Содержание к диссертации
Введение
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 . Токсичность алюминия в условиях кислых почв 8
1.2.Факторы и механизмы устойчивости растений к алюмокислому стрессу 12
1.3.Методы и эффективность клеточной селекции растений... 18
1.4.Отбор А1-устойчивых сомаклонов 24
1.5.Процессы каллусогенеза и органогенеза растений 25
1.6.Оценка растениЙ-регенерантов на провокационных фонах 33
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1 . Культивирование растений ячменя in vitro 37
2.2.Оценка регенерантов ячменя в водной культуре 43
2.3.Оценка регенерантов ячменя в вегетационных и полевых опытах 43
3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 45
3.1. Оптимизация условий культивирования каллусных линий и по лучения регенерантов ячменя 45
3.2.Выявление зависимости показателей выживаемости и регенера- ционных процессов каллуса ячменя от концентраций ионов водоро да и алюминия в селективных средах 51
3.3.Оптимизация селективных сред с различными концентрациями ионов НҐ и А13+для отбора алюмоустойчивых каллусных культур при
разных схемах селекции 63
3.3Л.Селективный отбор на первом-втором этапе развития каллус ных культур 63
3.3.2.Селективный отбор на втором-третьем этапе развития каллус ных культур 65
3.4.Оценка адаптивной и регенерационной способностей каллусных линий, полученных от различных генотипов 76
3.5.Лабораторная и полевая оценка устойчивых к алюмокислому стрессу регенерантов ячменя на провокационных и опытных фонах 82
ВЫВОДЫ 98
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ 100
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 101
- Токсичность алюминия в условиях кислых почв
- Культивирование растений ячменя in vitro
- Оптимизация условий культивирования каллусных линий и по лучения регенерантов ячменя
Токсичность алюминия в условиях кислых почв
Важнейшим направлением селекции в Нечерноземье РФ является устойчивость к стрессу, вызванному токсичностью ионов алюминия, в дерново-подзолистых почвах. Площадь кислых почв в этой зоне России составляет 40 мл. га сельскохозяйственных угодий, что составляет около 80% от общей площади пашни. При этом токсичность ионов алюминия может наблюдаться при любой величине рН ниже 5,5. Содержание подвижного алюминия в этих условиях колеблется от 3 до 20 мг/100 г почвы, что составляет 60-400 кг на 1 га пахотного слоя. Такое количество ионов алюминия в сочетании с кислотностью почвы снижает урожай на 20-50% (Авдонин, 1976; Климашевский, 1991; Шевелуха, 1998, 2003; Foy et al, 1978; Oettler et al, 2000).
В настоящее время интенсивно изучаются молекулярный, клеточный и физиологический аспекты алюминевой токсичности в растениях.
Отрицательное действие алюминия сказывается, в первую очередь, на развитии корневой системы, приводящее к снижению продуктивности растения и, нередко, его гибели (Дедов, 1974). Внешние признаки поражения корней выражаются в уменьшении или прекращении роста корней с последующим образованием на них темных пятен (McMeilly, 1982; Aniol, 1999); утолщением и образованием многих боковых корней, рост которых впоследствии тоже замедляется (Мещеряков, 1937). Корни под действием ионов АГ становятся хрупкими и ослизняются (Foy et al, 1978); приобретают желтоватую или бурую окраску, сильно угнетены (Reid, 1969); уменьшается общая их масса и длина, ветвление и опушение (Фроловская, 1966).
Поражается и надземная часть растения под воздействием ионов AI +. Появляется некроз краев листа у чувствительных сортов ячменя (Foy, 1996). Уменьшается высота растений у пшеницы, ячменя и других культур. Происходит уменьшение длины колоса, количества колосков и зерен в колосе, снижение массы 1000 зерен (Родина, 1995; Oettler et al, 2000).
Присутствие алюминия в почве сильно нарушает корневое питание рас-тений, подавляя поглощение макроэлементов из почвы, особенно количество доступного растениям фосфора (Климашевский, Вернадская, 1974), на поверхности корня (Clarkson, 1967), свободном пространстве клеточной стенки (Panpach, 1963) и протоплазме клеток (Ганжа, 1941). Алюминий не только нарушает поглощение фосфора, но и подавляет его включение в основные органические соединения (Климашевский, Вернадская, 1974), увеличивает количество свободных нуклеотидов (Вернадская, 1974) вследствие нарушения их функции в синтетических процессах, например торможение синтеза полисахаридов в клеточных стенках (Huck, 1972). При действии алюминия происходит исчезновение высокоэнергетических центров в корнях (Szatanik-Kloc et al, 1996). Подавляется митотическая активность клеток корней, снижается интенсивность дыхания (Foy et al, 1978; Mumford, Jensen, 1966).
