Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Общая характеристика основных методов генетической трансформации растений 12
1.1.1 Методы прямого переноса ДНК в клетки растений 14
1.1.2 Методы непрямого переноса ДНК в клетки растений 17
1.2 Аргобактериальная трансформация растений 18
1.2.1 Общая характеристика процесса агробактериальной трансформации растений 18
1.2.2 Функциональная организация Ті-плазмид 19
1.2.3 Процесс агробактериальной трансформации 21
1.2.4 Векторы для агробактериальной трансформации растений 25
1.2.5 Агробактериальная трансформация in vitro 26
1.2.6 Агробактериальная трансформация in planta 27
1.2.7 Факторы, влияющие на эффективность аргобактериальной трансформации 30
1.3 Практическое и фундаментальное значение генетической трансформации растений 36
1.4 Проблемы генетической трансформации растений 36
Глава 2. Материалы и методы 38
2. 1 Материалы 38
2.1.1 Использованные штаммы A. tumefaciens 38
2.1.2 Среды 40
2.1.2.1 Среды для культивирования A. tumefaciens 40
2.1.2.2 Среда для проращивания пыльцы 40
2.1.2.3 Инокуляционные среды 40
2.1.2.4 Среды для выращивания растений 41
2.1.3 Растения 41
2. 2 Методы 41
2.2.1 Агробактериальная трансформация растений 41
2.2.1.1 Приготовление суспензии бактериальных клеток 41
2.2.1.2 Обработка растений агробактериальной суспензией 42
2.2.1.3 Отбор трансформантов 43
2.2.1.4 Выделение тотальной ДНК растений 43
2.2.1.5 Выделение тотальной ДНК агробактерий 44
2.2.1.6 ПЦР-анализ 44
2.2.1.7 Электрофорез 46
2.2.1.8 Обработка данных 47
2.2.2 Определение плоидности у растений кукурузы 48
2.2.3 Выявление присутствия агробактериальной ДНК в растительном материале 48
2.2.4 Определение активности р-глюкуронидазы в листьях проростков кукурузы после трансформации 49
2.2.5 Определение экспрессии гена, в корнях проростков после трансформации 49
2.2.6 Определение содержания свободного пролина в тканях кукурузы 50
2.2.7 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro 51
Глава 3. Результаты и обсуждения 53
3.1 Влияние различных факторов на частоту агробактериальной трансформации кукурузы в условиях inplanta 53
3.1.1 Частота трансформации кукурузы в условиях inplanta при различной температуре 54
3.1.2 Зависимость частоты трансформации от способа инокуляции кукурузы A tumefaciens 66
3.1.2.1 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при различных способах нанесения суспензии агробактерий 66
3.1.2.2 Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии A. tumefaciens на пестичные нити кукурузы 69
3.1.3 Анализ растительного материала на наличие агробактериальной ДНК 74
3.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы 75
3.2.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro 75
3.2.1.1 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с генами nptll и gus-intron 78
3.2.1.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы in vitro штаммом A. tumefaciens AGL0, несущим векторную конструкцию с генами nptllKgfp 79
3.2.2 Трансформация пыльцевых зерен кукурузы в условиях inplanta 81
3.3 Трансформация женского гаметофита кукурузы в условиях inplanta 82
3.4 Определение экспрессии генов, перенесенных в составе Т-ДНК, в растениях кукурузы 85
3.4.1 Экспрессия гена nptll у растений кукурузы 85
3.4.2 Экспрессия гена gus-intron в листьях кукурузы 87
3.4.3 Экспрессия гена gfp в корнях кукурузы 88
3.4.4 Определение концентрации пролина у трансгенных растений кукурузы, несущих антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы 89
3.5 Анализ наследования встроек Т-ДНК у кукурузы 92
Заключение 94
Выводы 97
Благодарности 98
Список использованной литературы 99
- Процесс агробактериальной трансформации
- Частота трансформации кукурузы в условиях inplanta при различной температуре
- Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии A. tumefaciens на пестичные нити кукурузы
- Анализ наследования встроек Т-ДНК у кукурузы
Введение к работе
Актуальность темы
Кукуруза является одной из важнейших зерновых культур в мире, ее ежегодное производство составляет около 700 млн. т. (), в том числе в России около 3 млн. т. (). В настоящее время кукуруза используется в качестве кормовой и пищевой культуры, в промышленных целях используют материалы, полученные из кукурузного сырья. В связи с этим получение новых сортов кукурузы, обладающих необходимыми для этих целей признаками, является важной практической задачей. Одним из способов управления генетической изменчивостью организмов, используемых в селекционной практике, является генная инженерия. Получение трансгенных растений, несущих определенные признаки, при помощи методов генной инженерии - актуальное направление биотехнологии. Со временем возрастает роль трансгенных растений в производстве