Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 7 - 24
ГЛАВА 1. Обзор литературы по изучаемой проблеме 25 -135
1.1.Предпосылки развития гаплоидной биотехнологии для
интенсификации генетико-селекционных работ с зерновыми
колосовыми злаками 25
1.2.Генетические предпосылки возникновения гаплоидов в системе
in vivo 28
1.3.Получение гаплоидов сельскохозяйственных растений с
использованием метода культуры изолированных клеток и
тканей растений in vitro: 36
1.3.1.Получение гаплоидов в культуре неоплод отворенных завязей и
семяпочек (гиногенез) 42
1.3.2. Получение гаплоидов в культуре изолированных пыльников и
микроспор (андрогенез) 45
-
Влияние различных факторов на индукцию гаплоидного каллуса и регенерацию гаплоидных растений в культуре изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы 61
-
Цитологические особенности эмбриоидогенеза in vitro у мягкой пшеницы 73
-
Гормональная регуляция андрогенеза in vitro у мягкой пшеницы 95
-
Эффективность морфогенеза и регенерации растений в культуре 109 изолированных пыльников мягкой пшеницы
1.8. Возможности гаплоидной биотехнологии и пыльцевой селекции в соз
дании сельскохозяйственных растений, устойчивых к грибным
болезням 115
I ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА П. Материал и методы исследований 136-181
2.1. Условия проведения исследований, исходный материал, схемы
и методики проведения исследований 136
-
Исходный материал и объекты исследований 136
-
Генеалогия сортов озимой мягкой пшеницы, представляющих практический интерес для селекции in vitro 139
-
Схемы экспериментальных исследований 145
-
Методики проведения исследований 149
-
Выращивание донорных растений озимой мягкой пшеницы Метеорологические условия в годы проведения исследований 149
-
Определение стадии развития пыльцы 159
-
Холодовая предобработка колосьев, выделение и культивирование пыльников, микроспор, семяпочек мягкой озимой пшеницы 161
-
Культура изолированных микроспор мягкой озимой пшеницы 169
-
Пересадки андроклинных структур в культуре in vitro и получение растений-регенерантов мягкой озимой пшеницы 169
-
Методы изучения андрогенных каллусирующих структур
на устойчивость к фузариозу 169
2.2. Методы проведения исследований 172
-
Культивирование изолированных пыльников озимой пшеницы 172
-
Индукция андрогенеза in vitro и получение растений-регенерантов мягкой озимой пшеницы 174
-
Цитологические методы исследований. Цитофотометрия ДНК 175
-
Определение жизнеспособности клеток и продуктивности эмбриоидогенеза 177
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА Ш. Технологические условия и показатели получения
удвоенных гаплоидов в культуре изолированных пыльников и
микроспор мягкой пшеницы с озимым типом развития 182-232
3.1. Зависимость андрогенеза in vitro от стадии развития микроспор
и состояния стенок гнезда пыльника 182
-
Влияние температурных воздействий 197
-
Влияние состава питательных сред . 209
-
Влияние концентраций ацетона на андрогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор in vitro 220
-
Влияние органических добавок, фитогормонов и температуры
на андрогенез in vitro мягкой озимой пшеницы in vitro 227
ГЛАВА 1Y. Морфогенез в культуре андрогенной каллусной
ткани озимой мягкой пшеницы 233 - 252
4.1. Цитологические характеристики прямого и каллусирующего
андрогенеза in vitro у озимой мягкой пшеницы 233
4.1.1. Цитологические особенности начальных этапов спорофитного
пути развития микроспор 233
4.2. Особенности строения клеток морфогенного/неморфогенного
каллуса и эмбриоидов, полученных в культуре изолированных
пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы 240
ГЛАВА Y. Регенерация растений при андрогенезе in vitro
у озимой мягкой пшеницы 253 - 271
-
Регенерационная способность селекционных генотипов озимой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников и микроспор 253
-
Проявление генетической изменчивости в условиях андрогенеза
in vitro у озимой мягкой пшеницы 270
ГЛАВА Yl. Клеточные технологии в селекционной работе с растениями
сем.Тыквенные (Cucurbitaceae) 272 - 292
6.1. Реализация морфогенного потенциала органов и тканей огурца