Алюминий вытесняет из клетки кальций, необходимый для развития и стабилизации растительных мембран, тем самым вызывая структурные перестройки в плазмалемме. У ячменя транспорт кальция ингибируется алюминием в концентрации выше 25 мкМ (Вернадская, 1974). В результате снижения проницаемости плазмалеммы наряду с кальцием алюминий вызывает недостаточность железа, магния, калия, воды, нитратов (Lance, Pearson, 1969; Kuodzi, 1970).
Известно, что клеточные оболочки служат ионообменными резервами клеток, сорбируя ионы и освобождая их при изменении рН и поверхностного заряда. Алюминий при взаимодействии с клеточными стенками может быстро блокировать их сорбционные центры, нарушая ионный обмен и, как следствие, поглощение элементов питания. Проникая в свободное пространство корня, он взаимодействует не только с клеточной стенкой, но и с поверхностью протопластов. Плазматические мембраны обладают ярко выраженной сорбционной поверхностью, представленной фиксированными заряженными группами.
Культивирование растений ячменя in vitro
Эксплантами для получения каллусов служили незрелые зародыши зерновок, изолированные на 12-16-ый день после оплодотворения. Слишком мелкие зародыши, бесцветные, прозрачные оставались без развития. Крупные, плотные, желтоватые зародыши быстро переходили к развитию основного проростка, что тормозило образование каллуса. Зерновки со срезанных для посадки колосьев с недостаточными по размеру зародышами подращивали в растворе Кнопа на свету при комнатной температуре. С целью замедления созревания зародыша, колосья выдерживали в холодильнике при температуре +4 С в растворе для депонирования, содержащем 50 г сахарозы, 0,15 г КМп04, 1 мл уксусной 9% кислоты. Раствор обновляли ежедневно, а кончики стеблей подрезали на 2-3 см.
Зерновки стерилизовали в течение 12 мин в свежеприготовленном 5% растворе хлорамина с последующим 3-кратным промыванием в стерильной бидистиллированной воде.
Культивирование каллусов проводили поэтапно на четырех средах, имеющих общую солевую основу, модифицированную по прописи Мурасиге и Скуга- MS (Murachige, Skoog, 1962), но различающихся фитогормональным составом (табл. 2.1; 2.2).
Растворяли в 100 мл дистиллированной воды.
Экспланты заданного размера извлекали из зерновок в стерильных условиях и помещали щитком вверх (по 5-7 штук в пробирке) на поверхность скошенной агаризированной среды. Индукцию первичного каллуса осуществляли на каллусогенной среде MS 1 с добавлением 2-8 мг/л 2,4-Д (дихлорфе-ноксиуксусной кислоты) в течение 2-4 недель в зависимости от скорости развития культуры. В некоторых случаях для предотвращения некротизации
каллусной ткани в среду добавляли AgNC 3 как ингибитор синтеза этилена или активированный уголь в качестве адсорбента. При появлении корешков и проростков их периодически удаляли, чтобы стимулировать каллусообра-зование. Культивирование каллусов проводили при температуре 25-27С, освещенности 3,5-4 тыс. люкс и 16-ти часовом фотопериоде.
Для увеличения общей массы образующегося каллуса и подготовки условий для создания морфогенных очагов его пассировали на среду MS 2 (в чашки Петри) со снижением до 1 мг/л содержанием 2,4-Д. Спустя 2-3 недели проводили учет числа плотных, светлых каллусов с видимыми участками роста (морфогенный каллус). Некротичные культуры выбраковывали.
Для получения растений каллус в возрасте 5-7 недель пассировали на среду для регенерации (MS 3) того же солевого состава, но с полной сменой фитогормонов: 1мг/л кинетин или зеатин, 0,5 мг/л ИУК или НУК - (3 - индо-лил или а-нафтилуксусная кислота и 0,1 мг/л ГК-гиббереловая кислота.
В этих условиях из плотных участков каллуса развивались зеленые листообразные структуры (инициалии), а спустя 2-3 недели - формировались растения. Культуры с проявлением ризогенеза и некротизации выбраковывали, а оставшийся каллус, без признаков регенерации пассировали на свежую среду MS 3.