пищевых продуктов, медицинских и промышленных материалов (Daniell et al., 2001; Rabotyagova et al., 2009). Технология доставки функциональных генов в растительный геном в составе Т-ДНК (transfer DNA) агробактерий зарекомендовала себя как надежный способ получения трансгенных двудольных растений. Перенос Т-ДНК из Agrobacterium tumefaciens в клетки однодольных растений впервые зарегистрирован более двадцати пяти лет назад (Slogteren et al., 1984), в том числе в кукурузу в 1986 году (Graves, Goldman, 1986). Основные способы получения генетически-модифицированных растений на основе метода агробактериальной трансформации базируются на переносе Т-ДНК в культивируемые in vitro растительные клетки с последующей регенерацией трансформированных растений. Однако трансформация каллусных клеток имеет ряд ограничений и недостатков, процесс ее осуществления является трудоемким, длительным и затратным. Существенные трудности возникают при трансформации однодольных растений с низкой регенерационной способностью. Кроме того, трансформация однодольных растений с использованием A. tumefaciens происходит с меньшей эффективностью по сравнению с трансформацией двудольных. В связи с вышесказанным, особенно актуальной задачей является разработка методов трансформации однодольных растений без стадии культуры тканей. Поэтому ведется поиск нетрадиционных подходов для осуществления переноса агробактериальной Т-ДНК в однодольные растения, одним из которых может быть трансформация генеративных клеток. Половые клетки высших растений являются наиболее интересным объектом и инструментом для генетической трансформации. Их естественная способность передавать генетическую информацию следующему поколению может быть использована для внедрения фрагментов ДНК в растительный геном. Разработка способов генетической трансформации растений через генеративные клетки является актуальной задачей биотехнологии, способствующей решению, как фундаментальных проблем, так и прикладных задач генетики и селекции.
Цель диссертационной работы: изучение агробактериальной трансформации генеративных клеток кукурузы в условиях in planta.
Задачи исследования
Исследовать эффективность встраивания Т-ДНК штаммов A. tumefaciens LBA4404 и AGL0 в геном кукурузы (линии АТ-3, ЗМС, 3MCig, КМС, ЗМСП, гибриды ФГНУ РосНИИСК «Россорго») при использовании метода агробактериальной трансформации в условиях in planta.
Определить эффективность трансформации генеративных клеток кукурузы при различных условиях.
Определить клетки-мишени для агробактериальной Т-ДНК.
Осуществить перенос функциональных генов (антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы и гена экстраклеточной рибинуклеазы циннии) в геном кукурузы методом агробактериальной трансформации в условиях in planta.
Научная новизна работы
Впервые показано, что использование технологии агробактериальной трансформации в условиях in planta позволяет получать инсерции Т-ДНК в геном кукурузы всех исследованных гибридных комбинаций и с использованием штаммов агробактерий с различными генетическими конструкциями.
Впервые для кукурузы показано, что клетками-мишенями для агробактериальной Т-ДНК при трансформации в условиях in planta служат клетки женского и мужского гамето фита.
Впервые показана инсерция агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы при температуре воздуха во время инокуляции кукурузы агробактериями выше 30 С.
Научно-практическая значимость работы
В ходе работы получены доказательства инсерции в геном кукурузы Т-ДНК, несущей ген рибонуклеазы циннии и супрессор гена пролиндегидрогеназы. Показано, что инсерция Т-ДНК, несущей антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, сопровождается накоплением свободного пролина в тканях кукурузы. Полученные трансформанты могут быть использованы в дальнейшей работе по получению растений с повышенной устойчивостью к дефициту влаги и засолению.
Исследовано влияние температурного фактора на частоту агробактериальной трансформации кукурузы в условиях in planta, что позволяет предложить ряд мероприятий при проведении трансформации в условиях повышенных температур.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Обработка пестичных нитей кукурузы суспензией клеток агробактерий с активированными генами вирулентности позволяет получать трансгенные растения всех исследованных гибридных комбинаций при использовании штаммов А. tumefaciens, несущих различные генетические конструкции.
Перенос агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы в условиях in planta наблюдается в температурном диапазоне 18-35 С.
Перенос агробактериальной Т-ДНК при трансформации в условиях in planta происходит в клетки женского и мужского гаметофитов кукурузы.
