Введение к работе
1. Актуальность темы
Развитие методов получения, культивирования и хранения культур клеток различных типов обусловило их широкое применение при изучении биологии клетки в генетике, вирусологии и биотехнологии.
В последнее время в клеточной биотехнологии отчетливо прослеживается тенденция нарастания роли перевиваемых линий клеток, созданы крупные банки и национальные коллекции аттестованных клеточных культур. Тем не менее, в каждом конкретном случае необходим обоснованный выбор клеточных систем определенного типа, наиболее отвечающего целям и задачам планируемого эксперимента.
Несмотря на достигнутые успехи, связанные с применением перевиваемых линий клеток, для ряда вирусных инфекций не найдены адекватные стандартные биологические модели изучения и накопления вируса in vitro (вирус геморрагической болезни кроликов, вирус артрита-энцефалита коз) (Бакулов И.А. и др., 1992; Жестерев В.И. и др., 1997; Mselli-Lakhal L. et al., 1999).
В связи с этим проблема поиска новых пермиссивных к вирусам стабильных клеточных систем различного видового и тканевого происхождения, несомненно, является актуальной (Новохатский А.С., 1990).
Успешный опыт использования при производстве вакцин перевиваемых линий клеток почки сайги ПС (Вишняков И.Ф., 1994; Анисимова Л.И. и др., 1998), клеток почки африканской зеленой мартышки VERO (Шафеева Р.С. и др., 1994; Фомин К.Ю. и др., 1995) и CV-1 (Вишняков И.Ф. и др., 1997) свидетельствует, что ткани диких животных - перспективный источник получения новых клеточных систем.
Цель и задачи исследований
Цель - получение новых стабильных линий клеток тканей диких животных, изучение их биологических свойств и определение возможности использования в вирусологии и биотехнологии.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
I -
-
Изучить цитоморфологические и ростовые характеристики субкультур клеток диких животных средней полосы России, имеющихся в музее ГНУ ВНИИВВиМ.
-
Получить стабильные культуры клеток из наиболее перспективных субкультур клеток диких животных и изучить их биологические свойства.
-
Исследовать чувствительность данных линий клеток к ряду вирусов -возбудителей опасных болезней с/х животных.
-
Установить видовую принадлежность расплодок клеточных культур из ткани почки сибирского горного козерога, имеющихся в музее культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ.
-
Клонировать клетки ПСГК и изучить биологические свойства отобранных клонов. Получить биотехнологичные штаммы клеток и провести аттестацию по основным показателям.
Научная новизна результатов
-
Получена и охарактеризована новая линия клеток из тканей легкого эмбриона благородного оленя Cervus elaphus ЛЭО-06.
-
Получена и охарактеризована новая культура из тканей кожи эмбриона лося Alces alces КЭЛ/07.
-
Установлена первичная контаминация культуры клеток почки сибирского горного козерога клетками свиного происхождения на уровне первых 16 пассажей и все сублинии ПСГК, поступившие из различных научных учреждений в музей культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ, в видовом отношении относятся к Sus scrofa.
-
Получен и охарактеризован новый клон перевиваемых свиных гетеро-плоидных клеток ПСГК-60/cl, относящийся по видовому происхождению к Sus scrofa.
Практическая значимость работы
1. Паспортизированы новые культуры клеток ЛЭО-06 и КЭЛ/07, полу
ченные из тканей диких животных, а так же клональная линия клеток ПСГК-
60/с1. Созданный криобанк полученных и стабилизированных культур клеток
обеспечит дальнейшие долгосрочные исследования.
2. Культура клеток ЛЭО-06 рекомендована для научно-исследова
тельской и диагностической работы с вирусом артрита-энцефалита коз.
-
Клональная линия ПСГК-60/cl рекомендована и с успехом применяется в качестве клеточного субстрата в научно-исследовательской и производственной работе и при получении вакцинных препаратов против блютанга, болезни Тешена и классической чумы свиней.
-
Разработанные и утвержденные (20.06.08) методические рекомендации регламентируют поддержание и хранение полученных новых культур клеток тканей диких животных.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Культуральная, цитоморфологическая, кариотипическая характеристика и чувствительность к вирусам культуры клеток легкого эмбриона благородного оленя Cervus elaphus ЛЭО-06.
-
Культуральная, цитоморфологическая, кариотипическая характеристика и чувствительность к вирусам культуры клеток кожи эмбриона лося Alces alces КЭЛ/07.
-
Культуральная, цитоморфологическая, кариотипическая характеристика и чувствительность к вирусам клональной линии перевиваемых свиных ге-тероплоидных клеток Sus scrofa ПСГК-60/cl.
Апробация и публикация результатов исследований
Основные положения диссертационной работы отражены в итоговых отчетах ГНУ ВНИИВВиМ за 2005-2007 гг. по теме Россельхозакадемии 08.01.03.06 "Поддержание и развитие коллекции клеточных культур для научных исследований, диагностики и биотехнологии противовирусных препаратов". Материалы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2005-2007 гг.), а также на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» в ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (Москва, 2006 г.). По теме диссертации опубликовано 5 статей, из них две статьи в журналах, определенных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
