Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ - 8 -
1.1. Влияние переувлажнения почвы на растения - 8 -
1.2. Механизмы адаптации растений к анаэробному стрессу - 12 -
1.2.1. Морфолого-анатомические приспособления растений к анаэробному стрессу - 13 -
1.2.2. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и аноксии - 14 -
1.3. Гормональная регуляция при гипоксии и аноксии - 15 -
1.4. Образование активных форм кислорода при анаэробном стрессе- 17 -
1.5. Биотехнологические подходы создания устойчивых к анаэробному стрессу растений - 19
1.5.1. Клеточная селекция - 19 -
1.5.2. Генетическая инженерия - 20 -
1.6. Методы, применяемые при получении трансгенных растений пшеницы - 25 -
1.6.1. Поглощение ДНК протопластами пшеницы - 25 -
1.6.2. Электропорация - 27 -
1.6.3. Баллистическая трансформация пшеницы.;. - 29 -
1.6.4. Агробактериальная трансформация пшеницы - 32 -
1.7. Фитогормоны - 35 -
1.8. Общая характеристика цитокининов - 36 -
1.8.1. История открытия - 37 -
1.8.2. Химическая структура и функции - 38 -
1.8.3. Биосинтез цитокининов - 42 -
1.8.3.1. Прямой путь биосинтеза цитокининов - 42 -
1.8.3.2. Биосинтез цитокининов из тРНК - 45 -
1.8.4. Метаболизм цитокининов в растениях - 47 -
1.8.4.1. Конъюгация цитокининов в растении - 48 -
1.8.4.2. Разрушение цитокининов в растениях - 50 -
1.9. Получение трансгенных растений с геном ipt - 52 -
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ - 55 -
2.1. Растительный материал - 55 -
2.2. Среды для культивирования растений и растительных тканей. . - 56 -
2.3. Получение каллуса и регенерация растений пшеницы - 57 -
2.4. Характеристика вектора для трансформации - 58 -
2.5. Среды и условия для культивирования агробактерии - 58 -
2.6. Методы молекулярной биологии - 59 -
2.6.1. ПЦР-атализ ДНК трансгенных "растений - 59 -
2.6.2. Анализ транскрипции генов методом ОТ-ПЦР - 60 -
2.6.3. Гибридизация ДНК по Саузерну - 60 -
2.7. Определение содержания МДА - 61 -
2.8. Определение активности супероксиддисмутазы - 61 -
2.9. Определение активности каталазы - 62 -
2.10. Статистическая обработка результатов - 62 -
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ - 64 -
3.1. Получение трансгенных растений пшеницы - 64 -
3.1.1. Обоснование выбора экспланта для трансформации - 64 -
3.1.2. Подбор оптимальной концентрации селективного агента - 66 -
3.1.3. Освобождение от бактериальной инфекции - 69 -
3.1.4. Выбор оптимальной схемы агробактериальной трансформации.. - 69 -
3.2. Анализ трансформированных растений - 75 -
3.3. Морфологические особенности трансгенных растений - 80 -
3.4. Изучение наследования встроенных генов - 84 -
3.5. Анализ транскрипции введенных генов - 87 -
3.6. Анализ устойчивости трансгенных растений пшеницы в условиях корневого затопления
3.6.1. Создание условий корневого затопления - 90 -
3.6.2. Анализ воздействия корневого затопления на рост и развитие растений - 91 -
3.6.3. Активность антиоксидантной энзиматической системы в растениях пшеницы в условиях корневого затопления - 96 -
3.7. Изучение морфогенетического потенциала каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt - 100 -
ЗАКЛЮЧЕНИЕ - 104 -
ВЫВОДЫ - 106-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ - 107 -
- Влияние переувлажнения почвы на растения
- Среды для культивирования растений и растительных тканей.
- Обоснование выбора экспланта для трансформации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Пшеница является ведущей
продовольственной культурой в мире, в том числе и на территории Российской Федерации. Фактическая урожайность современных сортов пшеницы во многом лимитируется воздействием абиотических и биотических стрессов. Одним из распространенных абиотических стрессов на территории России является затопление полей, происходящее в весенний и осенний периоды, а также в периоды зимних оттепелей. Затопление полей ливневыми и паводковыми водами приводит к почвенной гипоксии, которая является причиной преждевременного старения растений (Dong et al., 1983), приводит к хлорозу листьев, некрозам, дефолиации (Ginkel et al., 1992), прекращению роста (Huang and Johnson, 1995) и уменьшению урожая (Musgrave, 1994, Вош, 1996).