Встройка антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы в геном кукурузы сопровождается достоверным увеличением содержания свободного пролина в тканях проростков кукурузы.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями
Личный вклад соискателя состоит в получении всех представленных экспериментальных данных по анализу встройки Т-ДНК в клетки женского и мужского гаметофитов кукурузы, экспрессии функциональных генов у кукурузы, а также в описании и обработке полученных данных. Опыты по инокуляции растений при трансформации кукурузы в условиях in planta, часть экспериментов по анализу экспрессии маркерных генов проведены при участии сотрудников лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН И.В. Волохиной, В.А. Беликова, что отражено в совместных публикациях. Планирование экспериментов, интерпретация экспериментальных данных, подготовка результатов к публикации проводились под руководством М.И.Чумакова
Работа выполнена в лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН в течение 2007-2010 гг. в рамках плановой темы НИР "Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки", № госрегистрации 01200606182; научный руководитель - доктор биологический наук М.И. Чумаков. Исследования поддержаны грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках Федеральной Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2 Программы), шифр «2007-2-1.2-09-01-137», по теме: «Разработка технологии переноса Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы».
Публикации
По теме диссертации опубликованы 13 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, и 11 тезисов.
Объем и структура диссертации
Процесс агробактериальной трансформации
Агробактериальная трансформация является многоступенчатым процессом и включает этапы прикрепления агробактерий к клеточной стенке или мембране растительной клетки, запуска экспрессии белков вирулентности, вырезания Т-нити, ее транспортировки через мембраны бактериальной и растительной клеток и через ядерную мембрану, встраивания в ДНК растения.
Время, необходимое для переноса Т-ДНК в цитоплазму растительной клетки, составляет от 30 минут (Yusibov et al., 1994) до нескольких часов (Sykes, Matthysse, 1986).
Агробактерий инфицируют растения в основном в местах повреждения, где клеточная стенка нарушена. Предшественники для синтеза клеточной стенки растений - фенольные соединения, такие как ацетосирингон и гидроксиацетосирингон, вызывают индукцию vzr-генов и служат хемоаттрактантами для агробактерий (Stachel et al., 1986). Раневой сок имеет пониженный рН, содержит моносахара и аминокислоты, что также способствует индукции v/r-генов, хотя и в меньшей степени, чем ацетосирингон (Stachel et al., 1985; Alt-Moerbe et al., 1989; Ankenbauer, Nester, 1990; Cangelosi et al., 1990). К тому же, при поранении становятся доступными рецепторы на поверхности мембран растительных клеток, с которыми могут контактировать агробактерии (Kahl, Schell, 1982). Способность к трансформации сохраняется в месте ранения в течение 36-96 часов (Kahl, Schell, 1982). Однако агробактерии могут инфицировать и неповрежденные активно делящиеся ткани (Birms, Thomashow, 1988; Чумаков с соавт, 2002). Интеграция Т-ДНК может зависеть от стадии клеточного цикла, в которой находятся клетки, подвергающиеся трансформации. На стадии синтеза ДНК растительные клетк і наиболее чувствительны к агробактериальной трансформации (Braun, 1978).
За способность агробактерии заражать растения определенных видов отчасти ответственны гены virC (Yanofsky et al., 1985; Yanofsky, Nester, 1986), virF (Melchers et al, 1990; Jarchow et al., 1991; Regensburguink, Hooykaas, 1993), virA (Turk et al., 1991; Rained et al., 1993).
Прикрепление агробактерии к поверхности растительной клетки является первым шагом при инфицировании и происходит в два этапа - обратимое прикрепление и заякоревание. В процессе прикрепления важными в той или иной степени поверхностными структурами агробактерии являются поверхностные и экскретируемые полисахариды, экстраклеточные белки (рикадгезин), пили, жгутики, а также рецепторы на поверхности растительных клеток (Wagner, Matthysse, 1992). Прикрепление агробактерии к растительной клетке необходимо для трансформации, но искусственно введенные в растительную клетку целые агробактерии также способны к переносу Т-ДНК (Escudero et al., 1995).
Ацетосирингон связывается с локализованным в мембране бактериальной клетки белком VirA, который синтезируется конститутивно (Stachel et al., 1986; Stachel, Zambryski, 1986; Raineri et al., 1993). Белок VirA изменяет свою конформацию, что приводит к фосфорилированию белка VirG, который запускает экспрессию всех остальных v/У-генов (Jin et al., 1990; Pazour et al., 1992; Pan et al., 1993). Хромосомный ген chvE конститутивно экспрессирует белок ChvE, который связывается с индуцирующими сахарами и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения (Huang et. al., 1990; Shimoda et al., 1990).
