Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. 9
1.1. Методологические основы получения трансгенных животных. 9
1.1.1. Микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы, значение метода. 14
1.1.2. Другие перспективные методы переноса чужеродной генетической информации в организм млекопитающих. 20
1.2. Методы анализа интеграции чужеродных генов. 27
1.2.1. Метод дот- и блот-гибридизации по Саузерну. 28
1.2.2. Метод полимеразной цепной реакции в применении к анализу трансгенных животных.29
1.2.3. Визуализация чужеродных генов при использовании генов-маркеров. 30
1.3. Особенности экспрессии чужеродных генов в организме трансгенных животных. 32
1.3.1. Значение регуляторных последовательностей целевых генов для экспрессии в организме животного. 32
1.3.2. Использование металлотиониинового промотора при создании экспрессирующихся векторов для трансгенных животных. 34
1.4. Возможности практического использования трансгенных сельскохозяйственных животных. 37
1.4.1. Трансгенные сельскохозяйственные животные как продуценты биологически активных веществ. 38
1.4.2. Изменение хозяйственно-полезных признаков у трансгенных животных. 39
1.4.3. Трансгенез как способ повышения устойчивости животных к неблагоприятным условиям, болезням и другим стресс-факторам. 42
1.5. Кролики в биотехнологии: лабораторные животные в изучении трансгенеза и трансгенные животные-продуценты биологически активных веществ. 44
1.6. Значение исследования и применения интерферонов для молекулярной биологии, медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. 50
1.7. Общие сведения о структурной организации гена интерферона-pl человека и некоторых физико-химических свойствах. 51
1.8. Перспективы получения и использования трансгенных сельскохозяйственных животных с генами интерферонов, и, в частности, с геном интерферона-[М человека. 52
2. Материалы и методы.
2.1. Бактериальные штаммы. 53
2.2. Плазмиды. 53
2.3. Кролики. 53
2.4. Трансформация. 53
2.5.. Выделение ДНК. 54
2.5.1. Выделение ДНК кролика. 54
2.5.2. Аналитическое выделение ДНКплазмид. 55
2.5.3. Препаративное выделение ДНК плазмид. 55
2.5.4. Элюция фрагментов ДНК плазмид. 55
2.6. Конструирование вектора pMTIFNpl. 56
2.7. Препараты ферментов. 57
2.8. Олигонуклеотидные праймеры. 57
2.9. Микроинъекция. 58
2.10. Трансплантация эмбрионов. 59
2.11. Полимеразная цепная реакция. 59
2.12. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. 60
2.13. Блот-гибридизация. 60
2.14. Внутрикожное заражение кроликов вирусом миксоматоза. 60
2.15. Заражение кроликов лапинизированным вирусом классической чумы свиней. 61
2.16. Размножение трансгенных кроликов. 62
2.17. Определение активности интерферона в сыворотке крови . 62
2.18. Изучение индуцированной экспрессии гена интерферона. 63
3. Результаты исследований. 64
3.1. Конструирование вектора с геном интерферона-Р I человека под контролем металлотиониинового промотора , потенциально способного экспрессироваться в клетках млекопитающих. 64
3.2. Проведение микроинъекций плазмидной ДНК в оплдотворенные яйцеклетки кролика и пересадка их животным-реципиентам, 66
3.3. Анализ родившихся крольчат на наличие гена интерферона-р 1 человека в геноме. 67
3.4. Определение титра интерферона-Р 1 человека в сыворотке крови трансгенов. 70
3.5. Изучение устойчивости к вирусным заболеваниям особей с
установленной интеграцией целевого гена. 72
3.5.1. Устойчивость к заболеванию миксоматозом. 72
3.5.2. Иммунный статус кроликов при заражении классической чумой свиней и вирусом миксомы. 77
3.6. Воспроизводительная способность трансгенных кроликов с геном рі-интерферона человека путем разных форм скрещивания. 80
3.7. Изучение возможности передачи чужеродного гена потомству. 84
4. Обсуждение результатов исследований. 86
5. Выводы. 97 7. Практические предложения. 99
8. Список литературы.
- Методологические основы получения трансгенных животных.
- Бактериальные штаммы.
- Анализ родившихся крольчат на наличие гена интерферона-р 1 человека в геноме.
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Интеграция чужеродного генетического материала в геноме животных и экспрессия целевых генов позволяет решать разнообразные задачи научного и прикладного характера. Разработка технологий трансгенеза стала возможной благодаря успехам молекулярной биологии и генной инженерии. В результате были созданы принципиально новые механизмы введения в популяцию животных признаков, которые в ней полностью отсутствовали. Новые генетические конструкции, потенциально способные экспрессироваться в организме млекопитающих, предназначаются для изменения физиологического статуса трансгенного животного или для получения продукта экспрессии целевого гена.