(Cucumis sativus L.) селекционных линий Л 42 S и Л 29 $ 272
ГЛАВА УН. Селекционные и биотехнологические методы
в создании форм озимой мягкой пшеницы и огурца,
устойчивых к фузариозу 293-399
7.1. Вредоносность заболеваний, вызываемых почвенными
Фитопатогенами 293
-
Диагностика заболеваний злаковых и тыквенных культур фузариозными корневыми гнилями 297
-
Состав и биологические свойства почвенных фитопатогенов - возбудителей болезней (корневые гнили) 300
-
Динамика заболевания отдельных структур злакового растения 302
7.2. Прямые и косвенные методы оценки устойчивости
фузариозных корневых гнилей 305
7.2.1. Использование токсинов в традиционной
селекции растений in vitro. Оценка растений
по устойчивости к токсинам 309
7.3. Генетика озимой пшеницы и селекционный метод
повышения устойчивости злаковых растений к
корневым гнилям 312
7.3.1. Маркеры устойчивости злаковых растений
к корневым гнилям 321
7.4. Биохимия взаимоотношений в системе растение - паразит 326
7.4.1. Использование токсинов патогенов в селекции in vitro
овощных и злаковых растении на устойчивость к
грибным патогенам 326
7.5. Биотехнологические методы в создании форм овощных
и злаковых растений, устойчивых к корневым гнилям 341
7.6. Селекция огурца in vitro на устойчивость к культуральным
фильтратам (КФ) гриба Fusarium sp. 347
7.7. Использование чистого токсина Т-2 из Fusarium sp. («Serva»)
в программах ускоренного создания форм огурца и
озимой пшеницы, устойчивых к фузариозу: 355-377
-
Огурец 355
-
Озимая пшеница 363
7.8. Использование культуры пыльников и токсинов патогенов
в работе по созданию форм огурца, устойчивых к
грибным болезням 378
7.8.1. Микроспорогенез огурца в создании форм,
устойчивых к фузариозу 380
7.9. Оценка устойчивости регенерантов в условиях
подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ (озимая пшеница)
и ГУСХП «Высоковский» Костромского р-на Костромской
обл. (огурец) и получение семян R1 поколения 388
7.10. Оценка устойчивости растений огурца, полученных
от семян R1 поколения в условиях инфекционного фона
зимней теплицы и получение семян R2 поколения 390
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 399 - 413
ВЫВОДЫ 414-416
Список цитированной литературы 417 - 470
Приложение 471
«Особенностью селекции как науки является именно комплексный подход к растению с привлечением разных методов исследования». (Н.И.Вавилов, изб.Соч.,1966, С.174).
Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Основной целью селекционных программ является повышение урожайности сельскохозяйственных культур, создание новых сортов и гибридов, обладающих улучшенными качествами продукта, комплексной устойчивостью к болезням, вредителям и стрессовым факторам среды, менее требовательных к условиям возделывания соответствующих регионов страны.
Важнейшей задачей селекции по-прежнему остается сокращение сроков создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Создание их традиционными методами требует длительного времени и значительно больших затрат. Так, для получения одного районированного сорта озимой пшеницы, селекционеру Д.Л.Рудзинскому пришлось проработать сотни гибридных комбинаций и изучить десятки тысяч селекционных номеров, на что потребовалось 10 лет работы (Б.И.Сандухадзе, М.И.Рыбакова, З.А.Морозова,2003). Современные уровень и темпы развития сельскохозяйственного производства диктуют поиск новых путей не только в селекции, но и в первичном и промышленном семеноводстве, семеноводстве.
По-мнению Борланга (Borlang,2000), в 21 веке в обеспечении продуктами питания растущего быстрыми темпами населения Земли, решающая роль будет принадлежать современным усовершенствованным биотехнологическим методам, включающим клеточную и генетическую инженерию, и методологиям создания новых форм и сортов важных сельскохозяйственных растений, в том числе основной зерновой культуры - пшеницы. Внедрение новых клеточных технологий в сочетании с методами классической генетики и селекции открывает большие перспективы как для практического использования, так и для решения фундаментальных проблем генетики, биотехнологии, физиологии и биохимии злаковых растений.