Белки VirDl и VirD2 функционируют в качестве эндонуклеаз, специфическими сайтами узнавания для которых служат прямые повторы, фланкирующие Т-ДНК (Albright et al., 1987; Jayaswal et al., 1987; Wang et al., 1987). Процессинг Т-нити начинается с раскручивания ДНК белком VirDl в районе правой границы Т-ДНК. VirD2 продолжает раскручивание нити и производит надрез между третьим и четвертым нуклеотидами правой границы. Регион Т-ДНК на Ті-плазмиде реплицируется до левой границы Т-ДНК, и процессинг Т-нити происходит путем ее вытеснения. Таким образом, формируется однонитевая линейная Т-нить, которая существует только в бактериальной клетке. К ее 5 -концу присоединяется белок VirD2 (Herrera-Estrella et al., 1988; Ward et al., 1988), который сопровождает Т-нить до ее встраивания в ДНК растения. Важную роль при распознавании правой границы играют белки VirCl и VirC2. Они распознают различия между правой и левой границами Т-ДНК и точно определяют правую границу как точку начала репликации (Того et al., 1988; Того et al., 1989).
11 белков VirB формируют мембраносвязанный комплекс, который принимает участие в конъюгации, сборке пилей, секреции белков, и переносе Т-ДНК. Предполагается, что одни VirB белки, связанные с мембраной, участвуют в формировании структуры, через которую Т-ДНК выходит из бактериальной клетки, а другие функционируют в качестве АТФаз (Christie, 1997), обеспечивая энергией процессы сборки каналов и экспорта молекул. Кроме белков VirB, VirE2 и VirF для переноса Т-ДНК необходим белок VirD4 (Okamoto et al., 1991; Beijersbergen et al., 1992), с которым белки VirB формируют систему секреции IV типа.
Белки VirB2 и VirB5 участвуют в формировании Т-пилей — белковых структур на поверхности бактериальной клетки (Курбанова, Чумтков, 2000), причем VirB2 является основным компонентом пилей (Jones et al., 1996; Eisenbrandt et al., 1999; Lai, Kado, 2000). Процесс переноса Т-ДНК и инфицирования растения зависит от наличия Т-пилей агробактерий (Fullner et al., 1996а; Fullner Nester, 1996b; Lai, Kado, 1998), однако роль Т-пилей в этом процессе остается не совсем ясной. Возможно, Т-пили непосредственно участвуют в переносе Т-ДНК из бактериальной клетки (Lai, Kadc, 1998), или способствуют лучшему контакту бактериальной и растительной клеток (Durrenberger et al., 1991). В работе О.В. Калаптур с соавторами (2004) последнее предположение не подтвердилось.
Vir-зависимый перенос Т-ДНК имеет гомологию с процессом конъюгации у энтеробактерий (Lessl et al., 1992; Shirasu, Kado, 1993; Lessl, Lanka, 1994).
Независимо от Т-нити, пилотируемой белком VirD2, в цитоплазму растительной клетки проникает белок VirE2 (Sundberg et al., 1996; Mysori et al., 1998), для транспорта которого необходим белок VirEl (Sundberg et al., 1996). VirE2 связывается с Т-нитью и защищает ее от воздействия растительных нуклеаз (Christie et al., 1988; Das, 1988; Citovsky et al., 1989; Citovsky et al., 1992, 1994; Volokhina et al., 2005).
Комплекс VirD2-/]HK-VirE2 называется Т-комплексом и обнаруживается только в клетке растения (Citovsky et al., 1992, 1994; Rossi et al., 1996). VirE2 содержит сигнал ядерной локализации (Citovsky et al., 1992) и возможно формирует пору в ядерной мембране (Dumas et al., 2001; Duckely, Hohn, 2003). Белок VirD2 имеет сигнал ядерной локализации и участвует в распознавании ядерной поры и транспорте Т-ДНК в ядро растительной клетки (Koulikova-Nicola et al., 1993; Citovsky et al., 1994; Pansegrau, Lanka, 1996; Tinland, 1996; Zupan et al, 1996).
Встраивание Т-ДНК в хромосому хозяина является многоступенчатым процессом. Анализ нуклеотидных последовательностей в области встраивания Т-ДНК показал некоторую гомологию между растительной ДНК по обеим сторонам от места интеграции и ДНК Ti-плазмиды в сайтах вырезания Т-ДНК (Matsumoto, 1990). Но большинство исследователей считают, что процесс интеграции Т-ДНК происходит по механизму незаконной рекомбинации,, в которой молекулы ДНК не имеют протяженных участков гомологии (Chyi et al., 1986; Gheysen et al., 1991; Mayerhofer et al., 1991; Tinland et al, 1996; Wallroth et al., 1986).
Встраивание Т-ДНК происходит преимущественно в активно транскрибируемую область генома растений (Koncz et al., 1989; Herman et al., 1990). Пилотирующий Т-ДНК белок VirD2, обладающий эндонуклеазной и топоизомеразнои активностью, производит разрыв растительной ДНК. После встраивания Т-ДНК растительные ферменты репарации достраивают нить ДНК, комплементарную однонитчатой Т-ДНК (Chyi et al., 1986; Wallroth et al., 1986; Gheysen et al., 1991; Mayerhofer et al., 1991). Т-ДНК встраивается в ДНК растений полярно, для интеграции и образования опухоли более важна правая граница (Zambrysky et al., 1982; Hepburn, White, 1985; Jen, Chilton, 1986; Wang etal., 1984, 1987).