Использование в генных конструкциях сильных тканеспецифичных промоторов и энхансеров не всегда обеспечивает желаемый уровень экспрессии, поэтому работы по трансгенезу животных в известной степени носят эмпирический характер (Gandolfi et al., 1989). Для получения необходимого фенотипического эффекта приходится получать достаточное количество первичных трансгенных животных, последовательное изучение которых позволяет по мере накопления информации отобрать среди трансгенных особей лучших для размножения, скрещивания и создания гомозиготных форм. В связи с тем, что решение этих задач требует проведения продолжительных по времени и дорогостоящих экспериментов (Гольдман и др., 1996, Gange et al., 1991, Hochi et al., 1990), трансгенные технологии разрабатываются и совершенствуются на лабораторных животных.
Практическая ценность работы определяется выявленным повышением устойчивости кроликов к инфекционным заболеваниям вирусной этиологии, а также возможностью получать фибробластный интерферон из сыворотки крови трансгенных животных.
Цель работы.
1. Создание генной конструкции, включающей ген интерферона-рі человека, получение трансгенных животных, несущих этот ген.
2. Изучение экспрессии данного гена; исследование возможности трансгенов противостоять инфекционным заболеваниям вирусной этиологии, а также формирование популяции трансгенных животных.
Задачи исследования.
Сконструировать вектор с геном интерферона-|31 человека под контролем металлотионеинового промотора, потенциально способным экспрессироваться в клетках млекопитающих.
Провести микроинъекцию плазмидной ДНК в оплодотворенные яйцеклетки кролика и пересадить их животному-реципиенту.
Проанализировать родившихся крольчат на наличие в их геноме целевого гена.
Провести опыты по определению устойчивости полученных трансгенных особей к заболеваниям вирусной этиологии.
Изучить возможность передачи гена интерферона-рі человека потомству; сформировать популяцию трансгенных животных с использованием разных вариантов скрещивания.
Основные положения, выносимые на защиту.
Конструирование вектора, содержащего ген интерферона-рЧ человека под контролем шгдуцибельного металлотионеинового промотора.
Получение трансгенных кроликов методом микроинъекций в зиготы.
3. Установление интеграции целевого гена в их геноме методом цепной полимеразноЙ реакции.
4. Изучение индуцированной экспрессии вектора в организме трансгенных особей.
Показана наследственная устойчивость трансгенных особей к инфекционным заболеваниям вирусной этиологии, обусловленной введением в их геном гена интерферона-Р 1 человека.
Наследование гена интерферона-J31 человека у кроликов I и II поколения первичных трансгенных особей.
Методологические основы получения трансгенных животных
Генетическое совершенствование животных базируется, главным образом, на мутационной изменчивости, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций животных. Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии сделало возможным генетическую модификацию животных посредством внедрения в их геном новых генов. Трансгенные животные - это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген — это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген (Gordon et.al., 1980, Palmiter et.al., 1982).
Интеграция чужеродного генетического материала в геном животных и экспрессия целевых генов позволяет решать разнообразные задачи научного и прикладного характера. Получение трансгенных животных может быть использовано для улучшения полезных признаков сельскохозяйственных животных, создания животных с иммунитетом к вирусным заболеваниям, животных — продуцентов биологически активных белков. (Эрнст, 1994; Эрнст и др., 1993).
Наиболее важные теоретические и экспериментальные достижения мировой науки в создании генетически модифицированных животных суммированы в таблице 1 Несмотря на достигнутые успехи трансгенеза, остается много нерешенных задач. Недостатками всех используемых технологий являются низкая частота интеграции и непредсказуемый характер экспрессии трансгенов (Wall et al., 1993). Использование в генных конструкциях сильных тканеспецифичных промоторов и энхансеров не всегда обеспечивает желаемый уровень экспрессии. Поэтому работы по трансгенезу животных пока в известной степени носят эмпирический характер (Gandolfl et al., 1989). Для получения необходимого фенотипического эффекта приходится иметь дело с достаточным количеством первичных трансгенных животных, последовательное изучение которых позволяет по мере накопления информации отобрать среди трансгенных особей лучших для размножения, скрещивания и создания гомозиготных форм, В связи с тем, что решение этих задач требует проведения продолжительных по времени и дорогостоящих экспериментов (Gange et al., 1991, Hochi et al., 1990), трансгенные технологии разрабатываются и совершенствуются на лабораторных животных.
