Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Стволовые клетки 13
1.2 Региональные стволовые клетки 14
1.3 Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) 18
1.4 ЭСК сельскохозяйственных животных 26
1.5 Использование фидерных слоев для длительного культивирования эмбрионов сельскохозяйственных животных in vitro 31
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1 Приборы и оборудование 39
2.2 Культуральная посуда 41
2.3 Питательные среды и растворы 41
2.4 Культуры клеток 44
2.5 методы Культивирования клеток 45
2.5.1 Приготовление фидерных слоев из перевиваемых эмбриональных фибробластов мыши линии STO 45
2.5.2 Приготовление фидерных слоев, представленных первичными клетками Сертоли свиньи 47
2.5.3 Приготовление фидерных слоев из перевиваемой клеточной линии тестикул поросенка (ПТП) 47
2.5.4 Пригототовление фидерных слоев из клеток СПЭВ 48
2.5.5 Приготовление фидерных слоев из клеток FBT 48
2.5.6 Приготовление фидерных слоев клеток ЗТЗ Balb\C 48
2.5.7 Приготовление фидерных слоев из клеток NTH ЗТЗ 48
2.5.8 Культивирование клеток BRL 48
2.5.9 Приготовление фидерных слоев, представленных клетками RUF 48
2.5.10 Культивирование первичных эмбриональных фибробластов мыши и кролика для приготовления фидерных слоев 49
2.5.10.1 Получение первичной культуры эмбриональных фибробластов 49
2.5.10.2 Культивирование первичных эмбриональных фибробластов мыши и кролика (МЭФ и КЭФ) 49
2.6 Техника получения преимплантационных эмбрионов свиньи и кролика 49
2.7 Получение эмбрионов кролика на стадии гаструляции 50
2.8 Оценка качества преимплантационных эмбрионов 50
2.9 Оценка качества эмбрионов на стадии гаструляции 51
2.10 Оценка колоний ЭС-подобных клеток 51
2.11 Приготовление кондиционированных сред 51
2.12 Желатинизирование пластиковой посуды 51
2.13 Силиконизирование посуды 52
2.14 Уравновешивание парафинового масла со средой 52
2.15 Определение жизнеспособности клеток 52
2.16 Подсчет посевной концентрации клеток 53
2.17 Подсчет итоговой концентрации клеток 53
2.18 Подсчет индекса пролиферации 53
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
3.1 Получение клеток свиньи с ЭС-подобной морфологией 55
3.1.1 Характеристика биологического материала 55
3.1.2 Влияние стадии эмбриогенеза и фидерных слоев клеток на получение колоний ЭС-подобных клеток свиньи 59
3.1.3 Характеристика ЭС-подобных клеток свиньи 65
3.2 Получение из бластоцист кролика клеток с фенотипом, подобным эски их характеристика 66
3.2.1 Длительное культивирование преимплантационных эмбрионов кролика in vitro на фидерных слоях 67
3.2.2 Влияние некоторых ростовых факторов на эффективность получения 3
клеток кролика с ЭС-подобной морфологией из длительно культивируемых бластоцист 72
3.2.3 ВыделениеЭС-подобных клеток из бластоцист кролика 74
3.2.4 Влияние продолжительного культивирования бластоцист на получение ЭС-подобных клеток кролика 76
3.2.5 Культурально-морфологическая характеристика ЭС-подобных клеток кролика в культуре 77
3.3 Получение от эмбрионов на стадии гаструляции ППЗ-подобных клеток кролика и их характеристика 80
3.3.1 Сравнение способов получения ППЗ-подобных клеток кролика 81
3.3.2 Характеристика первичных культур клеток кролика, выделенных из гаструл 83
4 ОБСУЖДЕНИЕ 90
5 ВЫВОДЫ 98
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 100
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101
Введение к работе
Воспроизведение себе подобных и продолжение рода одна из основных, а может быть и самая основная задача, всех представителей живой природы. Поэтому издревле процессы, способствующие поддержанию жизни на земле, будоражили умы ученых-биологов. За последние 2 столетия, наряду с другими достижениями науки, произошел заметный прорыв в изучении проблемы наследственности и изменчивости. Так в 1838-39гг. Матиас Шлейдан и Теадор Шванн обобщили накопившиеся данные и сформулировали клеточную теорию [18], а в 1855 г. Рудольф Вирхов расширил ее, провозгласив: "Omnis cellula є се11и1а"("каждая клетка из клетки") [7]. Бовери и Флеминг в 1879г. сообщили об открытии механизмов деления соматических (митоз), а вслед за ними Вейсман в 1887г. и половых (мейоз) клеток. Георг Мендель (1856г.) открыл материальность наследственной информации, а в 1909г. датский ботаник Иогансон дал название этим материальным единицам наследственности - ген [7]. Уникальные работы американского генетика Моргана на дрозофилах в 1912г. показали системность расположения генов в хромосомах [7]. В 1953г. Френсис Хари Комптон Крик и Джеймс Девай Уотсон открыли двойную спираль молекулы ДНК. Грандиозным событием, которое до сих пор обсуждается не только биологами всего мира, но, в последнее время, и всем человечеством, вплоть до парламентариев и глав государств, явились две независимые публикации данных в 1981г. об открытии плюрипотентных клеток из эмбрионов мыши, впоследствии, названными эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), авторами которых были М. Кауфман и М. Эванс [56] и Г. Мартин [74]. В 1999г. журнал Science признал это открытие третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека» [16].