Т-ДНК стабильна в ядерном геноме и гены, заключенные в ней, наследуются как моногенные и доминантные менделевские признаки (Tepfer, 1984; Catlin et al., 1988; James et al., 1995). В геном растительной клетки может включаться одна или более копий „Т-ДНК. В хозяйских клетках гены Т-ДНК экспрессируются с использованием ферментного аппарата хозяйской клетки (Barker et al., 1983).
Частота трансформации кукурузы в условиях inplanta при различной температуре
Температуры 19, 25, 28 С и выше были выбраны для изучения частоты переноса Т-ДНК in planta, поскольку наиболее оптимальная температура для конъюгативного переноса плазмид у агробактерий — 19 С, а температура 25 С оптимальна для экспрессии v/V-генов в присутствии ацетосиринп на (Fullner, Nester, 19966). При температуре 30 С конъюгативный перенос плазмид A. tumefaciens заблокирован (Tempe et al., 1977). Температура выше 28 С критична для начальных этапов трансформации: процесса экспрессии генов вирулентности и сборки белков вирулентности (Alt-Moerbe et al., 1988; Turk et al., 1991; Jin et al., 1993; Lai, Kado, 1998). Повышение температуры до 31 С приводит к полной блокировке трансформации проростков табака A. tumefaciens в лабораторных условиях (Чумаков с соав., 2002). Однако агробактериальная трансформацию клеток HeLa происходила при температуре культивирования человеческих клеток - 37 С (Kunik et al., 2001). В работе С. Гуреля с соавторами (Gurel et al., 2009) показано, что нагревание незрелых зародышей сорго до 43 С перед инокуляцией агробактериями приводило к увеличению частоты трансформации.
Эффективность трансформации кукурузы штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с геном nptll и антисмысловым супрессором гена пролиндегидрогеназы. Опыты проводили при температуре 28-29 С, 30-31 С и 33-35 С в 2008 и 2009 гг. В 2008 году обработку растений проводили при температуре 28-29 С и 30-31 С, использовали линии кукурузы АТ-3 (материнские растения) и ЗМСП (отцовские растения). В опытах, проводимых при 28-29 С были получены 16 початков, которые содержали от 30 до 200 зерен, при 30-31 С были получены 15 початков с количеством зерен от 20 до 200. Обработку растений при 33-35 С проводили в 2009 году, использовали гибриды кукурузы первого поколения, любезно предоставленные В.А. Жужукиным (ФГНУ РосНИИСК «Россорго»). В экспериментах было получено 7 початков, содержащих от 3 до 200 зерен. Зеленые проростки, выросшие из зерен, собранных с обработанных A. tumefaciens растений, были проанализированы с использованием метода ПЦР на наличие АПГП (рис. 3.1).
Процент ПЦР-позитивных проростков среди использованных в опыте семян при обработке растений агробактериями штамма LBA4404 (векторная конструкция с геном прШ и АПГП) варьировал при различной температуре от 0,3 % при температуре 30-31 С до 1,4 % при 28-29 С (табл. 3.1). Разница между частотами трансформации в этих опытах достоверна при оценке достоверности с помощью коэффициента Стыодента (р = 0,05) и с помощью критерия Фишера (р 0,01) (табл. 3.1). Таким образом, можно отметить достоверное снижение частоты трансформации при повышении температуры с 28-29 до 30-31 С. Трансформанты с использованием данного агробактериального штамма LBA4404 в 2009 году получены не были (табл. 3.1).
Эффективность трансформации кукурузы штаммом A. tumefaciens AGLO, несущим векторную конструкцию с генами nptll и gfp. В опытах с использованием штамма A. tumefaciens AGLO обработку растений производили в 2007 г. при температурах 24-27 С и в 2009 г. при 33-35 С. При 24-27 С обрабатывали материнские растения кукурузы линий АТ-3 и КМС, которые опыляли линиями ЗМСП и ЗМС соответственно. Было получено 9 початков гибридов линий КМС и ЗМС, содержащих от 3 до 16 зерен, и 8 початков гибридов линий АТ-3 и ЗМСП, содержащих 5-20 зерен. Полученные зерна проращивали на среде с канамицином, отобранные зеленые растения анализировали с использованием метода ПЦР на наличие маркерного гена nptll (рис. 3.2).