Современная биотехнология оказывает существенное влияние на развитие АПК страны. В селекции и растениеводстве основные исследования биртехнологов направлены на создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим или абиотическим факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Эпифитотийный характер распространения наиболее опасных грибных,. вирусных и бактериальных заболеваний сельскохозяйственных растений, уничтожающих до 30% урожая, создали в стране ситуацию, при которой потребность в обновлении сортовых ресурсов сельскохозяйственных культур на основе новых методов биотехнологии, включая гаплоидию и трансгеноз стала исключительно острой. Посевы зерновых на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются корневыми гнилями, ржавчинами, склеротинией. Поражение посевов озимой пшеницы на Северном Кавказе фузариозом колоса приводит к накоплению в зерне опасных для здоровья людей микотоксинов. В отдельные годы фузариозом поражается до половины собранного урожая зерна. Огурцы и томаты повсеместно поражаются фитофторозом, что резко снижает урожай этих ценных продовольственных культур и приводит к большим потерям при их хранении. Корневые гнили и переноспороз почти ежегодно уничтожают на больших площадях посевы огурцов и лука./Частые обширные и жесточайшие засухи, особенно в Поволжье, на Урале, в Сибири и других регионах страны вызывают повреждения и гибель посевов зерновых культур, резко снижают валовые сборы зерна и продукции растениеводства. Низкие температуры и различные неблагоприятные факторы перезимовки приводят к изреживанию и гибели посевов озимых зерновых на больших площадях, достигающих 50% и более. Недобор урожая имеет место на кислых и засоленных почвах, площади которых составляют соответственно 68,9 и 16,3 млн. га сельскохозяйственных угодий. Значительная часть земель в западном и центральном регионах России загрязнена радионуклидами и другими ядовитыми соединениями. Важнейшей задачей генетиков, биотехнологов и селекционеров была и остается идентификация эффективности генов, детерминирующих важнейшие признаки устойчивости растений к стрессовым факторам среды. В ведущих биотехнологических центрах мира ведутся работы по созданию новых форм сельскохозяйственных растений методами генетической трансформации (Альферманн, 1997).
Большой теоретический и практический интерес для селекции представляет, в частности, использование гаплоидии. Применение гаплоидов в селекции позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сократить время для создания сортов. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для получения гаплоидов методами биотехнологии в культуре in vitro злаковых применяют: метод селективной элиминации хромосом в гибридном зародыше с последующей эмбриокультурой (В.Н. Чистякова,2000), культивирование изолированных пыльников и микроспор (Б.Б. Анапияев,2001), где растения образуются двумя путями - путем эмбриоидогенеза в пыльцевых зернах и через образование каллуса из клеток пыльника; культивирование неоплодотворенных завязей и семяпочек (В.Н. Чистякова, Э.Д. Неттевич, Г.В. Гуляев, 1994). Диплоидизация гаплоидов, получаемых на основе F1, сокращает сроки создания гомозиготных линий до 1-2 лет (В.Н. Чистякова, 2000). Быстрое создание гомозигот, обладающих комплексной устойчивостью к корневым гнилям и септориозу, позволяет опережать формообразовательный процесс в популяциях этих патогенов.
