Введение к работе
Актуальность темы. Реконструирование генома сельскохозяйственных животных является биотехнологическим приемом, от разработки которого зависит интенсивность развития животноводства на современном этапе. Работы по реконструированию организма ведутся в различных направлениях, одним из которых служит получение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в геноме [Эрнст Л.К., 1998]. Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и признаков продуктивности домашних животных. Они также представляют коммерческий интерес в качестве источников ценнейших фармакологических (эритропоэтин, интерферон, альбумин, факторы свертывания крови н др.) и технических (химозин) белков. Важным является создание животных, у которых а результате проведения геномных манипуляций организм приобретает устойчивость к инфекциям. D этой связи успешным считается применение рекомбинантных конструкций, содержащих антисмысловые РНК вирусных генов.
В настоящее время при создании генетически модифицированных животных большое значение приобретает способ доставки рекомбикантных конструкций в организм. Поэтому во всем мире ведутся интенсивные исследования, направленные на разработку новых, эффективных методов перекоса. Особую актуальность на сегодняшний день представляют исследования, проводимые на основе клеточной инженерии, которые предполагают использование линий клеток, упаковывающих рекомбипаншые ретро вирусные векторы.
Применение ретровирусов в качестве векторных молекул за последние годы обрело статус наиболее перспективного и универсального метода введения и экспрессии клонированных генов в эукарнотических клетках [Markowitz D., Goff S., 1988]. Это обусловлено несколькими причинами, одной из которых является высокая эффективность инфицирования клеток-мишеней. В сочетании с клетками, упаковывающими рекомбинантный ретровирус, можно получить в культуре почти 100%-ное заражение клеток-мишеней [Anthony М.С. Brown, 1989]. Кроме того, ретровирусные векторы позволяют вводить экзогенную ДНК в клетки зародышевого пути посредством предымплантационного инфицирования эмбрионов или с перм ато генных клеток тестикул, что может рассматриваться, как перспективный материал для геномных манипуляций у животных. Однако перед введением в организм животных существует необходимость тестирования ре комби нантного вектора в культуре клеток млекопитающих. Необходимо отметить, что многие вопросы, касаюшиеся тропкости ретровкрусных векторов к клеткам млекопитающих, их интеграции и экспрессии, остаются неисследованными. Решению части из выше изложенных вопросов посвящена настоящая работа.
Цель к задачи исследований. Целью работы является характеристика
линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в пе
реносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, имеющие различное видовое
и тканевое происхождение ,..„.
Для реализации указанной цели-был и поставлены следующие задачи: * НАУЧ",; i.-'iD.-VOT'Ei-C*. ;
[ МХЬ . "':! "tvVf',» " і Г:Н.,ІД v-к1; .
изучить и охарактеризовать морфофизиологические особенности линий клеток, упаковывающих рекомби нантные ретровирусные векторы;
ввести экзогенную ДНК в геном клеток-мишеней in vitro посредством:
-
инфицирования с помощью вирусных препаратов;
-
инфицирования путем совместного культивирования с клетками-«упаковщицами»;
изучить потенции линий клеток-«упаковщиц» в переносе экзогенной ДНК в клеткн-мишени, имеющие различную видовую и тканевую принадлежность;
провести сравнительный анализ эффективности использования линий клеток-ч<упаковщиц» рекомбинантных векторов для получения стабильных генетически трансформированных клонов клеток млекопитающих;
разработать новый метод получения траисгенкых животных, основан-. ный на использовании линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретро-вирусные векторы.
Научная новизна. Впервые в культуре клеток сельскохозяйственных животных (свиньи и крупного рогатого скота) протестированы и охарактеризованы 4 рекомбинантных регровнрусных вектора: pLU, pLR, pLNa и pLNCX2, продуцируемые двумя линиями упаковывающих клеток: АМ12 и РТ67.
Впервые продемонстрировано, что сконструированные рекомби нантные гены (эритропоэтин и интерферон человека, антисмысловая РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота), входящие в состав регровнрусных векторов, способны экспрсссироваться в культуре генетически трансформнровакных клеток сельскохозяйственньіх животных (свиньи и крупного рогатого скота).
Практическая ценность работы. Показала необходимость тестирования линий клеток, упаковывающих ре ком би нантные ретровирусные векторы, в культуре клеток сельскохозяйственных животных перед введением их в организм.
Разработан способ получения «фенотигщческих» трансгенных животных, основанный на введении клеток-«упаковщнц» рекомбинантных ретровярусных векторов в семенники быков.
Основные положения, выносимые на защиту:
- зависимость эффективности использования рекомбинантных ретровирус-
ных векторов в переносе экзогенной ДНК от видовой и тканевой принадлеж
ности клеток-мншеней;
зависимость частоты генетической трансформации клеток-мишеней с помощью рекомбинантных регровнрусных векторов от метода трансфекцин;
влияние способа введения в семенники быков клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, на получение генетически трансформированных сперматозоидов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, п. Быково, июнь 2000г.; на 49-ой научно-методической конференции «Достижения молодых ученых в области животноводства», ВНИИЖ, п. Дубровины, июль 2000г.;
на научной конференции «Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных», В1ШИРГЖ, г. Санкт-Петербург, октябрь 2000г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научных работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 10.1 стр., содержит I схему, 11 табл., 15 ркс. (в т.ч. 8 фотографий, 2 диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 169 библиографических источников, в т.ч. 123 на иностранном языке.