Эффективность трансформации кукурузы (процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен) агробактериальным штаммом AGL0, несущим векторную конструкцию с генами nptll и gfp, при 24-27 С в 2007 г. составила 12,7 % среди гибридов линий КМС (материнская) и ЗМС (отцовская) и 15,5 % среди гибридов АТ-3 (материнская) и ЗМСП (отцовская) (табл. 3.2). Разница в эффективности трансформации между различными гибридными комбинациями кукурузы была ст ітистически недостоверной при использовании коэффициента Стьюдента (р 0,05), но использование критерия Фишера показало достоверную разницу (р 0,05) (табл. 3.2).
В 2009 году при температуре 33-35 С проводили обработку растений штаммом агробактерий AGL0 с маркерным геном gfp и использовали гибриды кукурузы, любезно предоставленные ФГНУ РосНИИСК «Россорго». Было получено 11 початков с количеством зерен 1-150 шт. Эффективность трансформации (процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте семян) при данной температуре составила 0,4 % (табл. 3.3).
Статистический анализ показал достоверность разницы между эффективностью трансформации в опытах, проведенных с использованием штамма агробактерий AGL0 в 2007 году при температуре 24-27 С (табл. 3.2) и эффективностью трансформации в опытах с использованием данного штамма в 2009 году при 33-35 С (табл. 3.3) (р 0,01).
Эффективность трансформации кукурузы штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с маркерными генами nptll и gus-intron. Опыты с использованием штамма A. tumefaciens LBA4404 проводили в 2007 г. при температуре 24-27 С и в 2009 г. при 33-35 С.
В опытах, проводимых в 2007 году, использовали линии кукурузы КМС (материнская) и ЗМС (отцовская). Было получено 4 початка с количеством зерен 6-12 шт. Эффективность трансформации (процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерновок) составила 16,1% (табл.3.4).
В 2009 году использовали гибриды кукурузы ФГНУ РосНИИСК «Россорго». Было получено 4 початка, которые содержали 6-52 зерна. Эффективность трансформации составла 4,8 %.
Зеленые проростки, выросшие из зерен, собранных с обработанных A. tumefaciens растений, были проанализированы с использованием метода ПЦР на наличие гена gus-intron (рис. 3.3).
Статистический анализ показал достоверность разницы между эффективностями трансформации в опытах с использованием штамма LBA4404, проведенных в 2007 г. при температуре 24-27, и 2009 г. при 33-35 С (табл. 3.4) (р = 0,05).
Эффективность трансформации кукурузы штаммом A. tumefaciens LBA4404, несущим векторную конструкцию с геном ZRNase II и nptll.
Опыты с использованием штамма A. tumefaciens AGL0 с вектором pBiRNS проводили при температуре 32-33 С и 18-20 С в 2008 году.
При температуре 32-33 С обрабатывали линии кукурузы АТ-3 и 3MCig (материнские растения), которые опыляли пыльцой линий ЗМСП и КМС соответственно. В опытах, проводимых при 32-33 С, были получены 7 початков гибридов линий АТ-3 и ЗМСП, которые содержали от 10 до 246 зерен и 20 початков гибридов линий 3MCig и КМС, которые содержали от 15 до 150 зерен. Зеленые проростки, выросшие на среде с канамицином из зерен, собранных с обработанных A. tumefaciens растений, были проанализированы с использованием метода ПЦР на наличие гена ZRNase II (рис. 3.4).
Частота встройки Т-ДНК в геном кукурузы при разных вариантах нанесения пыльцы и суспензии A. tumefaciens на пестичные нити кукурузы
При трансформации кукурузы с использованием суспензии агробактерий, возможно, значительную роль играет взаимодействие бактериальной суспензии и пыльцевых зерен. Для улучшения адсорбции агробактериальны: клеток на поверхности пыльцевых зерен, собранную пыльцу предварительно инкубировали с бактериальной суспензией. В качестве сравнительных опытов пыльцу и агробактериальную суспензию наносили отдельно или одновременно без проведения предварительной совместной инкубации.
Первую серию опытов проводили с использованием агробактериального штамма LBA4404 с векторной конструкцией, несущей гены nptll и gus-intron. Растения обрабатывали в один день. Пыльцу собирали с метелок и инкубировали с суспензией агробактерий с активированными ацетосирингоном генами в течение 40 минут при температуре 19-22 С. Бактерии ресуспендировали в среде №1 с 5 % сахарозой (Clough, Bent, 1998), что обеспечивало оптимальное осмотическое давление для прорастающих пыльцевых зерен (Пухальский, 2007). 100 мкл суспензии клеток агробактерий с пыльцой наносили на обрезанные пестичные нити, початки изолировали пергаментными пакетами. В альтернативном методе суспензию агробактерий наносили одновременно с пыльцой без проведения предварительной инкубации. При этом температура, при которой производили обработку растений, в обоих случаях составляла 33-35 С. Результаты опытов показали статистически незначимое (р 0,05) изменение частоты трансформации при проведении предварительной инкубации пыльцы и агробактериальной суспензии при температуре 19-22 С (табл. 3.7).