Гаплоиды представляют собой наиболее подходящий материал для всех клеточных и генных манипуляций, в том числе и для клеточного мутагенеза (Хинковски Ц.,Стоянова И., 1990). Мутации, возникающие на уровне гаплоидов, быстродоступны для отбора и диагностики (Лобанок и соавт., 1988). Это связано с тем, что в диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах, при этом проявляется действие только доминантного гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков. Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения. Гаплоиды также могут возникать спонтанно. Удвоенные гаплоиды могут успешно использоваться при отборе мутантов и из клеточных культур (Chaleff R.S.,1983). Исключительная эффективность мутагенеза на гаплоидном уровне определена тем, что диплоидным клеткам необходима двойная мутация в одном и том же локусе с последующим удвоением хромосом. Отборами мутантных клеток из культуры гаплоидных в селективных условиях и далее на инфекционно-провокационном фоне с патогеном фузариума, созданы высокоустойчивые к фузариозному увяданию линии удвоенных гаплоидов льна на базе слабоустойчивых за 1-2 поколения (Поляков А.В.,2002). Таким путем получены также формы риса, рапса, ячменя, устойчивые к грибным патогенам. Однако, большинство мутационных экспериментов проводится только в культуре диплоидных соматических клеток. Это объясняется тем, что в настоящее время лишь у некоторых видов с/х культур из гаплоидных мутационных клеток удалось регенерировать целые растения, хотя устойчивые к биотическим факторам среды мутантные клеточные линии из каллусных суспензионных культур и протопластов получены.
Существуют положительные примеры использования гаплоидов и в биохимической селекции. Так, применение в качестве селективного агента аминокислотных аналогов позволило улучшить состав белков риса (Schaffer G.W.,1982), а культивируя пыльники ячменя на средах с высокими концентрациями солей, удалось получить солеустойчивые растения (Ye J.M.,Kao K.N.,1987). В культуре клеток получены мутанты с повышенным синтезом аминокислот. Так, отобраны штаммы клеток моркови и табака, синтезирующие в 20-30 раз больше свободного триптофана по-сравнению с родительскими формами. Этим способом получен целый ряд клеточных линий картофеля, моркови, риса, способных к сверхсинтезу лизина, метионина, пролина, фенилаланина и глицина. Использование гаплоидов в биохимической селекции представляет реальный путь создания растений с повышенным содержанием особенно незаменимых аминокислот (Долгих Ю.И.,ШаминаЗ.Б.,1991).
Однако, главным преимуществом удвоенных гаплоидов является быстрое достижение гомозиготных линий, что особенно важно при работе с озимыми, двулетними и многолетними культурами. Наиболее интересен в этой связи метод культивирования изолированных пыльников и микроспор. Используя пыльники F1- растений для получения удвоенных гаплоидов, можно на ранних этапах селекционного процесса отбирать в относительно небольших популяциях рекомбинантные генотипы, несущие желаемые признаки, в том числе устойчивые к болезням. На основе дигаплоидов, полученных методом культуры пыльников, в Китае создана серия новых сортов яровой пшеницы и риса, а во Франции зарегистрирован новый сорт пшеницы Florin (De Buyser Y,Henry Y. et al.,1987, табл.1). Проблеме получения гаплоидов зерновых злаков посвящено множество экспериментальных работ, обзорных статей и монографий (Бутенко Р.Г.,1975; Хохлов и др.,1976; Суханов,1983; Дьячук,
Дьячук,1989; Picard et al.,1990). Однако, несмотря на перспективы метода культуры пыльников, использование его на многих культурах все еще достаточно ограничено. Это связано с тем, что до настоящего времени не разработана эффективная система получения гаплоидов при культивировании пыльников различных генотипов зерновых культур (Foroughi-Wehr,1979; Heberle-Bors, 1998), не решены проблемы регенерации, альбинизма и другие.
Таблица 1
Сорта зерновых культур, созданные на основе гаплоидии (Цит. по: Дьячук Т.И., 2003)
Метод изолированных пыльников и микроспор основан на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна - гаметофита высших растений и предложен Гуха и Махешвари (Guha,Maheshvari) в 1964 году. Это уникальное явление связано с переключением генетической программы развития спорогенных клеток с обычного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития. Смены поколений (спорофитного на гаметофитное), характерной для растений in vitro, здесь не происходит, а производные спорогенных клеток - микроспоры и пыльцевые зерна ведут себя подобно зиготам (Батыгина,1978-1992; Горбунова и др.,1993). Поэтому, по мнению Суханова (1983), андрогенез in vitro рассматривается как особая система размножения растений, позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные растения-регенеранты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолированных пыльников.
