Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Использование ДНК-маркеров в генетических исследованиях 10
1,2.Маркер-зависимая селекция 18
1.2.1. Использование маркер-зависимой селекции в свиноводстве 20
1.2.2. Маркеры воспроизводительных качеств свиней 24
І.3.Физиолого-биохимические свойства фолликулостимулирующего гормона (FSH)
1.3.1. Полиморфизм гена Р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHB) и его влияние на воспроизводи- 35 тельные качества свиней
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 39
2.1. Материалы 39
2.1.1. Животные 39
2.1.2. Реактивы 41
2.1.3. Оборудование 42
2.2.Методы 42
2.2.1. ПЦР-анализ 42
2.2.2. Статистический анализ 43
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
3.1. Разработка тест-системы молекулярной диагностики полиморфизма гена Р-субъединицы фолликулостимулирующего гормонa (FSHB) 44
3.2. Генотипирование свиней различных пород по гену FSHB 49
3.3.Анализ генетической структуры популяций свиней различных 53
З пород по гену FSHB 3.4.Ассоциативная связь генотипов и аллелей гена FSHB с воспроизводительными качествами свиней
3.4.1. Ассоциативная связь генотипов и аллелей гена FSHB с воспроизводительными качествами свиней крупной белой породы СГЦ «Заднепровский» 55
3.4.2. Ассоциативная связь генотипов и аллелей гена FSHB с воспроизводительными качествами свиней крупной белой и
63 черно-пестрой породы РСУП «Свинокомплекс Борисовский»
3.4.3. Ассоциативная связь генотипов и аллелей гена FSHB с воспроизводительными качествами свиней уржумской по- 69 роды ГПЗ «Мухинский»
3.4.4. Ассоциативная связь генотипов и аллелей гена FSHB с воспроизводительными качествами помесных свиней ЗАО 75 «Нарцизово» 81
3.5.Сравнительная оценка комплексного влияния генотипов по генам Р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHB) и эстрогенового рецептора (ESR) на воспроизводительные качества свиноматок 84
3.5.1. Комплексные генотипы по генам FSHB и ESR и воспроизводительные качества свиноматок
3.5.2. Сравнительный анализ показателей воспроизводства свиноматок с предпочтительными генотипами по генам FSHB 92 и ESR по отдельности и в комплексе
ВЫВОДЫ 100
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 101
ЛИТЕРАТУРА 102
- Использование ДНК-маркеров в генетических исследованиях
- Материалы
- Генотипирование свиней различных пород по гену FSHB
Введение к работе
Актуальность темы
Развитие мясного животноводства на современном этапе невозможно без внедрения новых биотехнологических методов оценки признаков продуктивности сельскохозяйственных животных, базирующихся непосредственно на анализе наследственной информации. Успехи в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии привело к широкому использованию молекулярно-генетических методов в различных областях науки и практики, в том числе и в животноводстве. (Зиновьева Н.А., 1998) В этой связи, разработка и внедрение в практическое животноводство генной диагностики (ДНК-диагностики) является актуальной задачей фундаментальной и прикладной биотехнологии, одной из областей применения которой является разведение и селекция сельскохозяйственных животных. (Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2004)
Свиноводство является наиболее перспективным направлением возрождения мясного комплекса России, так как эта отрасль животноводства позволяет в короткие сроки при высокой конверсии корма получать мясную продукцию (Ведомственная целевая программа «Развитие свиноводства в Российской Федерации на период 2006 - 2010 г.г. и до 2015 года, 2005).
Успешное развитие отрасли свиноводства во многом зависит от эффективности селекционно-племенной работы. Производство мяса и эффективность селекции свиней могут быть увеличены за счет повышения многоплодия свиноматок (Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006).
Интенсификация селекционного процесса требует научно-обоснованных подходов при проведении племенного отбора. Необходимым условием повышения эффективности племенного отбора является получение точной информации о продуктивности животных в раннем его возрасте, а так же возможности использования полного его генетического потенциала.
Общепринятые методы селекции свиней не позволяют полностью использовать генетический потенциал существующих пород, поэтому необходимы дальнейшие теоретические и практические разработки и внедрение в производство новых эффективных приемов селекции для улучшения адаптивных и воспроизводительных качеств свиней с учетом современных интенсивных технологий (Г.В. Орлова, СВ. Никитин и др., 1999). Генетический прогресс в свиноводстве может быть достигнут только в результате комплексного применения традиционных методов селекции и современных ДНК-технологий (Епишко Т.Н., Шейко Р.И. и др., 2004).