Так в среднем в мире ежегодно подвергаются затоплению 20% площади, используемой для возделывания пшеницы (Setter, T.L., Waters, L, 2003). В результате потеря урожая на затапливаемой территории составляет от 34 до 60%, в основном, за счет уменьшения массы и количества зерна (Setter, T.L., Waters, 2003; Musgrave I., M.E., Ding N, 1998).
Известно, что за формирование устойчивости у растений к таким неблагоприятным факторам как засоление, недостаток или избыток влаги отвечает множество различных генов и регуляторных систем (Agarwal and Grover, 2006). С развитием генетической инженерии стало возможным изучение механизмов стрессового ответа путем манипуляции с единичными генами, не затрагивая другие характеристики растений. Благодаря этому можно оценить вклад конкретных признаков в формирование комплексного механизма устойчивости растений к различным стрессам окружающей среды.
В литературе имеются данные о положительном влиянии экзогенных цитокининов при затоплении растений (Бахтенко, Платонов, 1999), в связи с
чем, Zhang et al. (2003) было выдвинуто предположение, что повышение уровня эндогенных цитокининов должно улучшать выживаемость растений в условиях затопления. Создание трансгенных растений с измененным уровнем цитокининов при встраивании в растения гена ipt, кодирующего изопентенилтрансферазу - ключевого фермента синтеза цитокинина, почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, могло бы изменить устойчивость растений к почвенной гипоксии и послужить удобной моделью для изучения роли этого гормона в защитных реакциях растений на затопление.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и анализ трансгенных растений пшеницы с геном изопентенилтрансферазы {ipt).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать метод агробактериальной трансформации пшеницы.
Получить трансгенные растения пшеницы с агробактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt.
Исследовать морфологические особенности полученных растений.
Провести анализ экспрессии и наследования введенных генов.
Исследовать устойчивость полученных трансгенных растений к корневому затоплению.
Изучить морфогенетический потенциал каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt.
Научная новизна работы. Разработан новый способ агробактериальной трансформации пшеницы in planta с использованием в качестве растительного экспланта прорастающих семян. С применением данного метода были впервые получены трансгенные растения пшеницы, содержащие и экспрессирующие агробактериальный ген ipt. Впервые для пшеницы было показано влияние введенного гена ipt на устойчивость растений к воздействию корневого затопления. Изучена динамика процессов
перекисного окисления липидов у трансгенных растений пшеницы в условиях затопления. Проведено исследование морфогенетического потенциала у каллусных линий, полученных от трансгенных растений пшеницы с геном ipt.
Влияние переувлажнения почвы на растения
В период затопления вода проникает в почвенные поры и вытесняет из них воздух, приводя к нарушению свободного газообмена между атмосферой и почвой. В результате чего происходит значительное снижение содержания кислорода в почве, что приводит к развитию анаэробного стресса (гипоксии или аноксии) и нормальное дыхание корней и других подземных органов растений делается невозможным. Так в течение первых двух дней затопления растений ячменя концентрация кислорода в почве уменьшилась до 2% (Drew andSisworo, 1979).
Различные растения по-разному воспринимают условия кислородного голодания. Было показано, что такое устойчивое растение, как рис переходит к анаэробному обмену при содержании кислорода в среде 5-10%, в то время как высокочувствительная пшеница - при концентрации кислорода в среде более 10%. Полностью на анаэробный режим растения переключаются при 2%-ном содержании кислорода в среде (Atwell et al., 1985).
