Введение к работе
Актуальность темы. Научные разработки в области клонирования животных имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. С помощью метода клонирования можно получить ответы на некоторые фундаментальные вопросы биологии развития, ядерно-цитоплазматического взаимодействия, репрограммирования ядра. Путем клонирования можно увеличить поголовье животных с высоким генетическим потенциалом, в частности, элитных быков-производителей (Wilmut et al., 2000), а так же решить проблему сохранения видов животных, находящихся под угрозой исчезновения, и даже восстановления уже исчезнувших (Lanza et al., 2000; Loi et al., 2001). Метод клонирования позволяет существенно увеличить эффективность получения трансгенных животных, что особенно важно в отношении крупного рогатого скота и свиней (Melo et al., 2005). Идея клонирования воплощена в методе переноса ядра (nuclear transfer, NT) клетки-донора в энуклеированную яйцеклетку, находящуюся в метафазе второго деления мейоза (Wilmut et al., 1997). Изначально источниками ядер для подобных исследований служили бластомеры (Willadsen, 1986). В настоящее время достигнуты успехи при переносе ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) при клонировании овец, крупного рогатого скота, мышей, коз, свиней, кроликов, лошадей, крыс и других видов. Сущность технологии SCNT заключается в том, что в предварительно энуклеированную яйцеклетку (цитопласт) вводится ядро соматической клетки. Классическая технология получения клонированных животных, предложенная 25 лет назад (Willadsen, 1986) и применяемая до настоящего времени, остается сложной. Альтернативой традиционному методу является zona-free метод, когда ооциты перед энуклеацией освобождаются от zona pellucida, что значительно упрощает большинство последующих этапов (Peura et al., 1998).
Одно из центральных мест в SCNT занимает получение культур клеток, их соответствующая подготовка, а так же культивирование реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты, что позволяет проводить трансплантацию эмбрионов крупного рогатого скота реципиентам нехирургическим способом. Большой интерес метод клонирования представляет для получения генетически модифицированных свиней для целей ксенотрансплантации. Поэтому часть этапов технологии клонирования мы провели с ооцитами свиней.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований – совершенствование метода получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота путем реконструкции ооцитов без zona pellucida при использовании в качестве доноров ядер соматических клеток и последующего культивирования их in vitro до стадии бластоцисты.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Подготовить качественные цитопласты на основе ооцитов крупного рогатого скота, дозревших in vitro.
-
Получить линии фетальных фибробластов и линии фибробластоподобных клеток кожи от взрослых животных.
-
Разработать метод подготовки соматических клеток для использования их в качестве доноров ядер.
-
Изучить влияние сроков активирования на эффективность развития реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.
-
Усовершенствовать условия культивирования in vitro реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida.
-
Отработанные методы подготовки цитопластов апробировать на ооцитах свиней.
Научная новизна. Впервые было показано, что первое полярное тельце на поверхности ооцитов свиней без zona pellucida является точным указателем расположения материнских хромосом.
Показано, что при использовании среды электрослияния без солей кальция снижается вероятность преждевременного активирования ооцитов крупного рогатого скота под воздействием электроимпульса. При этом эффективность электрослияния конструкций цитопласт-соматическая клетка, подготовленных с применением фитогемагглютинина, составляет 95%.
Показано, что увеличение продолжительности пребывания трансплантированного ядра соматической клетки в неактивированной цитоплазме энуклеированного ооцита до 4–5 ч не снижает уровень развития реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro до стадии бластоцисты.
Практическая значимость. Энуклеация ооцитов без zona pellucida путем апсирации PBI с небольшим участком прилегающей цитоплазмы позволяет получить качественные цитопласты без применения ядерных красителей и УФ лучей.
Применение в качестве доноров ядер соматических клеток, криоконсервированных по достижении 80–100%-ного монослоя, без дополнительного культивирования после размораживания позволяет использовать однородную популяцию соматических клеток на протяжении серии экспериментов. Система WOW может быть использована для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота без zona pellucida, совмещая в себе достоинства как индивидуального, так и группового культивирования. Полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии, в изучении процессов раннего эмбриогенеза млекопитающих, при практической работе с эмбрионами крупного рогатого скота.
Результаты проведенных исследований вошли в состав 5 отчетов о научно исследовательской работе лаборатории клонирования животных отдела «Биотехцентр» по теме: «Разработать эффективные способы, направленные на создание новых типов животных, тканей и культур клеток на основе методов клеточной инженерии» и были утверждены на заседаниях ученого совета ГНУ НИИПЗК в период с 2006 по 2010 г., а также в состав готовящихся методических рекомендаций: «Методические положения по получению клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и их культивированию in vitro, обеспечивающие выход бластоцист на уровне 40–45%», предназначенных для научных сотрудников, преподавателей, аспирантов и студентов научно-исследовательских институтов, ветеринарных и биологических факультетов ВУЗов.
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. при приготовлении инструментов и микроинструментов для выделения ооцитов, для работы с ооцитами, цитопластами и реконструированными эмбрионами, при приготовлении питательных сред и рабочих растворов, эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота (ЭСК). Автор обеспечивал получение и доставку яичников животных в лабораторию, проводил выделение ооцитов, их дозревание, освобождение от клеток кумулюса и zona pellucida, энуклеацию, приготовление пар цитопласт-соматическая клетка, электрослияние, активирование и культивирование реконструированных эмбрионов in vitro. Осуществлял выделение линий соматических клеток от взрослого животного и плода, их культивирование и криоконсервацию. Автор участвовал при проведении анализа и обобщении полученных результатов исследований, написании статей, отчетов и докладов.
В работе использованы материалы, полученные автором лично, а также в соавторстве с зав. отделом «Биотехцентр», д.б.н. Маленко Г.П., научным сотрудником отдела «Биотехцентр» Степановым О.И. и другими сотрудниками отдела, которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Апробация результатов диссертации. Основные материалы диссертации вошли в состав 5 научных отчетов, которые доложены и обсуждены на ежегодных отчётных сессиях ГНУ НИИПЗК в период с 2006 по 2010 гг., а также на международных научных конференциях: IV Международная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (г. Боровск, 2006); The 33rd Annual Conference of the International Embryo Transfer Society (Kyoto, Japan, 2007); 7-я Международная научная конференция-школа "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии" (п. Дубровицы, 2008); 2-й Международный конгресс-партнеринг и выставка по биотехнологии и биоэнергетике "ЕвразияБио-2010" (г. Москва, 2010); V Международная научная конференция "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (г. Боровск, 2010).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч. 3 - в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК (Сельскохозяйственная биология, Доклады РАСХН, Известия РАН. Серия биологическая) и 1 статья в международном журнале (Cloning and Stem Cells).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 164 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, практическое использование полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (333 источника, в т.ч. 326 – иностранных авторов). Работа содержит 13 таблиц, 8 рисунков и 9 страниц приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты:
-
Первое полярное тельце на поверхности ооцитов свиней без zona pellucida является точным указателем расположения материнских хромосом. Энуклеация ооцитов свиней без zona pellucida путем аспирации PBI с небольшим количеством прилегающей цитоплазмы позволяет эффективно удалять материнский хроматин при минимальном снижении объема цитопласта, без применения ядерных красителей и воздействия УФ светом.
-
Пары цитопласт-соматическая клетка, приготовленные с использованием фитогемагглютинина, могут быть эффективно слиты под воздействием электрического импульса в среде без солей кальция. Отсутствие солей кальция в среде снижает вероятность преждевременного активирования цитопластов на этапе электрослияния.
