Введение к работе
Актуальность темы. Инфекция, вызываемая Yersinia pseudotuberculosis, привлекает к себе внимание исследователей в связи с ростом заболеваемости и все более широким ее распространением (Г.П. Сомов, 1990; Г.В. Ющенко, 2000; H. Fukushima, 2001; В.Ф. Учайкин, 2008).
Несмотря на достигнутые успехи в изучении многих аспектов иерсиниозов, актуальность этой проблемы сохраняется. Стабильные показатели заболеваемости по РФ псевдотуберкулезом (данные официальной статистики) – 7,1 на 100 тыс. населения – в последние 5 лет не отражают истинного распространения инфекций (Г.Я. Ценева, 2006). Анализ изученных факторов патогенности подтверждает абсолютную патогенность бактерий вида Y. pseudotuberculosis для людей и животных (Г.Я. Ценева, 1984; Ю.Е. Полоцкий, 1987; Н.Ф. Тимченко, 1997; Н.Д. Ющук, 2003).
О выделении штаммов Y. pseudotuberculosis из отдельных регионов при эпидемических вспышках, групповых заболеваниях или спорадических случаях людей и животных сообщается в работах M. Tsubokura et al. (1989); Г.Г. Головиной (2000); С.Н. Бениовой (2000); М.В. Чесноковой (2003); K. Jalava et al. (2004); S. Kangas et al. (2008) и др.
В последние годы выражена тенденция к активному изучению и применению в лабораторно-диагностической практике фагов бактерий различных родов и видов (В.Я. Ганюшкин, 1988; С.Н. Золотухин, 1994; Н.Е. Гаевская, 2004; Л.Д. Македонова, 2006; Т.А. Кудрякова, 2010). Бактериофаги применяются для идентификации и фаготипирования бактерий, а также ускоренной индикации возбудителей бактериальных инфекций в различных субстратах. Все большую актуальность приобретают фаготерапия и фагопрофилактика инфекционных болезней как альтернатива использованию антибиотиков.
Многообразие клинических форм псевдотуберкулезной инфекции, высокая стоимость современных лабораторных методов, отсутствие квалифицированных кадров зачастую затрудняют постановку диагноза в рядовых лабораториях, в связи с чем поиск и разработка методов своевременной индикации возбудителя, вызывающего заболевание, являются актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Цель – разработка технологических параметров изготовления и применения биопрепарата «YP – 09 УГСХА» на основе выделенных специфических фагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis. Поставленная цель решалась следующими задачами:
-
Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Y.pseudotuberculosis.
-
Изучить основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфологию негативных колоний, литическую активность, спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость, чувствительность к воздействию хлороформа.
-
Подобрать штаммы бактериофагов с заданными биологическими свойствами – высокой литической активностью, широким спектром литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий, порогом инактивации – для конструирования диагностического биопрепарата.
-
Разработать схему идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью специфических псевдотуберкулезных бактериофагов.
-
Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью диагностического биопрепарата на основе фагов YP – 2 УГСХА и YP – 7 УГСХА методом РНФ.
-
Разработать биотехнологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «YP – 09 УГСХА» на основе выделенных и изученных бактериофагов Y. pseudotuberculosis.
Научная новизна. Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий вида Y. pseudotuberculosis, изучены их основные биологические свойства. Разработаны параметры схемы индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью выделенных и изученных бактериофагов. Впервые разработана технология изготовления диагностического биопрепарата на основе специфических псевдотуберкулезных фагов.
Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные псевдотуберкулезные бактериофаги, пригодные для изготовления диагностического биопрепарата с целью индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды. Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии индикаторных псевдотуберкулезных бактериофагов YP – 2 УГСХА, YP – 7 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с использованием диагностических бактериофагов YP – 2 УГСХА, YP – 7 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида Y. pseudotuberculosis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», утвержденные ректором Ульяновской ГСХА (3 сентября, 2010).
Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная схема выделения бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать вирулентные фаги Y. pseudotuberculosis из объектов внешней среды.
-
Выделенные и изученные штаммы бактериофагов Y. pseudotuberculosis пригодны для изготовления диагностического биопрепарата.
-
Разработанная схема ускоренной идентификации бактерий вида Y.pseudotuberculosis позволяет выделить и идентифицировать бактерии данного вида за 48 часов.
-
Разработанная схема ускоренной индикации бактерий вида Y.pseudotuberculosis методом РНФ позволяет обнаружить бактерии вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды в концентрации 103 – 101 м.к. в 1 мл за 19 – 28 часов, соответственно.
-
Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе псевдотуберкулезных фагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (Покров, 2009).
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов YP – 2 УГСХА, YP – 7 УГСХА и индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (11 – 12 февраля 2010 года).
Работа выполнена в соответствии с тематическим планом исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГУ ВПО «Ульяновская ГСХА» «Диагностика и профилактика болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Пищевые инфекции» (номер Государственной регистрации 01200203524).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (230 всего, в том числе 60 зарубежных авторов). Работа изложена на 151 страницах текста, иллюстрирована 32 таблицами, 15 рисунками и дополнена приложениями.
Похожие диссертации на Разработка и применение диагностического биопрепарата "YP-09 УГСХА" на основе бактериофагов Yersinia Pseudotuberculosis