Чаще всего в условиях гипоксии оказываются корни и семена растений на переувлажненных почвах. Так как большинство растений умеренного климата отрицательно реагируют на затопление, это приводит к тому, что в отдельные годы происходит массовая гибель, как сельскохозяйственных культур, так и растений дикой флоры, что наносит ощутимый ущерб сельскому хозяйству. Озимые культуры и многолетние растения также страдают от корневой гипоксии зимой, когда поверхность земли покрывается ледяной коркой. При возникновении кислородной недостаточности ростовые процессы, как правило, замедляются или полностью останавливаются, при этом ответная реакция на гипоксию у корневой системы наступает мгновенно (Waters et al., 1989). Анаэробный стресс оказывает непосредственное действие на корневую систему, при этом замедляется большинство метаболических процессов в корнях, в том числе и синтез цитокининов (Dong and Yu, 1984). Происходит торможение роста длины основных корней, а также происходят морфологические изменения корневой системы: стимулируется рост боковых и придаточных корней (Гринева, 1975). Было показано, что при корневом затоплении кукурузы в первую очередь страдает главный корень, но продолжают развиваться придаточные корни, отходящие от нижней части стебля (Гринева и Брагина, 1993). В условиях затопления корни утолщаются и теряют корневые волоски (Гринева и др., 1986). Изменяется направление роста, то есть корни начинают проявлять аэротропизм. Приспособительное значение этого явления очевидно - корни растут ближе к поверхности воды, вследствие чего улучшается их снабжение кислородом. Известно, что после образования придаточных корней надземная часть растения начинает лучше расти и развиваться (Wadman-van-Schravendijk and van Andel, 1985).
Влияние переувлажнения на надземные органы растений осуществляется опосредованно через нарушение кооперативных связей с корневой системой. У большинства видов недостаток кислорода в ризосфере вызывает ингибирование ростовых процессов. В ряде работ (Гринева и др., 1986; Чиркова и Белоногова, 1991) было показано, что затопление снижало -высоту и массу растений пшеницы и кукурузы. Хотя по данным других авторов (Trought and Drew, 1980) сухая масса побегов пшеницы увеличивалась по сравнению с контролем в связи с нарушением оттока фотоассимилятов. Затопление вызывает изменения в строении тканей побегов. В первую очередь происходит разрастание базальной части стебля, что обеспечивает закладку дополнительных придаточных корней и проводящих пучков. У большинства растений, независимо от устойчивости, при затоплении возрастает общий объем газовых полостей (Armstrong et al., 1994). Наблюдаемое в условиях затопления поникание листьев, эпинастии, хлороз и опадение листьев, подавление побегообразования связано, вероятно, с нарушением регуляции транспорта и распределения веществ: гормонов, токсинов, элементов минерального питания, фотоассимилятов. Затопление резко ускоряет старение растений, что было показано у табака, томата, подсолнечника, моркови, ячменя, гороха, пшеницы, кукурузы и сои (Burrows and Carr, 1969; Drew and Sisworo, 1979; Trought and Drew, 1980; Jackson, 1983; Goicoechea et al., 1995; Van Toai et al., 2002). Причинами раннего старения могут быть недостаток микро- и макроэлементов, цитокинина, поскольку этот гормон синтезируется в кончиках корней, а также гиббереллинов, закрытие устьиц, накопление этанола и этилена, токсические концентрации фосфора и восстановленных соединений (Jackson and Kowalewska, 1983). В свою очередь, ускоренное старение ведет к преждевременному опадению листьев, цветков и плодов (Cannell et al., 1979). Затопление уменьшает фиксацию азота у бобовых растений в результате уменьшения кислородного .,, снабжения клубеньков, а также процесс нитрификации (James and Crawford, 1998).
Среды для культивирования растений и растительных тканей
Проращивание семян и культивирование проростков пшеницы осуществляли в стерильных условиях. Для этого проводили поверхностную стерилизацию зерновок, помещая их в марлевый мешочек и выдерживая в течение 30 минут в растворе коммерческого отбеливателя «Белизна» (7-9% активного хлора), после чего их 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена пшеницы проращивали на модифицированной среде Мурасиге-Скуга (Murashige and Skoog, 1962) (MCI), содержащей Vi нормы макро- и микросолей, 60 мг/л аспарагина, 10 мг/л аскорбиновой кислоты, 50 мг/л мезо-инозита, 1 мг/л глицина, 1 мг/л тиамина, 0,25 мг/л пиридоксина, 0,25 мг/л никотиновой кислоты, 15 г/л сахарозы, 7 г/л агар-агара, без добавления гормонов. Селективный отбор трансформантов и элиминацию агробактерии осуществляли культивированием проростков пшеницы на агаризованной среде МС1 с добавлением антибиотиков канамицина 50 мг/л и цефотаксима 300 мг/л.
