Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. 9
1.1. Получение и использование трансгенных животных. 9
1.1.1. . Методы переноса генов 9
1.1.1.1. Перенос генов посредством микроинъекции ДНК 9
1.1.1.2. Транспорт ДНК с использованием ретровирусных векторов. 12
1.1.1.3. Пересадка ядер транфецированных генами. 14
1.1.1.4. Использование сперматозоидов в качестве векторов экзогенного ДНК. 14
1.1.2. Экспрессия генов. 15
1.1.3. Области применения транспорта генов. 19
1.1.3.1. Рост и развитие животных. 19
1.1.3.2. Получение молока с желаемыми свойствами. 2
1.1.3.3. Повышение качества и выхода шерсти у овец. 22
1.1.3.4. Повышение устойчивости сельскохозяйственных животных к инфекционным заболеваниям. 23
1.1.3.5. Биологическое моделирование патологических состояний человека. 26
1.1.3.6. Создание трансгенных животных - доноров органов для трансплантации человеку. 27
1.1.3.7. Трансгенные животные - продуценты биологически активных веществ медицинского назначения и для перерабатывающей промышленности. 29
1.1.3.8. Выбор вида для получения трансгенных животных 3 7
1.1.3.9. Кролик, как продуцент гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) 39
1.1.3.10. Биология, функция методы получения и применения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) 40
2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Объекты исследования 49
2.2. Генные конструкции 49
2.3. Подбор доноров и реципиентов 53
2.4. Схема гормональной подготовки доноров 54
2.5. Синхронизация овуляции у реципиентов. 54
2.6. Методика извлечения зигот у кроликов. ' 56
2.7. Оценка полученных эмбрионов и микроинъекция гена. 58
2.8. Пересадка микроинъецированных эмбрионов 61
2.9. Методика получения вазектомированных самцов кроликов. 63
2.10. Получение и выращивание крольчат. 64
2.11. Молекулярно-генетический анализ 64
2.11.1. Выделение геномной ДНК и анализ интеграции. 64
2.11.2. Полимеразная цепная реакция 68
3. Результаты исследований. 71
3.1. Изучение возможности применения нового способа транспорта гена после инъекции в цитоплазму зиготы. 71
3.1.1. Сравнительная оценка разных способов стимуляции суперовуляции. 72
3.1.2. Влияние микроинъекции на развитие эмбрионов in vitro. 74
3.1.3. Эффективность трансплантации микроинъецированных эмбрионов. 75
3.1.4. Анализ интеграции трансгена 77
3.2. Получение трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колонестимулирующего фактора (ГКСФ). 78
3.2.1. Изучение ряда факторов на эффективность стимуляции суперовуляции и получение эмбрионов и потомков. 78
3.2.2. Изучение влияния разных способов извлечения зигот кроликов н выход эмбрионов. 81
3.2.3. Изучение качества извлеченных зигот и яйцеклеток после стимуляции суперовуляции у кроликов. 83
3.2.4. Изучение качества микроинъецированных эмбрионов кроликов при культивировании in vitro. 84
3.2.5. Изучение эмбриональных потерь в плодный период у кроликов после введения микроинъецированных зигот. 85
3.2.6. Изучение влияния возраста пронуклеуса на эффективность интеграции гена. 87
3.2.7. Изучение эффективности получения трансгенных кроликов с введением gl GCSF в зиготу. 89
3.2.8. Изучение интеграции генной конструкции gl GCSF в плодах кроликов после пересадки микроинъецированных зигот. 93
4. Обсуждение результатов исследований. 96.
5. Выводы. 105
6. Практические предложения. 108
7. Литература. 109
- Получение и использование трансгенных животных.
- Объекты исследования
- Изучение возможности применения нового способа транспорта гена после инъекции в цитоплазму зиготы.
Получение и использование трансгенных животных
Наиболее распространенным на сегодня методом является микроинъекция ДНК. Получение трансгенных животных путем микроинъекции гена включает извлечение эмбрионов на стадии пронуклеусов (зигота) хирургическим путем или после убоя доноров. С разработкой метода оплодотворения in vitro появилась возможность получать неограниченное количество зигот с использованием боенского материала от сельскохозяйственных животных. Этот прием значительно упрощает и удешевляет процесс получения одноклеточных оплодотворенных яйцеклеток на стадии пронуклеусов, необходимых для переноса в них генных конструкций.
В оплодотворенных яйцеклетках мыши и .кролика, извлеченных в соответствии со стадией их развития, пронуклеусы хорошо видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов крупного рогатого скота и свиней имеются темные липидосодержащие гранулы, которые затрудняют визуализацию пронуклеусов. Применение центрифугирования (g - 1500 мин"1 в течение 3-5 мин.) сопровождается смещением гранул к одному полюсу яйцеклетки, а пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. [Wall R. J. et al. 1985]. Для эмбрионов овцы и козы не требуется центрифугирования. Для визуализации пронуклеусов у этих видов животных достаточно применять оптику Номарского с интерференционным контрастом.