Культивирование изолированных пыльников основано на использовании явления прямого, и непрямого андрогенеза in vitro (Vasil,Nitsch,1975; Sangwan, Sangwan-Norrel,1987). При прямом андрогенезе in vitro образование гаплоидного растения происходит за счет микроспор или клеток пыльцевого зерна, развивающихся в эмбриоиды. Прямой андрогенез in vitro связан с явлением эмбриоидогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina,1990). В свою очередь, эмбриоидогенез рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Batygina, 1984,1986; Kudarov et al.,1990).
При непрямом андрогенезе in vitro микроспоры или клетки пыльцевого зерна образуют недифференцированный каллус, который после переноса на среду, индуцирующую органогенез, дает начало растениям-регенерантам различной степени плоидности. Непрямой андрогенез in vitro связан с явлением гемморизогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina,1990), в то же время, гемморизогенез (органогенез) рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Kudarov et al.,1990). Необходимо отметить, что прямой эмбриоидогенез является наиболее выгодным способом получения гаплоидов in vitro (Суханов, 1983; Шамров и др., 1988; Горбунова и др.,1988; Батыгина и др.,1992), поскольку он не связан со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус, требующим трудоемкой процедуры неоднократного пассирования.
В современной мировой научной литературе уделяется достаточно внимания гаплоидной биотехнологии, однако остается множество проблем, препятствующих широкому внедрению гаплоидии в селекционную практику. Это, в первую очередь, связано с тем, что все еще слабо изучены как теоретические, так и практические вопросы экспериментальной гаплоидии. Не разработаны высокоэффективные технологии массового получения гаплоидных растений злаков. Основная причина этого - методические и технические трудности, связанные с исследованием и использованием андрогенеза in vitro у представителя именно этого семейства - пшеницы. Предлагаемые в литературе прописи культивируемых сред на практике часто не воспроизводимы, нет четких биотехнологических регламентов массового получения гаплоидов в культуре in vitro, нет рекомендаций применительно к условиям культивирования эксплантов - пыльников и микроспор, не указаны факторы, отвечающие за выход зеленых растений-регенерантов пшеницы. Отсюда, одна из принципиальных проблем, стоящая перед исследователями на сегодняшний день - это низкая продуктивность андрогенеза in vitro у пшеницы. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных (Sanderland,1977; Heberle-Bors,1983). Традиционные методы изучения фитогормонов не позволяют решать эти проблемы, поэтому исследователям не доступны для изучения процессы фитогормональной регуляции андрогенеза и ризогенеза in vitro.
Имеющиеся публикации о цитологических особенностях разных этапов андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы достаточно разрознены (Размологов и соавт.,1979; Shumann et al.,1986; Kruger et al.,1988; Barnabas et al.,1988;Higuchi,1991).
Аналогичные вопросы андрогенеза in vitro по озимой пшенице в литературе не рассматривались. Нет единого подхода к унификации процесса культивирования изолированных пыльников мягкой пшеницы, что приводит к невозможности сравнения экспериментальных данных, полученных разными авторами, успешно работающими в данной области (Дьячук Т.И.,2003; Приходько,1988; Barnabas et al.,1989; Foroughi-Wehr, et al.,1990; Loschenberger et al.,1992; Shimada et al.,1993; Henry et al.,1993; Горбунова, 1993; Першина и соавт.,1993; Datta,Wenzel,1986; Reynolds, 1993; Touraev,Indrianto,Wratschko et al.,1996). He решена и ключевая проблема андрогенеза in vitro - механизм переключения генетической программы развития микроспор/клеток пыльцевого зерна с гаметофитного пути развития на спорофитный путь. Не исследованы вопросы о предпосылках этого явления в условиях in vivo, начальных этапах дифференциации микроспор на путь эмбриоидогенеза или каллусогенеза, об эндогенных факторах, предопределяющих выбор различных путей морфогенеза.
Поэтому можно предположить, что исследование молекулярно-генетических особенностей ответной реакции экспланта на условия культивирования и баланса эндо- и экзогенных фитогормонов как в момент инокуляции экспланта на питательные среды, так и в процессе культивирования, являются решающими и для понимания дифференциальных путей морфогенеза. Изучение этих вопросов может иметь принципиальное значение в решении фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.