Все эти эпохальные события приоткрыли завесу неизвестности в изучении наследственности, изменчивости, регуляции процессов при внутриутробном формировании нового организма и многих других научных проблем. Но возник ряд других актуальных вопросов. Как происходит механизм дифференциальной экспрессии генетического материала, и каким образом из одной примитивной клетки зиготы формируется организм животного с высоко специфичными клеточными системами органов и тканей? На каких стадиях пре- и постнатального развития возможно выделение эмбриональных стволовых клеток, и какими свойствами они обладают? Какие факторы окружающей среды способствуют дифференцировке стволовых клеток, а какие удерживают их в неизмененном виде? Почему некоторые из них обладают неограниченной потенцией к образованию новых тканей вплоть до целого эмбриона, а другие монопотентны?
В настоящее время, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) млекопитающих, в том числе и человека, являются объектом фундаментальных и практических исследований ведущих научно-исследовательских институтов развитых стран мира. Актуальность этой проблемы отражается не только в постановке таких важных практических задач, как необходимость увеличения продуктивности животных и лечение бесплодия у человека. Эмбриональные стволовые клетки являются незаменимой модельной системой для изучения процессов дифференцировки при эмбриогенезе, используются как источник тотипотентных ядер при получении трансгенных и клонированных животных. В этой связи такие клетки незаменимы при получении животных с заранее запрограммированным генотипом, в том числе при создании животных устойчивых к вирусным, прионовым и другим заболеваниям. Так же ЭСК, несомненно, найдут широкое применение при in vitro изучении вирусов, влияющих на эмбриональное развитие. В настоящее время эти клетки широко применяют в генетической и трансплантационной терапии. Примордиальные половые зародышевые клетки (ГШЗК), разновидность ЭСК, дают ответы на многие вопросы, возникающие при изучении гаметогенеза. Успех в решение этих научных проблем напрямую зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения и культивирования in vitro ЭСК (в том числе и ГШЗК) млекопитающих.
Таким образом, изучение ЭСК млекопитающих представляет интерес для решения многих задач биотехнологии, является актуальным и многообещающим для клеточной и генетической инженерии, а также биологии развития млекопитающих.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований было получение клеток свиньи и кролика, подобных эмбриональным стволовым, из зародышей на разных стадиях развития и их характеристика. В связи с этим был поставлен ряд задач: получить клетки с ЭС-подобным фенотипом из преимплантационных эмбрионов свиньи и охарактеризовать их; изучить влияние различных факторов на длительное культивирование преимплантационных эмбрионов кролика; сравнить различные методические приемы получения ЭС-подобных клеток кролика из бластоцист; выделить ППЗ-подобные клетки кролика из эмбрионов на стадии гаструляции; охарактеризовать ЭС-подобные клетки кролика.
Научная новизна. Впервые в России получены клетки свиньи с ЭС-подобной морфологией путем диссоциации бластомеров краткосрочно культивируемых морул.