Важной задачей практической генетики является поиск комплексных генотипов с наиболее желательными хозяйственно-полезными признаками и максимально адаптированных к конкретным экологическим условиям. В настоящее время это направление называется "маркер-зависимая селекция" (Marker Assisted Selection - MAS) и разрабатывается в странах с развитым животноводством (Г.В. Орлова, СВ. Никитин и др, 1999; Хейн Ван Дер Стин, 1998).
В качестве маркеров предлагается рассматривать полиморфные генетические системы. Наличие полиморфизма является необходимым условием использования генетического локуса в качестве маркерного. Например, гены, кодирующие биохимические признаки, могут использоваться в качестве маркеров, если они детерминируют варианты, различающиеся по электрофоретиче-ской подвижности (продукты полиморфных локусов представлены на электро-фореграммах спектрами полос, предполагающими кодоминантную экспрессию, то есть, гетерозиготы характеризуются по крайней мере двумя полосами активности, а гомозиготы - одной полосой с различными скоростями миграции) (Г.В. Орлова, СВ. Никитин и др, 1999).
Использование генетических маркеров в селекционной практике различных отраслей животноводства нашей страны начато недавно, по меньшей мере, на 10 лет позднее, чем такие работы были развернуты в практике зарубежного животноводства. Масштабы применения ДНК-маркеров крайне ограничены и
7 несопоставимы с опытом зарубежных стран, где в рамках научных исследований и сугубо коммерческих работ ежегодно тестируется значительное поголовье сельскохозяйственных животных.
Научные разработки американских ученых Li Ning, W.U. Changxin, и др (2001) показали, что аллельные варианты бета - субъединицы гена фолликуло-стимулирующего гормона могут применяться в качестве маркеров плодовитости свиней. В нашей стране подобные эксперименты проводились лишь на ограниченном поголовье отдельных популяций свиней, импортированных из-за рубежа (Адаменко В.А., 2004). Дальнейшее изучение полиморфизма гена (3-субъединицы фолликулостимулирующего гормона и возможность его использования в качестве маркера плодовитости у наиболее распространенной в России крупной белой породы и ряда локальных пород свиней имеет большое научное и практическое значение и являются актуальным.
Цель диссертационной работы состояла в разработке аналитической системы диагностики полиморфизма гена Р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHB) и использование ее самостоятельно и в комплексе с геном ESR в качестве критерия оценки воспроизводительных качеств свиней различных пород.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Разработать тест-систему анализа полиморфизма гена Р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона с использованием метода ПЦР.
Выполнить генотипирование свиней различных пород по гену FSHB.
Провести анализ генетической структуры популяций свиней различных пород по гену FSHB.
Выявить ассоциативные связи полиморфных вариантов гена FSHB с хозяйственно-полезными признаками.
Апробировать методы сравнительной оценки комплексного влияния генотипов по генам FSHB и ESR на воспроизводительные качества свиней.
8 Научная новизна
Разработана тест-система диагностики полиморфизма гена-кандидата плодовитости (FSHB), выявлен полиморфизм у свиней пород крупная белая, черно-пестрая, уржумская, ливенская, эстонская беконная, дюрок, белорусская мясная и помесных свиноматок. Изучена плодовитость свиноматок различных пород в зависимости от генотипов по гену FSHB. Впервые выполнен анализ комплексного влияния генотипов по генам плодовитости FSHB и ESR на воспроизводительные качества свиней.
Практическая значимость
Разработана тест-система диагностики полиморфизма гена FSHB, являющегося потенциальным маркером плодовитости свиней. Проведена апробация системы для определения частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемого гена в 11 популяциях свиней пород крупная белая, черно-пестрая, уржумская, дюрок, ливенская, эстонская беконная, белорусская мясная и помесных свиноматок. Показано предпочтение комплексной оценки воспроизводительных качеств свиней по двум генам плодовитости (FSHB и ESR).
Основные положения, выносимые на защиту:
Аналитическая тест-система диагностики полиморфизма гена FSHB.
Популяционно-генетическая характеристика исследуемых популяций свиней по гену FSHB.