Для совместного культивирования семян с, суспензией агробактерии использовали жидкую питательную среду МС2, содержащую макро- и микросоли по Мурасиге-Скугу (Murashige and Skoog, 1962) с добавлением 120 мг/л аспарагина, 20 мг/л аскорбиновой кислоты, 100 мг/л мезо-инозита, 2 мг/л глицина, 2 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 30 г/л сахарозы, без добавления гормонов.
Для индукции каллусогенеза из незрелых зародышей пшеницы использовали питательную среду МСЗ, содержащую макро- и микросоли МС (Murashige and Skoog, 1962), 120 мг/л аспарагина, 20 мг/л аскорбиновой кислоты, 100 мг/л мезо-инозита, 2 мг/л глицина, 2 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 30 г/л сахарозы, 7 г/л агар-агара, 2,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 10 мг/л AgNC 3. Для регенерации и укоренения растений использовали ту же среду - МСЗ, но без добавления нитрата серебра, 2,4-Д и других гормонов.
Обоснование выбора экспланта для трансформации
Выбор экспланта играет существенную роль при проведении процесса агробактериальной трансформации. В работах по получению трансгенных растений пшеницы с помощью Agrobacterium tumefaciens в настоящее время в качестве эксплантов чаще всего используют незрелые зародыши или эмбриогенный каллус (Mooney et al., 1991; Cheng et al., 1997; McCormac et al., 1998; Guang-Min and Zhongi, 1999; Mi et al., 2000; Hu et al., 2003). В обоих случаях присутствует этап культивирования тканей in vitro, что имеет ряд недостатков. Во-первых, появляется зависимость от морфогенетического потенциала культивируемых тканей. Так известно, что многие каллусные культуры обладают низкой способностью к морфогенезу. Например, регенерационная способность каллусов пшеницы, которую определяли как отношение числа каллусов, образовавших растения-регенеранты, к общему числу проанализированных каллусов, составляла в зависимости от сорта от 28 до 62% (Копертех, Бутенко, 1995), при этом не все зародыши формировали морфогенный каллус, а только 26 - 45% от общего количества зародышей (Копертех, Бутенко, 1995). Во-вторых, условия in vitro могут привести к появлению сомаклональных вариантов, в том числе и устойчивых к селективному агенту. Кроме этого, растения-регенеранты могут обладать пониженной фертильностью, жизнеспособностью, нести различные уродства (Кагр, 1995). В-третьих, при проведении трансформации с использованием агробактерии необходимо еще учитывать и то, что сама процедура агробактериальной трансформации снижает количество растений-регенерантов. Например, в работе (KJianna, Daggard, 2003) частота выхода растений-регенерантов пшеницы составляла от 7 до 24,2% (в последнем случае в среду добавляли 0,1 М спермидина) после процедуры трансформации. В данной работе процент растений-регенерантов рассчитывался как отношение числа каллусов, образовавших растения-регенеранты к общему количеству каллусов, прошедших селекцию (первичный отбор). Если за основу брать первичное количество каллусов до процедуры трансформации, то процент растений-регенерантов снизился бы до 2 - 7,2% (Khanna, Daggard, 2003). В тоже время без трансформации частота получения растений-регенерантов составляла от 24,5 до 84,7%. Следовательно, возникает серьезная проблема получения растений-регенерантов после совместного культивирования с агробактерией.
В настоящее время осуществляется поиск эксплантов, позволяющих эффективно получать трансгенные растения вне зависимости от морфогенетического потенциала культуры. В ряде статей была успешно осуществлена попытка заражения как 1-4 дневных проростков (Woolston et al., 1988; Dale et al., 1989; Marks et al., 1989), так и сухих семян пшеницы (Chen and Dale, 1992; Mahalakshmi and Khurana, 1995) дикими штаммами A. tumefaciens. Для получения трансгенных растений пшеницы Supartana et al. (2006) использовали апикальные меристемы проростков. К сожалению метод трансформации, основанный на инъекции суспензии агробактерии в апикальные меристемы проростков, из-за своей трудоемкости неприменим для массового получения трансгенных растений.
Чтобы избежать вышеприведенных трудностей, а также сократить сроки получения генетически трансформированных растений, в нашей работе в качестве экспланта для трансформации мы использовали семена.