Впервые изучено влияние девяти монослоев клеток (первичной культуры клеток Сертоли свиньи, STO (перевиваемой линии эмбриональных мышиных фибробластов), ЗТЗ Balb\C (линии эмбриональных фибробластов мыши), NIH ЗТЗ (культуры фибробластоподобных клеток эмбриона мыши), RUF (эпителиальных клеток яйцевода кролика), МЭФ (первичных эмбриональных фибробластов мыши), КЭФ (первичных эмбриональных фибробластов кролика), СПЭВ (перевиваемой линии эпителиоподобных клеток почки плода свиньи), FBT (перевиваемой линии эпителиоподобных клеток трахеи плода коровы), используемых в качестве фидерных слоев, и двух кондиционированных сред из первичной культуры клеток Сертоли свиньи и BRL (перевиваемой линии клеток печени крысы) на эффективность длительного культивирования бластоцист кролика.
Показано, что краткосрочно культивируемые вылупляющиеся бластоцисты (36-48 ч.) дают лучшие результаты для получения и длительного культивирования ЭС-подобных клеток кролика по сравнению с длительно культивируемыми эмбрионами (7 сут.).
Впервые получены и охарактеризованы ППЗ-подобные клетки кролика из эмбрионов на стадии гаструляции. Дана сравнительная характеристика механического и ферментативного методов получения этих клеток. Разработан метод изоляции ППЗ-подобных клеток кролика из гаструл для получения и культивирования ЭС-подобных клеточных штаммов без использования заранее приготовленных фидерных слоев.
Плюрипотентность полученных штаммов ЭС-подобных клеток кролика доказана способностью дифференцироваться в культуре и образовывать эмбриоидные тела при длительном культивировании клонов с высокой плотностью клеток или при суспензионном культивировании.
Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований отработаны методические приемы, позволяющие получать клетки свиньи и кролика с ЭС-подобным фенотипом, которые могут быть использованы в получении трансгенных и клонированных животных, в исследованиях патогенных факторов, влияющих на эмбриональное развитие. Эти условия возможно могут быть использованы при получении, культивировании и манипуляциях с ЭС-подобными клетками человека. Получение ЭСК и ЭС-подобных клеток важно для пополнения Российской Коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН).
Основные положения, выносимые на защиту: методы выделения клеток с ЭС-подобным фенотипом из эмбрионов свиньи и кролика; культурально-морфологическая характеристика клеток свиньи и кролика, подобных эмбриональным стволовым; зависимость развития длительно культивируемых бластоцист кролика от ростовых факторов; влияние возраста культур бластоцист на эффективность получения ЭС-подобных клеток кролика; > методы выделения ГШЗ-подобных клеток из гаструл кролика. Апробация работы. Результаты исследований доложены на Ученых Советах
ВИЭВ, Москва, 2001-2002гг.; 2-ой Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, Дубровицы, 2002г.; 17-ом рабочем совещании «Консервация генетических ресурсов», Пущино, 2002г.; Международной научной конференции «Современные проблемы и достижения клеточной биотехнологии и иммунологии», ВИЭВ, Москва, 2003г.; межлабораторном совещании ВИЭВ, Москва, 2003г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, 1 находится в печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 112 стр., содержит 9 табл., 29 рис. (в т.ч. 19 фотографий, 3 диаграммы), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Список литературы включает 123 библиографических источника, в т.ч. 92 на английском языке.
Стволовые клетки
Стволовые клетки обладают способностью делиться продолжительный период времени, часто на всем протяжении жизни организма. Под воздействием определенных условий или сигналов стволовые клетки могут давать популяции дифференцированных клеток, которые восполняют запасы организма [17, 67]. Это особенно актуально в таких высокоспециализированных тканях организма, как: нервная, кровь, кожа и, конечно, в эмбриогенезе.