Во второй серии опытов использовали штамм AGL0 с вектором, несущим гены nptllKgfp. Суспензию клеток агробактерий и пыльцы (100) мкл наносили на обрезанные пестичные нити после совместной инкубации при температуре 19-22 С. В альтернативных способах обработки агробактериальную суспензию (100 мкл) наносили на обрезанные пестичные нити до (за 30 мин.) или после (через 30 мин.) нанесения пыльцы. Данные опытов приведены в таблице 3.8.
При проведении предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактерий 1,8% ПЦР-позитивных проростков было обнаружено среди использованных в опыте семян (табл. 3.8). При раздельном нанесении на пестичные нити кукурузы пыльцы и агробактерий наблюдалась уменьшение эффективности трансформации — 0,6% при нанесении пыльцы за 30 минут до обработки агробактериями и 0,2 % при нанесении агробактериальной суспензии за 30 мин. до пыльцы (табл. 3.8), что подтверждается статистическими данными с использованием критерия Фишера (р 0,01) и коэффициента Стьюдента (р = 0,05) (табл. 3.8). Однако очередность нанесения агробактерий и пыльцы оказалась фактором, не влияющим частоту трансформации.
В дальнейшем была изучена зависимость частоты встройки Т-ДНК от температуры предварительной инкубации пыльцевых зерен и агробактериальной суспензии. Инкубацию пыльцы с суспензией клеток агробактерий штамма AGL0 (в составе Т-ДНК маркерные гены gfp и nptll) осуществляли, как описано ранее. В одной серии опытов инкубацию проводили при температуре обработки растений 33-35 С, в другой — при температуре 19-22 С. В обоих случаях наносили суспензию агробактерий и пыльцу при температуре 33-35 С. Данные опытов приведены в таблице 3.9. Результаты опытов показали увеличение частоты трансформации при уменьшении температуры предварительной инкубации пыльцы с суспензией агробактерий до 19-22 С при проведении статистического анализа с использованием критерия Фишера (табл. 3.9).
Таким образом, способ нанесения агробактериальной суспензии — при помощи аэрозольного распылителя или пипетки, не оказывает существенного влияния на эффективность трансформации, однако, завязываемость семян в опытах с использованием аэрозоля была выше (табл. 3.6), что необходимо учитывать при использовании метода трансформации in planta для получения початков с лучшей озерненностыо. При проведении предварительной совместной инкубации пыльцы с суспензией клеток агробактерий при 19-22 С наблюдалась тенденция к увеличению частоты трансформации по сравнению с опытами, где предварительная инкубация не проводилась. В случае использования- штамма AGL0 (векторная конструкция с генами gfp и nptll) разница в эффективности трансформации в опытах с проведением предварительной инкубации и в опытах, где пыльца и агробактерий наносились по отдельности, была подтверждена статистическим анализом (табл. 3.8). Но при одновременном нанесении агробактерий штамма LBA4404 (векторная конструкция с генами gus-intron и nptll) и пыльцы эффективность трансформации достоверно не отличалась от эффективности трансформации в опытах с проведением предварительной инкубации суспензии клеток агробактерий и пыльцы (табл. 3.7).
Поэтому можно заметить, что одновременное нанесение пыльцы и агробактериальной суспензии на пестичные нити кукурузы или нанесение после проведения предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактериальных клеток предпочтительнее, чем нанесение по отдельности. Кроме того, проведение предварительной совместной инкубации пыльцы и агробактерий при пониженной температуре (19-22 С) способствует достижению большей эффективности трансформации, что особенно актуально в условиях температуры обработки растений выше 28 С.
Таким образом, эффективность трансформации, рассчитанная как процент ПЦР-позитивных проростков от числа использованных в опыте зерен, составила от 0,2 (табл. 3.8) до 16,1% (табл. 3.4) в зависимости от температурных условий, порядка обработки растений, использованных штаммов A.tumefaciens и линий кукурузы.