Для успешного выполнения экспериментов по транспорту генов кроме способа переноса генов необходимо владеть методами вымывания эмбрионов и их пересадки, а также четко знать временные границы выполнения операций для каждого вида животных.
После короткого культивирования in vitro эмбрионы большинства видов животных трансплантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов хирургическим методом. У крупного рогатого скота хорошо отработана техника нехирургической пересадки эмбрионов в один из рогов матки. Поэтому у этого вида животных эмбрионы трансплантируют нехирургическим методом после 7-8- дневного культивирования in vitro
Синхронизация полового цикла у донора эмбрионов и у реципиента является необходимым условием для успешного выполнения процесса по пересадке микроинъецированных эмбрионов, так как яичники, яйцеводы и матка должны находится в соответствующей стадии полового цикла, чтобы физиологически обеспечить дальнейшее развитие пересаженных эмбрионов. Синхронизация эструса у мышей и кроликов достигается спариванием с вазэктомированным самцом, стимуляцией овуляции человеческим хорионическим гормоном (ЧХГ) или гонадотропным рилизинг гормоном (Гн - РГ). У крупных домашних животных, крупного рогатого скота, свиней, овец и коз синхронизацию охоты и овуляции вызывают обработкой аналогов простагландина F2a или прогестагенной обработкой и дополнительным введением ЧХГ или Гн - РГ.
С целью увеличения числа зигот у животных - доноров вызывают суперовуляцию путем однократной инъекции сыворотки жеребых кобыл (СЖК) или многократной инъекцией гипофизарного фолликулстимулирующкго гормона (ФСГ) отдельно или в сочетании с ЛГ.
Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20-30 инъецированных зигот. Причем у свиней все эмбрионы транспортируют в один яйцевод, а у мышей и кроликов - раздельно по яйцеводам. У овец, коз и крупного рогатого скота каждому реципиенту пересаживают по два-четыре эмбриона..
Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, исследуют на наличие интеграции чужеродной ДНК. Интеграцию ДНК проверяют методами ПЦР, дот - и блот - гибридизацией по Саузерну.
Получение трансгенных животных можно разделить, таким образом, на шесть этапов:
1. Клонирование генных конструкций и приготовление раствора ДНК для микроинъекции.
2. Подготовка доноров и извлечение эмбрионов.
3. Обнаружение пронуклеусов под микроскопом в эмбрионах животных и микроинъекция ДНК.
4. Пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или в матку
синхронизированных реципиентов.
5. Определение интеграции гена у родившихся потомков.
6. Размножение трансгенных животных с использованием традиционных методов разведения.
7. Изучение экспрессии гена у исходных трансгенных животных и их . потомков.
Для получения трансгенных животных имеет значение получение таких животных, у которых, по крайней мере, часть половых клеток имеют трансген. Установлено, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях развития эмбриона . могут появляться мозаики. Мозаиками считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящими из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Трансгенные мозаики кроме клеток, содержащих трансген, имеют нетрансгенные клеточные линии. Если клетки гонад не содержат трансген, то потомство не может наследовать инъецированный ген от трансгенного родителя. Таким образом, трансгенные мозаики появляются, как правило, только в исходной генерации (F0), а в последующих поколениях трансгенные потомки содержат генную конструкцию во всех соматических и эмбриональных клетках.
По литературным данным 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками. [Wilkie Т.М. et al. 1986].
При интеграции возможно присоединение фрагментов ДНК последовательно друг к другу в виде цепочки, состоящей из нескольких сотен копий рекомбинантной ДРПС. Это наблюдалось у овец, мышей, свиней, кроликов. [Hammer R.E. et al. 1985]. Мышей, свиней. [Pursel V.J. et al. 1989].
Перестройки генных конструкций - явление нередкое при анализе трансгенов, они описаны у мышей, овец. [Pursel V.J. et al. 1989].
Объекты исследования
В первой серии опытов мы исследовали возможность использования активного транспорта генных конструкций из цитоплазмы эмбрионов кроликов в ядро, и получения, таким образом, трансгенных животных.
Для микроинъекции в эмбрионы кролика использовали генноинженерные . конструкции, любезно предоставленные Луниным В.Г. и Анисимовой СВ. (лаборатория генноинженерных животных ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН).
1. В работе были использованы три генных конструкции созданные на базе одного вектора Green Lantern-1 Vector (pGreen-La). Специфической особенностью этих конструкций являлось наличие регуляторных механизмов способных доставлять генную конструкцию из цитоплазмы в ядро зиготы. [ChanCetal. 1998].