Ассоциации полиморфных вариантов гена FSHB с воспроизводительными качествами свиней исследуемых пород.
Эффективность использования комплексной системы диагностики генов FSHB и ESR для оценки воспроизводительных качеств свиней.
9 Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК («Зоотехния», №4,2007).
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были заслушаны и обсуждены на:
V международной научной школе-конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», ВИЖ, Дуброви-цы, 2005 г.;
научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВРІЖ 2005, 2006 гг.;
студенческом научном кружке кафедры зоотехнии аграрного факультета РУДН, 2006, 2007 гг.;
межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006 г.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 27 таблиц, 37 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практического предложения. Список использованной литературы включает 170 источников, в том числе 80 на иностранных языках.
Использование ДНК-маркеров в генетических исследованиях
Успехи в развитии генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркеров. Первоначально в качестве генетических маркеров использовались морфологические (фенотипические) признаки. С использованием маркеров этого типа в 1913 г. была построена первая генетическая карта (карта генома Drosophilla melanogaster). Однако количество информативных маркеров этого типа ограничено. Морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды (Mohan М., Nair S., 1997). Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генов - белковый или биохимический полиморфизм; и на уровне генетического материала клетки - полиморфизм ДНК (Сулимова Г.Е., 1993,2004).
Первыми были молекулярные маркеры, созданные на основе анализа белкового полиморфизма (биохимические маркеры). Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволило оценить уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизмов до человека) (Алтухов Ю.П., 1989, 2002; Удина И.Г., и др., 2003). Однако анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующих генов. Если учесть, что у высших эу-кариот всего около 1% генома составляют белок-кодирующие последовательности, очевидно, что от внимания исследователей ускользает основная часть генома.
Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфных нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирую-щие. Кроме того, эта маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими типами маркеров (табл. 1)(СулимоваГ.Е.,2004).
Открытие и выделение рестрицирующих эндонуклеаз - рестриктаз, расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК. Полиморфизм длин рестрикиионных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP -Restriction Fragment Length Polymorphism). Впервые ПДРФ был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентификации термо-чувствительной мутации в геноме аденовируса. Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы Ботштейна с соавт. (Botstein D. et al., 1980; Beckmann J.S., Soller M., 1986), в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности (PIC - polymorphism information content). Самими авторами метод был с успехом применен для картирования генома человека (Beckmann J.S., Soller М., 1983, 1986). ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов).
С использованием ПДРФ-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками (Beckmann J.S., Soller М, 1983; Bolet G., 1989; Smith С, Simpson S.P., 1986, Dodgson J.B., 1997). ПДРФ-анализ митохондриальной ДНК и кластера генов, кодирующих рибосомные РНК (рДНК), широко используется в популяци-онной генетике, биогеографических и филогенетических исследованиях (Avise J.C., 1994, Landry D.S., 1987; Smith C.L., Warburton P.E., Cantor С, 1986).
Материалы
Исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных в период с 2003 по 2006 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖа и на кафедре зоотехнии Российского университета дружбы народов.Исследования были выполнены на 703 свиньях 11 популяций 7 пород:
1. Крупная белая (п=59), СГЦ «Заднепровский» Оршанский район, Витебская область Республики Беларусь;
2. Крупная белая (п=155), РСУП «Свинокомплекс Борисовский» Республики Беларусь;
3. Крупная белая (п=73), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;
4. Черно-пестрая (п=111), РСУП «Свинокомплекс Борисовский» Республики Беларусь;
5. Эстонская беконная (п=15), с.-к. «Южный» Гомельского района Республики Беларусь;
6. Эстонская беконная (п=11), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;
7. Уржумская (п=89), ГПЗ «Мухинский» Кировская область;
8. Ливенская (п=70), ГПЗ «им. Георгиевского А.С.» Орловская область;
9. Белорусская мясная (п=7), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;
Ю.Дюрок (п=7), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;
11 .Помесные (трехпородные свиноматки, крупная белая х белорусская мясная х эстонская беконная) (п=106), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь.
Генетическое равновесие имеющихся выборок животных оценивали по уравнению Харди-Вайнберга. Проверку нулевой гипотезы проводили по крите-рию хи-квадрат (х) (Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.Н., 1983; Мои-сейкина Л.Г., Кленовицкий П.М., 2001).