Анализ наследования встроек Т-ДНК у кукурузы
Трансгенные растения поколения F0, полученные из зерен после трансформации in planta материнских растений, были доведены до взрослого состояния в лабораторных условиях. После самоопыления от растений F0 были получены зерна, которые проращивали на среде с канамицином. Зеленые и белые растения поколения F! анализировали методов ГЩР на наличие гена nptll. Было получено 3 початка (№1, №2, №3), с числом зерен 7, 7 и 15 соответственно. Необходимо заметить, что из-за разновременности появления мужских и женских цветков и сильной зависимости цветения у кукурузы от времени года, в лабораторных условиях произвести самоопыление растений в большинстве случаев было невозможно, а завязавшиеся зерна отличались маленьким размером, плохо выполненным эндоспермом и давали проростки, отстающие в росте и развитии. Этим фактом объясняется небольшая выборка початков с зернами поколения F]. В таблице 3.13 приведены данные анализа проростков трех початков, полученных от гибридов линий кукурузы ЗМС и КМС в результате самоопыления. Материнские растения в случае початков №1 и №2 обрабатывали штаммом A. tumefaciens AGL0 с геном gfp, в случае початка №3 - LBA4404 с геном giis-intron.
ПЦР-анализ белых проростков не подтвердил присутствия маркерного гена nptll в их геноме. Наличие гена nptll в поколении гибридов Fi говорит о наследовании приобретенного в результате агробактериальной трансформации гена в процессе полового размножения.
В рамках диссертационной работы было проведено исследование факторов, влияющих на эффективность трансформации генеративных клеток кукурузы в условиях in planta.
Значимым фактором, влияющим на процесс агробактериальной трансформации, является температура. Полученные экспериментальные данные показали, что перенос агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы наблюдается в исследованном диапазоне температур 18-35 С с частотой от 0,2 до 16,1%. При температуре выше 28 С наблюдается статистически достоверное уменьшение частоты трансформации на початок.
Одним из преимуществ метода трансформации генеративных клеток перед традиционными методами агробактериальной трансформации клеток вегетативных органов является возможность использования любых сортов трансформируемой культуры. Полученные данные показали, что встройка агробактериальной Т-ДНК в геном кукурузы происходит при использовании различных гибридных комбинаций, что подтверждает проведенный ПЦР-анализ на маркерные (nptll, gus-intron) или целевые гены (супрессор гена пролиндегидрогеназы и ген рибонуклеазы циннии). Показана экспрессия перенесенных генов (gfp, nptll, gus-intron, супрессор гена пролиндегидрогеназы) в гибридах кукурузы использованных линий.
Результаты исследований показали, что штамм агробактерий и линии кукурузы также являются факторами, влияющими на эффективность трансформации кукурузы в условиях in planta.
С целью оптимизации метода трансформации была изучена эффективность трансформации при различных способах нанесения пыльцы и суспензии клеток агробактерий. Было показано, что нанесение бактериальной суспензии при помощи пипетки или аэрозоля не оказывало влияния на эффективность трансформации, однако, завязываемость зерен при использовании аэрозольного метода была выше. Поэтому аэрозольный метод нанесения можно использовать для получения початков с большим количеством зерен. Проведение предварительной инкубации пыльцевых зерен с суспензией клеток различных штаммов агробактерий в среде с сахарозой, а также одновременное нанесение пыльцы и агробактериальной суспензии на пестичные нити кукурузы, способствовало увеличению эффективности трансформации. Отдельное нанесение пыльцы и агробактерий на пестичные нити оказалось менее предпочтительным способом трансформации кукурузы. Кроме того, проведение предварительной инкубации пыльцы и клеток агробактерий при пониженной температуре приводило к увеличению трансформации, что может быть использовано при проведении трансформации в условиях in planta при температуре окружающей среды выше 28 С.
При проведении трансформации в условиях in planta во время цветения, не вполне ясен вопрос, какие именно клетки являются мишенями для Т-ДНК. При проведении обработки пыльцы кукурузы суспензией клеток агробактерий in vitro показано, что Т-ДНК может проникать в прорастающее пыльцевое зерно и встраиваться в геном одного из ядер мужского гаметофіта. Данный факт подтверждает возможность участия мужского гаметофита при трансформации in planta. Встройка Т-ДНК в геном матроклинных гаплоидных растений показывает возможность проникновения Т-ДНК в зародышевый мешок (женский гаметофит) посредством прорастающей пыльцевой трубки. При этом трансформация спермиев не обязательна. Таким образом; трансформация кукурузы в условиях in planta происходит посредством мужского гаметофита, а клетками — мишенями могут быть и спермий, и яйцеклетка.
При использовании метода трансформации кукурузы in plar ta показана возможность наследования перенесенного в составе Т-ДНК гена во втором поколении.
В работе получены трансгенные растения кукурузы, несущие функциональные гены - антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы и ген рибонуклеазы циннии. В наших экспериментах с использованием штамма A. tumefaciens LBA4404, встройка антисмыслового супрессора гена пролиндегидрогеназы сопровождалась повышенным содержанием свободного пролина в тканях листа трансгенных растений кукурузы по сравнению с контролем. Полученные растения кукурузы с повышенным содержанием пролина могут быть использованы для дальнейшего анализа на устойчивость к засухе и засолению.
