 2-1 единственный не образовывал кислоту при росте на крахмале, лактоза не потреблялось штаммом 3-1. Следует отметить, что при росте на ксилозе, сахарозе и галактозе штамм 3-1 помимо кислоты образовывал газ.
По ряду признаков, используемых для дифференциации бактерий р. Serratia, таких как реакция Фогес-Проскауэра, гидролиз желатины, окисление-брожение, синтез липазы, образование кислоты из рафинозы, сахарозы штаммы 2-1 и 2-2 были отнесены к виду S. marcescens. Перечисленные выше признаки являются характерными более чем для 90% штаммов данного вида (Определитель..., 1997). Красная, розовая или оранжевая пигментация - признак, варьирующийся среди штаммов S. marcescens (от 25-75% штаммов положительны по этому признаку), (Определитель..., 1997). В нашем случае оба штамма не обладали пигментацией.
Штаммы 1, 3-1, 3-3 являются пигментированными: изолят 1 обладает оранжевой окраской, изолят 3-1 - красной, изолят 3-3 - розовой. Все три штамма были определены как Serratia species, поскольку сравнение с пигментированными видами бактерий рода Serratia, описанными в определителе Берджи (1997), такими как S. marcescens, S. plymutica, S. rubidaea, показало, что исследуемые штаммы отличались по ряду признаков (табл. 5).
Оптимизация состава питательной среды для увеличения липолитической активности выделенных штаммов
Развиваемые в настоящее время биотехнологические методы защиты окружающей среды от техногенных загрязнений основаны на использовании микроорганизмов-деструкторов. Способность утилизировать трудноразлагамые вещества обнаружена у многих микроорганизмов. Это свойство обеспечивается наличием у микроорганизмов специфических ферментных систем, осуществляющих катаболизм таких соединений.
Целью исследований являлось изучение спектра окислительной способности изучаемых штаммов бактерий p. Serratia.
Результаты определения окислительной активности исследуемых микроорганизмов по отношению к жирам растительного (оливковое, подсолнечное, кукурузное масла) и животного (свиной, говяжий, кулинарный жиры) происхождения приведены в таблице 8.
Основным компонентом жиров и масел ( 95%) являются триацилглицероллы (триглицериды), и в небольшом количестве они содержат фосфолипиды, стероиды и каротиноиды. Омыление липидов (щелочной гидролиз) происходит с высвобождением жирных кислот и глицерола (Современная микробиология, 2005).
Деградация жирных кислот происходит в митохондриальном матриксе путем окислительного цикла реакций, при котором последовательно отщепляются Сг-звенья в виде ацетил-КоА (активированной уксусной кислоты). Последовательное отщепление ацетильных групп начинается с карбоксильного конца активированных жирных кислот каждый раз между С-2 (а-атомом) и С-3 (3-атомом). Поэтому цикл реакций деградации называется (3-окислением. Пространственно и функционально Р-окисление тесно связано с цитратным циклом и дыхательной цепью.
Первая стадия р-окисления - дегидрирование активированной жирной кислоты (ацил-КоА) с образованием 3-ненасыщенной жирной кислоты с двойной связью в транс-конфигурации (дегидрирование). При этом оба атома водорода с электронами переносятся от фермента на электронпереносящий флавопротеин (ETF). ETF-дегидрогеназа переносит восстановительные эквиваленты на убихинон (кофермент Q), который является составной частью дыхательной цепи. Вторая стадия деградации жирной кислоты состоит в присоединении молекулы воды к двойной связи ненасыщенной жирной кислоты (гидратирование). На третьей стадии происходит окисление гидроксильной группы при С-3 в карбонильную группу (дегидрирование). Акцептором для восстановительных эквивалентов является НАД который передает их в дыхательную цепь. На четвертой стадии активированная 3-кетокислота расщепляется ацилтрансферазой (3-кетотиолазой) в присутствии кофермента А (тиолитическое расщепление). Продуктами реакции являются ацетил-КоА и активированная жирная кислота, углеродная цепь которой короче на два углеродных атома по сравнению с длиной цепи исходной жирной кислоты (Наглядная биохимия, 2000).
Как следует из данных, представленных в таблице 8, окислительной способностью по отношению к различным растительным и животным жирам обладали в разной степени все изучаемые штаммы бактерий p. Serratia. Первой стадией разложения жиров, как уже указывалось выше, является гидролиз триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицеролла и жирных кислот, катализируемый липазами. Эффективность окисления жиров бактериями p. Serratia зависела от жирнокислотного состава используемых субстратов (табл. 9), что очевидно связано с субстратной специфичностью липаз, продуцируемых микроорганизмами. Окислительная активность исследуемых штаммов по отношению к растительным маслам, содержащим в своем составе много ненасыщенных жирных кислот достигала величин 94 -198 мг СС 2 / г субстрата.
Ферментативные системы штаммов ИБ 1 и ИБ 3-3 тем эффективнее окисляли растительные жиры, чем больше линолевой кислоты в них содержалось. Окислительная способность штамма ИБ 2-2, напротив, была выше по отношению к субстратам, в которых велика доля олеиновой кислоты. Штаммы Serratia sp. ИБ 3-1 и S. marcescens ИБ 2-1 успешнее окисляли кукурузное масло, характеризующееся примерно равным соотношением олеиновой и линолевой кислот.
Жиры животного происхождения окислялись исследуемыми штаммами сложнее, что, вероятно, связано с наличием в их составе до 50 мас.% насыщенных жирных кислот. Величина окислительной активности бактерий p. Serratia на животных жирах для разных штаммов варьировала от 7 до 121 мг СОг/г субстрата.
Наивысшую окислительную активность на жирах животного происхождения, равную 143 мг CCVr субстрата, проявил штамм ИБ 3-1 при культивировании на свином жире. Следует отметить, что на говяжьем и кулинарном жирах величина окислительной активности исследуемых штаммов практически одинакова, вероятно, это связано с тем, что кулинарный жир состоит на 90 мас.% из говяжьего жира с добавлением растительных жиров.
Некоторые из изучаемых штаммов (ИБ 3-1, ИБ 1, ИБ 2-2) при культивировании на минеральных средах с жирами образовывали пену, что может свидетельствовать об их способности к продукции биоПАВ. Способность продуцировать ПАВ, повышающих эмульгирование углеводородов была показана и другими авторами (Yu-Hong Wei et al., 2004). Культуральная жидкость штамма ИБ 3-1 пенилась при окислении всех субстратов, кроме кукурузного масла. Однако, пенообразование не оказывало прямого влияния на величину окислительной активности.
Сточные воды современных предприятий пищевой промышленности и общественного питания помимо жиров могут содержать и другие органические соединения, в частности углеводороды. В литературе есть сведения о штамме Serratia marcescens, выделенном из почвы загрязненной местности, деградирующем 2,4,6-триниротолуол в концентрации 50 мг/л в качестве единственного источника углерода и энергии (Montpas et. al., 1997). С. Berne с соавторами (2004) выделили штамм Serratia odorifera, способный в процессе роста утилизировать трибутил фосфат в концентрации более, чем 600 мМ в течение первых 8 часов после инокуляции.