2. Мембрана ядра эукариотических клеток свободно проницаема для растворов с размером частиц до 9 нм (протеинов размером в 40-60 кДА). Транспорт больших молекул через ядерные поры требует специальных сигналов, специальных молекул переносчиков (шатл-молекул) и .затрат энергии. Howard Е.А. et al. 1992 (213). Некоторые пептиды, извлеченные из ДНК вирусов (репликация которых происходит в ядре), обладают возможностью связываться с рецепторами на ядерной мембране и проникать через нее, получили название - сигналы ядерной локализации (nuclear localization signal -NLS). [Zanta M. et al. 1999].
3. Генная конструкция содержит маркерный ген зеленого флуоресцирующего белка GFP, под контролем раннего промотора цитомегаловируса CMV для высокого уровня экспрессии, SV40 полиаденилирующий сигнал, расположенный ниже гена GFP, для обеспечения процессинга мРНК в эукариотических клетках и гибридные белки, для транспорта конструкции в ядро. Ген GFP фланкирован сайтами Not 1, для легкого извлечения последовательности рестриктазами. Зеленый белок в составе pGreen-la имеет улученную флуоресценцию, интенсивность свечения которого в 40 раз превышает интенсивность свечения «дикого» типа GFP. [HeimR. etal. 1995].
4. В нашей работе мы использовали три гибридных белка созданных на основе NSL [Hammer E.R. et al. 1985] из Agrobacterium tumefaciens - Vir.D2 и
ДНК связывающих белков: GCN4p, GAL4 и RecA.
Agrobacterium tumefaciens вызывает образование, корончатых галлов. При контакте с этой бактерией нормальные растительные клетки трансформируются в. опухолевые, вследствие переноса генов от бактерии к хозяину.
Опухолевые клетки синтезируют опины, производные аминокислот, перерабатываемые и усваиваемые тем штаммом бактерий, которые индуцируют рост опухоли.
Такая способность связана с большой ДНК-содержащей плазмидой, (Ti-плазмидой). Часть этой плазмиды Т-ДНК вырезается и затем включается в геном растительной клетки. После транскрипции и трансляции Т-ДНК образуются три белка: фермент синтезирующий опины, два других - белки синтезирующие факторы деления клеток. [Албертс и др. 1994].
К 5 Т-ДНК присоединен белок virD2, который является сигналом ядерного транспорта (NSL).
Изучение возможности применения нового способа транспорта гена после инъекции в цитоплазму зиготы
При рассмотрении под обычным микроскопом ядерные структуры в эмбрионах крупного рогатого скота, овец, коз и свиней из-за темных липидосодержащих гранул неразличимы или просматриваются нечетко. Для визуализации пронуклеусов в эмбрионах овец достаточно использовать так называемый интерференцион по контрастной оптики Номарского, а эмбрионах крупного рогатого скота и свиней требуется центрифугирование. Это значительно повышает трудоемкость метода, вызывает некоторые механические повреждения зиготы. Чтобы преодолеть эту сложность, в необходимости визуализации пронуклеусов в зиготах крупного рогатого скота и свиней, была сделана попытка использовать специальную конструкцию, любезно предоставленную Луниным В.Г. и Анисимовой СВ. (лаборатория генно-инженерных животных ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН) для микроинъекции в цитоплазму эмбриона кролика.
В работе были использованы три таких конструкции, созданные на базе одного вектора Green-Lanfern-1 Vector (pGreen-La). Специфической особенностью этих конструкций являлось наличие регуляторных механизмов, способных доставлять генную конструкцию из цитоплазмы в ядро зиготы. [Chan С etal. 1998b].
Были использованы плазмиды, содержащие три таких белка: GCN, GAL и RecA. Эти белки полученные из регуляторной области VIR D2 вируса бактерий Agrobactermm faunefacient ранее использовались для трансформации бактерий растений и клеток млекопитаящих. Они являются составной частью комплексного сигнала ядерного транспорта (NLS). [Hammer E.R. et al. 1985].
Сравнительная оценка разных способов стимуляции суперовуляции.
Для стимуляции суперовуляции у крольчих доноров были использованы препараты СЖК (Орская биофабрика) и Сергон (Биовет, Чехия). Результаты этих экспериментов приведены в таблице 11.
Как видно из данных таблицы 11 рба препарата вызывали суперовуляцию у крольчих доноров. При использовании СЖК число овуляций на одного донора составляло 17,2, а выход оплодотворенных яйцеклеток 15,3. Кроме того, в яичниках обнаружено в среднем 5 неовулировавших фолликулов.
Применение другого препарата СЖК, сергона, вызывало в среднем овуляцию 29,6 фолликулов на одного донора, неовулировавших было в среднем по 3,3 фолликула. При извлечении оплодотворенных яйцеклеток получено в среднем 25,5.