Из семейства Мятликовых (Роасеае) в структуре зерновых площадей России наиболее.распространена пшеница (Triticum.L.). Из сем. Тыквенных (Cucurbitaceae) - огурец. Посевы огурца и зерновых культур на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются грибными болезнями. Среди них наиболее вредоносными являются фузариозные корневые гнили, септориоз и склеротиния, на огромных площадях поражающие посевы зерновых культур, в том числе озимой пшеницы, и наносящие ущерб на сумму около 5 млрд. долларов (Сидоров А.А.,2001).
Несмотря на определенные успехи, имеющиеся в селекции озимой пшеницы на устойчивость к болезням, до сих пор не удалось вывести сортов или гибридов этой культуры, высокоустойчивых к фузариозным корневым гнилям. Использование генетических исследований и нетрадиционных методов селекции могут обеспечить решение этой задачи (Chepra,1996).
Обзор нерешенных методологических проблем по вопросу культивирования пыльников и микроспор яровой мягкой пшеницы in vitro четко определил для нас границы изучения проблемы андрогенеза in vitro в селекции озимой пшеницы, имеющей огромное народнохозяйственное значение в Центральном Нечерноземье. Разработку гаплоидной биотехнологии и ее применение в селекции озимой пшеницы на устойчивость к грибным болезням предполагалось начать с отработки простой и надежной методики культивирования пыльников и микроспор для массового получения, идентификации и диплоидизации гаплоидных растений с использованием андрогенеза in vitro, создания рецепта универсальной среды, способной направлять развитие микро- и макроспор по пути каллусо- или эмбриоидогенеза, изучения цитофизиологических закономерностей андрогенеза in vitro и создания сортов, устойчивых к фитопатогенам.
Цель и задачи исследований. Цель наших исследований заключалась в обобщении теоретических и разработке прикладных аспектов применения гаплоидной биотехнологии на основе метода культивирования пыльников и микроспор, изучения особенностей андрогенеза in vitro сортов озимой пшеницы селекции НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка, Московская область), обладающих повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.
Работа с огурцом предполагала разработку и применение меристемной, каллусной и микроспорогенной биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений, отобранных на фильтратах культуральной жидкости (КФ) гриба Fusarium sp. и токсине Т-2 из Fusarium sp.
В процессе реализации поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:
Разработать биотехнологию получения андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы.
Изучить возможности морфогенеза в культуре эмбриоидов и каллусных тканей мягкой пшеницы с озимым типом развития на основе собственных разработок.
Оценить влияние внутренних и внешних факторов, способствующих повышению уровня выхода гаплопродукции в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы.
Изучить взаимовлияние органических добавок и ацетона в составе жидких и агаризованных питательных сред на выход гаплопродукции в процессе андрогенеза in vitro озимой пшеницы.
Выявить факторы, положительно влияющие на гаплопродукцию озимой пшеницы и определить лимитирующие, затрудняющие процесс выхода зеленых регенерантов в культуре изолированных пыльников и микроспор. > Провести цитологический мониторинг этапов андрогенеза in vitro озимой пшеницы и цитофотометрический анализ ДНК с использованием возможностей светового микроскопа «Opton-15» и цитоспектрофотометра SMP-20 «Opton». 7. Разработать гаплоидную и микроспорогенную биотехнологии получения новых форм озимой. пшеницы и огурца, отличающихся повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили. 3.. Создать линии удвоенных гаплоидов, устойчивых к фузариозным корневым гнилям с целью использования их в селекционных программах лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п.Немчиновка,
Московская обл.). 9. Получить семена от устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы и огурца путем искусственного скрещивания и оценить полученное семенное поколение на устойчивость к патогену.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов оптимизации биотехнологии получения гаплоидов озимой пшеницы для сортов высокой хозяйственной ценности.
Разработка и обоснование технологических аспектов для культуральной системы in vitro: пыльник-микроспора - на основе разработки условий стерилизации эксплантов, подбора компонентов индукционных сред, включая различные виды органических добавок.