Термин стволовая клетка был предложен в 1908г. Александром Александровичем Максимовым на съезде гематологического общества в Берлине [16]. Но широкое распространение в биологии это понятие получило более чем полвека спустя. Будучи заведующим кафедры гистологии и эмбриологии Военно-медицинской академии (ВМА), используя новый для того времени метод тканевых культур в совокупности с гистологическими приемами, профессор А.А. Максимов провел цикл работ по изучению вопросов кроветворения, в контексте эмбрионального развития млекопитающих и амфибий и постэмбрионального развития костного мозга. Заложив основы унитарной теории кроветворения, показал, что в организме животных сохраняются пожизненно малодифференцированные клетки, способные превращаться при индукции в специализированные клетки соединительной ткани, в т. ч. крови. Исследуя кроветворные ткани, выдвинул представление о большом лимфоците - родоначальнике всех элементов крови [12].
Таким образом, учение о стволовых, а именно о региональных стволовых клетках, зародилось в начале XX века.
Региональные стволовые клетки (РСК) - это клетки, различных тканей и органов животного, которым присущи две основные характеристики. Во-первых, они могут в течение длительного времени пролиферировать, воспроизводя морфологически и функционально себе подобные клетки (рис. 1). Во-вторых, при определенных условиях они способны дифференцироваться и давать линии одного или нескольких высоко специфических клеточных типов как in vivo, так и in vitro (рис. 1). Следовательно основная функция РСК поддержание гомеостаза организма [17].
Приборы и оборудование
Манипуляции с клетками и эмбрионами производили в боксовых помещениях и ламинарных шкафах, подающих вертикальный стерильный поток воздуха (Flow Laboratories, Великобритания и производства Украины). Культивирование клеток проводили в инкубаторах, обеспечивающих определенную влажность воздуха, температуру +37С и содержание СО2 5% в атмосфере (Sanyo, Япония) и ГПИ-01 (Россия) и термостате ТЭС (Россия). Краткосрочное хранение клеток осуществляли в рефрижераторе Ultra low (Sanyo, Япония). Для длительного хранения использовали сосуды Дьюара с жидким азотом (Франция и СЗКМ, Россия). Для размораживания клеток использовали водяную баню производства Венгрии. Для хранения растворов при t +4С и -20С использовали бытовые холодильники Nord и Памир-5 (Россия). Центрифугирование клеточных суспензий осуществляли в центрифугах (Janetzki, Германия) и Опн-3 (Россия). Для подогревания сред и растворов использовали термостаты ТС-80М-2 и ТЭС (Россия). Высушивание и стерилизацию культуральной посуды проводили в сухожаровых шкафах производства Венгрии и КВС G-65/250 (Польша). Автоклавирование резиновых пробок, пластиковых крышек, наконечников, центрифужных пробирок и растворов осуществляли в автоклавах (МЕДИ, Россия) и Harvard/LTE (Великобритания). Микроскопирование культур клеток производили на инвертированных микроскопах (Diaphot, Nikon - Япония, ЛОМО - Россия и ICM, Opton - Германия). Просмотр и микрофотографирование нативных препаратов осуществляли на инвертированных микроскопах фирм «Nikon», «Olimpus» оборудованных встроенными фотонасадками, с объективами 10х, 20х, 40х и 100х на негативные пленки «Микрат-300» и «Репортер 135-36» (Свема, Украина) и «Gold-200» (Kodak, Великобритания). Фотографии печатали на фотобумаге (Kodak, Великобритания).
Для работы с эмбрионами использовали аналитическую лупу (10-60х) фирмы «Nikon», Япония и микропипетки d=50-200 мкм. Для приготовления пипеток, брали боросиликатные капилляры с наружным диаметром 1 мм и полоскали 3-4 раза в деионизированной воде, затем высушивали. Чтобы предотвратить прилипание эмбрионов к стенкам микропипеток, внутреннюю поверхность капилляров обрабатывали силиконом, замачивая в нем на 1 ч. После высушивания капилляры стерилизовали в сухожаровом шкафу при t=100C в течение 1 ч. Затем закрепляли оба конца капилляра в держателях пуллера (Narishige, Japan) и вытягивали с уменьшением диаметра до необходимого. Последним этапом были резка под прямым углом и шлифовка отрезанных концов микропипеток на микрокузнице (Narishige, Japan). Перед работой пипетки подсоединяли к резиновой трубке, и производили манипуляции, всасывая\выдувая эмбрионы.