Кластерный анализ проводили на основе Эвклидовых метрик на основе стратегии агломерации (метод кластеризации Joining) с использованием программного обеспечения STATISTICA 6.0 (Боровиков В.П., 2001).
Оценку продуктивных качеств свиней проводили по данным зоотехнического учета (карточка племенной свиноматки - форма 2-СВ).
Описательную статистическую обработку проводили по стандартным методикам с использованием программного обеспечением STATISTICA 6.0 и Exel Office 2003. Достоверность разницы между признаками определяли на основании критерия Уайта для непараметрических наблюдений. Это связано с тем, что объемы выборок были не достаточно велики, и невозможно доказать нормальность их распределения (Гатаулин A.M., 1970). Однако при увеличении численности выборок можно рассчитывать на нормальное распределение и достоверность данных может быть доказана и стандартными методами для параметрических выборок.
Индексную оценку свиноматок по комплексу воспроизводительных качеств проводили с использованием методики профессора ДонГАУ Михайлова Н.В. (1989,2000)
Формула индекса имеет следующий вид:
i=a(xh -Y)+b{x2i -Т2)+с(хгі 3)+d({x4i -Y4), где I - индекс свиноматки; a, b, с, d - весовые коэффициенты признаков, включенных в оценку; X, - значение признака оцениваемого животного (например, многоплодие); х - среднее значение признака по стаду (среднее значение многоплодия). При этом число слагаемых равно числу признаков, по которым оценивается свиноматка.
Генотипирование свиней различных пород по гену FSHB)
Результаты ранее проведенных исследований (Li Ning et al, 2001; Ада-менко В.А., 2004) показали, что многоплодие, как и другие признаки воспроизводительной способности, имеет низкий коэффициент наследуемости (число родившихся поросят - h2=0,05-0,19; число поросят к отъему - h2=0,05-0,19). Низкая наследуемость многоплодия свидетельствует о малой эффективности массового отбора (Петухов В.Л. и др., 1989).
В то же время достижения современной молекулярной генетики позволяют повысить эффективность отбора животных. В этом плане наиболее перспективно использование методов маркер-зависимой селекции.
Исследованиями Zhao (2001) показано положительное влияние алеля В гена FSHB на многоплодие свиноматок, однако, породы и популяции свиней России и Беларуси мало изучены с точки зрения полиморфизма этого гена и ассоциативной связи его аллельных вариантов с воспроизводительными признаками.
В связи с этим перед нами стояла задача по изучению частот встречаемости аллелей и генотипов по гену FSHB 11 выборок 5 пород и помесных свино-, маток, разводимых в Российской Федерации и Беларуси. Распределение частот встречаемости генотипов гена FSHB в этих группах приведено в таблице 8 и на рисунке 11.
Свиньи характеризовались наличием трех генотипов АА, АВ и ВВ. Полученные экспериментальные данные показали высокую частоту генотипа ВВ, которая колебалась от 45,71% у свиноматок ливенской породы до 100% у хряков породы дюрок. Не установлено животных, носителей генотипа АА в популяциях свиней пород, крупной белой, белорусской мясной (ЗАО «Нарцизово»), а так же у хряков черно-пестрой породы (РСУП «Свинокомплекс Борисовский»). В других популяциях свиней на долю животных с генотипом АА приходилось от 1,29% (крупная белая порода РСУП «Свинокомплекс Борисовский) до 20,2% (у свиноматок уржумской породы).
Установлено, что животные ливенской, уржумской и эстонской беконной пород характеризуются более высокой частотой встречаемости генотипа АА, чем свиноматки крупной белой и черно-пестрой пород. Очевидно, это связано с происхождением этих пород, поскольку все они основаны на местных свиньях, разводимых в местах зарождения этих пород с прилитием крови крупной белой, а в случае с эстонской беконной- с датскими ландрасами (Кабанов В.Д., 2003). Возможно местные, аборигенные породы несли в себе в основном аллель А, а в процессе их улучшения европейскими породами привносился аллель В.
Анализ генетических расстояний исследуемых выборок показал, что все анализируемые популяции находятся в генетическом равновесии.
Частоты встречаемости аллелей гена FSHB, ранжированные по уменьшению частоты аллеля В, полученные в изученных популяциях свиней представлены на рисунке 12.
Похожие диссертации на Разработка и применение аналитической системы диагностики маркерных генов плодовитости свиней