Экспериментальное подтверждение значимости низкотемпературного стресса и ацетона для массового выхода зеленых регенерантов в . культуральной системе пыльник-микроспора.
Отработка схем селекции in vitro с использованием токсина патогена фузариозной корневой гнили для отбора каллусирующих гаплоидных структур озимой пшеницы и микроспорогенных тканей огурца.
Оценка форм озимой пшеницы и огурца, полученных в культуре in vitro, и передача их производству (лаборатория селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ, п.Немчиновка, Московская обл.; ГУСХП «Высоковский», Костромская обл.
Научная новизна
Впервые для мягкой пшеницы с озимым типом развития разработана и использована биотехнология, обеспечивающая получение гаплоидов и дигаплоидов в генетико-селекционных программах НИИСХ ЦРНЗ для ускоренного создания форм, устойчивых к фузариозным корневым гнилям. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей андрогенеза in vitro и установлены общие принципы образования гаплоидов озимой пшеницы в системе андрогенез-гиногенез. При этом изучены 30 вариантов культуральных сред, содержащих различные виды органических добавок, а также ацетона, предложена универсальная базовая среда для конвейерного отбора эмбриоидогенных структур, способных к развитию зеленых растений-регенерантов. Проведено комплексное изучение как внешних, так и внутренних факторов, влияющих на эффективность гаплопродукции озимой пшеницы в культуре пыльников и микроспор, показана относительно слабая роль низких положительных температур для эффективности андрогенеза пшеницы с озимым типом развития и положительная роль присутствия в среде ацетона. Определены пути морфогенеза и основные факторы, как ускоряющие, так и лимитирующие процесс регенерации зеленых гаплоидов в культуре in vitro. Изучено морфологическое строение каллусных и эмбриоидогенных структур в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы и выявлены новые их типы. В процессе разработки эмбриологических основ андроклинии озимой мягкой пшеницы, установлены четыре типа апертур микроспор, нехарактерных для этой культуры.
Таким образом, впервые предложена технология получения диплоидизированных гаплоидов мягкой пшеницы с озимым типом развития, позволяющая максимально сократить сроки создания чистых гомозиготных линий до 1-го года, что особенно важно для этой культуры в условиях Центрального Нечерноземья.
Предложен экспресс-метод оценки огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастанию пыльцевых трубок на средах, содержащих токсин гриба Fusarium sp.
Практическая ценность работы. Разработанные технология создания андрогенных гомозиготных линий и методы тестирования гаплоидных растений озимой пшеницы по характеристикам андрогенеза и устойчивости к грибным болезням использованы в селекционном процессе лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п. Немчиновка, Московская обл.) для создания сортов, устойчивых к корневой гнили. В Федеральный институт промышленной собственности поданы заявки на «Технологию (Способ) создания форм мягкой пшеницы с озимым типом развития методами гаплоидной биотехнологии» и «Состав индукционной среды для получения гаплоидных растений озимой мягкой пшеницы». Полученные теоретические и практические разработки по сравнительному влиянию различных органических добавок, включая ацетон, аминокислоты, крахмалы и др., активно используются при чтении лекционного курса по предмету «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» на кафедре хранения, переработки и товароведения продукции растениеводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, а также отражены в 8-ми лабораторно-практических занятиях в разделе «Клеточная биотехнология и биоинженерия» Лабораторного практикума по сельскохозяйственной биотехнологии, изданного коллективом авторов под редакцией завкафедрой с/х биотехнологии РГАУ - Московская с/х академия имени К.А. Тимирязева, академика РАСХН B.C. Шевелухи для студентов, бакалавров, магистров и аспирантов агрономических специальностей (Москва, 2004); в разделе «Микробиотехнология» Тестовых заданий по дисциплине «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» для студентов высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности 311200 (110305) - Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции.