При приготовлении раствора желатина применяли магнитные мешалки ММЗМ (ЗМА, Украина) и Magnetic stirrer (Польша). Бидистиллированную воду получали с помощью дистилляторов Д-1 и АСД-4 (ГЗЭО, Россия). Определение рН проводили на рН-метрах рН-150М производства Белоруссии и фирмы «Orion», США. Для получения сверхчистой деионизированной воды, используемой при приготовлении сред и растворов, применяли деионизаторы воды Elgastat UHQ (Elga, Великобритания) и фирмы «Millipoo , США. Взвешивание реагентов производили на электронных весах R200D и A120S (Sartorius, Германия). Растворы стерилизовали путем пропускания их через нитроцеллюлозные фильтры GS (Millipor, США) с порами d=0,22 мкм с использованием перистальтических насосов (Millipor и Walson-Marlow, США). Для вымывания эмбрионов из матки и яйцеводов были использованы стерильные одноразовые пластиковые шприцы объемом 5 и 50 мл (Прометей+, Россия), а для внутримышечных и внутривенных инъекций использовали шприцы для введения инсулина той же фирмы. Для подсчета клеток применяли счетную камеру Горяева (Красногвардеец, Россия).
Получение клеток свиньи с ЭС-подобной морфологией
Одна из проблем, с которой мы столкнулись при проведении экспериментов, была получение полноценного биологического материала.
Использовано свиней в экспериментах 30
Получено неоплодотворенных яйцеклеток 23
Получено всего эмбрионов 246 -.:111:1
Выделено эмбрионов для эксперимента 70
Из них эмбрионы с дефектами развития 39
Использовано эмбрионов в исследованиях 31
Как видно из результатов, представленных в таблице 2, в среднем от одной свиньи было получено 8,2 эмбрионов, но для работ по получению ЭС-подобных клеток свиньи было выделено всего 28,5% зародышей, что составило в пересчете на одно животное 2,3 эмбриона. Кроме того, среди этих эмбрионов обнаруживали высокий процент зародышей, имеющих дефекты развития (55,7%). В основном, отмечались 2 патологии эмбриогенеза: несоответствие стадии развития эмбриона сроку супоросости (рис. 7);
Причем, культивирование in vitro 2-32 клеточных эмбрионов не приводило к их развитию, а наоборот показывало быструю ( в течение 1 -2 сут.) дегенерацию зародышей, что подтверждало их непригодность для исследований.
Так же неоднократно были получены неоплодотворенные яйцеклетки (рис. 8), что несомненно снижало процент используемого биологического материала.
Таким образом, в экспериментах было использовано всего 44,3% эмбрионов из числа выделенных для наших исследований (или 10% от общего числа зародышей (рис. 10)), что, в среднем, составляло по одному доброкачественному эмбриону от донора (рис. 9).
Влияние стадии эмбриогенеза и фидерных слоев клеток на получение колоний ЭС-подобных клеток свиньи
В результате проведенных экспериментов было изучено влияние различных стадий развития преимплантационных эмбрионов свиньи. Для опыта отбирали морулы, истинные и экспандированные бластоцисты, высшего или хорошего качества, т.к. по литературным данным это одно из основных условий получения ЭСК [12].
В опытах было использовано 15 морул и 16 бластоцист. Все используемые растворы и среды для получения и культивирования ЭС-подобных клеток свиньи были одинаковы на всем протяжении проведения исследований.
Для диссоциации эмбрионов предварительно готовили капельную систему растворов в чашке Примечание: стрелками показана последовательность действий.
После подготовки данной системы эмбрионы переносили из среды 199 в первую каплю ФСБ для отмывки от среды. Для снятия зоны пеллюцида материал помещали в каплю с ФСБ (рН=2,5), после ее растворения эмбрион незамедлительно, чтобы минимизировать время контакта клеток эмбриона с раствором, последовательно проводили по двум каплям ФСБ (рН=7,2-7,4) с целью промывки от предыдущего раствора и для подготовки к трипсинизации эмбриональных клеток. Далее производили трипсинизацию клеток в капле трипсин 0,25%\Версена 00,2% (1:9), помогая суспендированием клеточной массы через микропипетку с внутренним d=50 мкм. После полного разобщения клетки эмбриона переносили в каплю рабочей среды для инактивации действия фермента, зачтем в четырехлуночные планшеты с фидерным слоем клеток, предварительно заблокированным митомицином С.