Оптимизация условий культивирования каллусных линий и по лучения регенерантов ячменя
У злаков надежным источником получения эмбриогенных каллусов в культуре in vitro служат незрелые зародыши, при этом фаза их развития является фактором, определяющим возможность образования и поддержания тотипотентности клеточных культур (Vasil, 1987).
Вопрос о фазе развития экспланта и, в частности, зародыша злаков, который обеспечивает максимальный выход растений-регенерантов, является сравнительно мало изученным. У ячменя при отборе зародышей как стартового материала для образования эмбриогенного каллуса, обычно ориентируются на их размер в диапазоне от 0,8 до 3,0 мм (Дунаева и др., 2000).
На примере сорта Эколог изучали влияние размеров эксплантируемых зародышей от 0,5 до 2,5 мм на способность формировать первичный каллус (табл.3.1).
частично (26% на контрольной и 34,2% на селективной среде) оставались без развития, т.е. не прорастали и не формировали каллус. Напротив, зародыши крупнее 2 мм активно прорастали, которые полностью (на 100%) после обрезания проростков образовывали неморфогенный каллус. При этом морфо-генный каллус на щитке зародыша не формировался. Фракция с размерами от 1 до 1,5 мм обеспечила наиболее высокий выход морфогенного каллуса как на контрольной, так и на селективных средах, соответственно 43,2% и 10,3%.
Считается, что каллусы, полученные из зародышей, быстро теряют спо собность к морфогенезу (Lupotto, 1984). Это связано с тем, что с увеличением возраста культуры каллус становится миксошюидным, в нем накапливаются ь хромосомные и генные мутации, которые вызывают снижение или потерю тотипотентности (Breimann, 1985; Sing, 1986). Каллусная ткань злаков даже в течение первых месяцев культивирования отличается низкой регенерацион-ной способностью (Россеев, 1985; Бутенко и др., 1986-а; Внучкова, 1987; Ис-каков, 1988).
Путем варьирования фитогормональным составом питательной среды, а ф также введением в ее состав физиологически активных веществ возможно сохранить морфогенетический потенциал в течение длительного времени (Бутенко и др., 1967).
Ранее изученные генотипы ячменя обладали способностью формиро вать каллус и образовывать регенеранты в течение 3-4 месяцев. При более длительном культивировании каллусной ткани, независимо от наличия се лективного агента в питательной среде, наблюдалось значительное ослабле ние регенерационной способности клеточных линий. После разрезания при w очередном пассаже длительно культивируемой каллусной ткани снижались темпы накопления ее биомассы. Замедление и остановка роста каллусной ткани отрицательно сказывалась на ее регенерационной способности.
Изучение влияния фитогормонального состава питательной среды с добавлением дрожжевого экстракта на увеличение биомассы длительно культивируемого каллуса (5-й пассаж, 4-й месяц культивирования) и регенерацию растений трех генотипов (табл.3.2) показало сортоспецифичность зависимости прироста каллусной биомассы от исследуемых веществ.
В питательные среды, наряду с 2 мг/л 2,4-Д, который являлся контрольным фоном, вводили исследуемые вещества, влияющие на закладку и рост меристематических зон. Увеличение интенсивности роста каллусов (свыше 200 мг) отмечено у генотипов Северный х Klondike при воздействии кинети-на в сочетании с дрожжевым экстрактом; у генотипа Агат х Первенец при введении зеатин-рибозида 2 мг/л. У генотипа Бригитта х Первенец кинетин в дозе 2 мг/л достоверно снизил прирост каллусной массы. Зеленые регенеран-ты не образовывались ни на одном из вариантов. Формировались только аль-биносные инициалии, причем с более высокой частотой в вариантах с зеати-ном и зеатин-рибозидом у генотипов Северный х Klondike и Агат х Первенец, а также с кинетином и рибозидом у генотипа Бригитта х Первенец. Усиление образования альбиносов может говорить об увеличении мутагенного действия питательной среды. Для исследованных генотипов не был выявлен универсальный стимулятор каллусообразования, вероятно, вследствие недостаточного набора исследуемых веществ.
В дальнейших исследованиях использовали каллусные линии не старше 3-4 пассажей, а каллусообразование стимулировали варьированием различных концентраций 2,4-Д.