А.с. №1720595 (СССР) на «Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.)». Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г. (1991) и методика экспресс-анализа огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастающим на токсичных средах пыльцевым трубкам применяется в селекционной работе ГУСХП «Высоковский» Костромской обл., Костромского р-на для размножения оздоровленного селекционного материала (Л 42(51 и Л 29$ ) в семеноводстве широкорайонированного для зимних теплиц гибрида F1 Грибовчанка-безвирусная.
Личный вклад соискателя Разработка программы исследований по докторской диссертации с озимой мягкой пшеницей, ее выполнение и использование в селекционном процессе НИИСХ ЦРНЗ проводились автором во время обучения в очной докторантуре на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской государственной сельскохозяйственной академии. При оформлении научных публикаций, постановке проблемы диссертации участие автора было определяющим.
Связь работы с крупными научными программами.
Диссертационная работа выполнялась в соответствии с утвержденной 24.03.2003 г. темой докторской диссертации и Программой лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (Московская область, п.Нёмчиновка) «Селекция озимой пшеницы в создании форм, устойчивых к болезням».
Автор выражает глубокую и сердечную благодарность: научному консультанту, академику РАСХН, заведующему кафедрой сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, д.б.н., профессору Виктору Степановичу Шевелухе за постоянное внимание к работе по теме диссертации; академику РАСХН, Президенту союза селекционеров России и зав. лабораторией селекции озимой пшеницы, д. с-х.наук Баграту Исменовичу Сандухадзе и ст.н.с. этой лаборатории, к.с.-х.н. Бугровой Валентине Васильевне за подбор хозяйственно-ценного селекционного материала озимой пшеницы (семена и растения-доноры) в годы исследований; доктору биологических наук Чистяковой Валентине Николаевне, к сожалению, безвременно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе в 2000 году.
Автор также благодарит коллег, которые принимали участие в обсуждении результатов экспериментов: д.б.н. Каранову Светлану Лаврентьевну (Институт физиологии растений РАН), зав.отделом биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН, д.б.н., профессора МГУ имени М.В. Ломоносова Александра Михайловича Носова; профессора Венского Университета микробиологии и генетики (Австрия), д.б.н. А.А. Тураева; научных сотрудников отделов Болезней зерновых культур и Микологии и иммунитета ВНИИ фитопатологии (п.Голицино, Московская обл.), к.б.н. Коломиец Тамару Михайловну, к.б.н.Санину А.А. и к.б.н. Койду М.А.; профессора факультета биохимии и биотехнологии
Университета им. Мартина Лютера (г.Халле, Германия) Юргена Кранца, завлабораторией биотехнологии ВНИИ риса (г.Краснодар), к.б.н. Мухину Ж.М., декана технологического факультета РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, д.б.н., профессора Новикова Николая Николаевича; профессора кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, д.с.-х.н. Пронину Наталию Борисовну; за методическую помощь при микроскопировании -руководителя центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, к.б.н Карлова Геннадия Ильича и ст.н.с. этого центра Андрееву Галину Николаевну, а также всех сотрудников кафедры с.-х. биотехнологии Университета за предоставленную возможность проведения данных исследований.
С особой теплотой и благодарностью отмечаю большое внимание и помощь, которые оказала мне в научном творчестве, особенно в выборе дальнейших научных исследований с изолированными клетками и тканями растений in vitro, мой первый научный руководитель и наставник, академик РАСХН и чл.-корреспондент РАН, д.б.н., профессор Раиса Георгиевна Бутенко, безвременно ушедшая от нас в 2004 году.
Публикации. Полученные экспериментальные данные подтверждены 32 печатными работами, из них 2 - в зарубежных изданиях, включая А.С. на изобретение и 2 заявки на единый патент РФ. Учебно-методическая литература представлена б изданиями.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературных источников по проблеме, материалы и методы исследования и 5 глав с результатами исследований и обсуждениями. Имеются также: заключение, выводы, список цитированной литературы и приложения. Объем основного текста работы составляет 470 страниц; включая 62 рисунка и 51 таблицу. Список использованной литературы включает 520 наименований, в том числе 418 на иностранных языках.
Похожие диссертации на Разработка и применение биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений озимой пшеницы (гаплоидная) и огурца (меристемная, каллусная и микроспорогенная)