Хотя основные результаты по созданию трансгенных сельскохозяйственных животных были получены зарубежными учеными, подобные исследования, правда, в несколько меньших масштабах, проводятся и в России. Первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в России в 1987 году: Эрнст с соавторами (1987) сообщили о создании трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Год спустя были созданы кролики с интеграцией генов соматотропина человека (Ениколопов и др., 1988, Эрнст и др., 1990), антисмысловой РНК против аденовируса Adh5 (Мирошниченко и др., 1988), (таблица 2, по сб. «Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Вып. 1», М., 1995).
Бактериальные штаммы
В качестве реципиента при конструировании рекомбинантной плазмиды использовался штамм Е. coli С-600, полученный из коллекции ВНИИгенетика. Бактерии выращивали на среде LB. При выращивании клеток, содержащих плазмиды, в среду добавляли 50 мг/мл ампициллина.
В качестве исходного материала для конструирования были использованы плазмиды pMGH и pINfil, любезно предоставленные В.В.Носиковым и М.И. Лебедевой (ВНИИгенетика), соответственно. Остальные препараты использованных плазмидных ДНК получены в ходе настоящей работы.В экспериментах использовали кроликов пород советская шиншилла, белый великан и калифорнийская.Полученной кольцевой формой плазмидной ДНК трансформировали компетентные клетки штамма E.coli С-600 и на агаризованной среде LB с 50 мкг/мл ампициллина проводили отбор трансформантов. Из отобранных шести клонов пять имели вставку, что было доказано с помощью рестриктаз.
Источниками выделения ДНК кроликов служили кровь и кусочки ткани уха. Выделение проводилось следующим образом: к 200 мкл крови добавляли 200 мкл буфера (200 мМ NaCl, 20 мМ ЭДТА, 20 мМ трис, рН 8,0), 10 мкл 10% SDS, 24 мкл 1М дитиотрейтола. Затем добавляли 5 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл) и пробы инкубировали ночь при 37С. После инкубации пробы дважды обрабатывали равным объемом фенола, один раз смесью фенол-хлороформ, три раза - хлороформом. ДНК из раствора осаждали добавлением 2 мкл тРНК (15 мг/мл), 50 мкл З М ацетата натрия (рН 7,0), 1 мл этилового спирта при -20С в течение ночи. При центрифугировании на центрифуге "Эппендорф" в течение 15 мин. выпадал осадок, его дважды промывали 80% этанолом, сушили и растворяли в 30 мкл бидистиллированной воды. ДНК из ткани уха выделяли аналогичным образом, с той разницей, что кусочки измельчали, добавляли 200 мкл воды, затем такой же объем буфера и
Конструирование вектора с геном интерферона-Р I человека под контролем Анализ родившихся крольчат на наличие гена интерферона-P 1 человека в геноме
Интеграция гена IFNpl в геноме кроликов была, в основном, установлена методом полимеразнои цепной реакции. Синтезированные для этой цели праймеры intpi-І и intpi-2, длиной по 25 п.н., ограничивали участок внутри гена интерферона-рі человека длиной 300 п.н., не затрагивая область плазмидных генов. Это позволяло надеяться на высокую специфичность определения. Наличие в плазмиде промотора МТ-1 было показано как с помощью блот-гибридизации, так и цепной полимеразной реакции, где использовались праймеры МТ-1 и int(31 -2. Эта пара праимеров ограничивала участок плазмиды длиной 400 п.н. Однако существенная разница в оптимальной температуре отжига праимеров ограничивала возможности такого определения для геномной ДНК кроликов, и для большинства трансгенных особей определено лишь наличие гена интерферона-рі человека. В полимеразной цепной реакции определялось наличие именно чужеродного интерферона, а не собственно кроличьего, хотя бы потому, что при одинаковых условиях выделения и анализа искомый ген присутствовал лишь в 8 образцах из 49.
Для надежного типирования трансгенных кроликов на предмет наличия интеграции гена рі-интерферона человека использовали также комплексный подход. Сначала проводили специфическую амплификацию геномной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции, затем продукты ПЦР анализировались блот-гибридизацией по Саузерну. Использование ПЦР позволяло многократно умножить число копий трансгена в анализируемом препарате геномной ДНК даже в том случае, если данный ген присутствует в единственном экземпляре.
В опытах использовалась ДНК, выделенная из ткани уха животных, а также из крови; во втором случае было менее вероятным загрязнение генетическим материалом человека. Но взятие проб тканей уха возможно в более раннем возрасте кроликов. Также отмечено, что предпочтительнее анализировать ДНК из крови по причине более эффективного участия в цепной полимеразной реакции и меньших побочных явлениях. Выделенная из крови ДНК обладала, кроме того, лучшей растворимостью сравнительно с ДНК ткани уха.
