Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Материалы, используемые для восстановления костной ткани 12
1.1.1 Ауто-, алло-и ксенотрансплантаты 13
1.1.2 Синтетические матриксы 17
1.2 Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки — перспективный материал для тканевой инженерии костной ткани 22
1.2.1 Морфология ММСК 22
1.2.2 Иммунофенотип ММСК 24
1.2.3 Иммунологические свойства ММСК 28
1.2.4 Потенциал ММСК к направленной ггитодифференцировке 30
1.3 Тканевая инженерия костной ткани 32
1.4 Современные подходы к восстановлению костных дефектов 37
1.5 Заключение 40
2. Собственные исследования 43
2.1 Материалы и методы исследований 43
2.1.1 Материалы исследований 44
2.1.2 Методы исследований 48
2.2 Результаты исследований 63
2.2.1 Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека 63
2.2.2 Сравнение остеогенного потенциала ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки чловека 64
2.2.3 Характеристика ММСК костного мозга овцы
2.2.4 Определение митотического индекса и времени цигогенерации популяции ММСК костного мозга овцы in vitro 69
2.2.5 Анализ экспрессии поверхностных маркеров полученной популяции ММСК костного мозга овцы 70
2.2.6 Направленная дифференцировка ММСК костного мозга овцы
2.2.7 Подбор среды для адипогенной дифференцировки ММСК костного мозга овцы 74
2.2.8 Получение in vitro трехмерного трансплантата костной ткани на основе ММСК костного мозга и кальций-фосфатного матрикса 77
2.2.9 Влияние полученных in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на организм овец при остеосинтезе
3. Обсуждение результатов исследований 85
4. Выводы 101
5. Практическое использование результатов исследований 103
6. Рекомендации по использованию научных выводов 104
7. Список использованной литературы 105
Приложения
- Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки — перспективный материал для тканевой инженерии костной ткани
- Потенциал ММСК к направленной ггитодифференцировке
- Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека
- Влияние полученных in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на организм овец при остеосинтезе
Введение к работе
Актуальность темы. Существует множество клинических случаев, когда лечение костной ткани требует заполнения достаточно обширных дефектов, восстановление которых стандартными методами не эффективно и требует применения специфических подходов.
В настоящее время разрабатываются различные способы восстановления костных дефектов, среди которых можно выделить несколько: применение имплантов различной природы (Mastrogiacomo M. et al., 2005), факторов роста (Nordsletten L. et al., 2006) или плазмы, обогащенной тромбоцитами (Kasten P. et al., 2008). Данные подходы позволяют восстановить дефекты костной ткани небольшой величины, но для восстановления крупных повреждений их эффективность значительно уменьшается, что связано либо с высокой стоимостью метода (факторы роста), либо с отсутствием у материала остеогенного потенциала (плазма, обогащенная тромбоцитами, импланты).
Особую актуальность приобрели методы тканевой инженерии и клеточные технологии. Главным компонентом тканевой инженерии является клеточный материал, в основном, стволовые клетки, обладающие большими потенциями к репарации различных тканей и органов. Широкие потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и простота получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективный в регенерационной медицине. Существующие способы загрузки ММСК в пористые носители обладают низкой эффективностью заселения матриксов клетками. Следовательно, для более равномерного заполнения требуется большее число клеточного материала.
Таким образом, разработка метода оптимальной загрузки матрикса клеточным материалом является актуальной задачей для получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани. Применение таких биологических эквивалентов костной ткани, обладающих, помимо остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств, остеогенными характеристиками, и исследование их влияния на организм овцы является перспективным направлением для применения в ветеринарии, регенерационной медицине и ортопедии.
Цели и задачи исследований. Целью исследований являлось in vitro получение трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга, а также их использование для замещения костных дефектов критического размера. Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить наиболее оптимальный источник мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) для создания на их основе трехмерных трансплантатов костной ткани (ТТКТ).
-
Охарактеризовать клетки, выделенные из костного мозга овцы, с фенотипом подобным ММСК.
-
Провести анализ потенций ММСК костного мозга овцы к направленной дифференцировке in vitro.
-
Оптимизировать среду для направленной дифференцировки ММСК костного мозга овцы in vitro.
-
Оптимизировать существующий способ загрузки ММСК в кальций-фосфатный матрикс для создания трехмерных трансплантатов костной ткани in vitro.
-
Провести доклиническое изучение полученных трансплантатов костной ткани на овцах (баранах).
Научная новизна. Впервые охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства ММСК, выделенных из костного мозга овцы. Впервые изучены потенции ММСК КМ овцы к остеогенной (93±0,05%), хондрогенной (90±0,2%) и адипогенной (83±0,2%) дифференцировке. Подобрана оптимальная среда для направленной адипогенной дифференцировки.
Впервые разработан метод эффективного (93,9±0,01%) заселения пористых трехмерных кальций-фосфатных матриксов клеточным материалом, которые могут быть использованы для восстановления костных дефектов критической величины. Определена оптимальная скорость орбитального шейкера для более эффективного заполнения пористого матрикса клетками. Доказано, что в результате in vitro культивирования ММСК костного мозга в матриксе в среде с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки, получены трехмерные биологические структуры костной ткани.
Впервые в России проведены доклинические испытания, полученных in vitro костных трансплантатов, по восстановлению костной ткани in vivo. В качестве модели дефекта костной ткани критической величины использовались бараны с двойной остеотомией большеберцовой кости. Получены данные о влиянии трехмерных трансплантатов костной ткани на основе ММСК костного мозга на организм овцы.
Практическая значимость. Разработанный метод получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани представляет практический интерес для биотехнологии, медицины и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный биологический эквивалент костной ткани при относительной низкой стоимости его изготовления. На базе ООО «Бьюти Плаза» налажено создание трехмерных трансплантатов костной ткани в производственных масштабах.
Разработан метод эффективной загрузки трехмерных кальций-фосфатных матриксов ММСК КМ для создания ТТКТ с эффективностью 93,9 ±0,01%.
Проведены доклинические испытания полученных ТТКТ на овцах.
Метод получения и наращивания ММСК костной ткани овцы используется на кафедре иммунологии, а способ имплантации ТТКТ используется на кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.
Полученные биотрансплантаты костной ткани используются в ФГУ «ЦИТО им. Н.Н. Приорова» Минздравсоцразвития России для клинического изучения.
На базе ООО «Бьюти Плаза» создан Национальный банк стволовых клеток, с целью криоконсервации ММСК КМ для создания ТТКТ и их дальнейшего научного и клинического применения.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное осуществление лабораторных исследований, проведение доклинических испытаний, анализ, обобщение и интерпретация полученных результатов. Были сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии. Доклиническое испытание было выполнено совместно с аспирантом кафедры иммунологии Девришовым Р.С. В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со старшим научным сотрудником Центра клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза», канд. биол. наук Коржиковой С.В.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – Наука XXI века» (Пущино, 2010); на Московской международной научно-практической конференции, Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010); на IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); 14-м Международном биотехнологическом симпозиуме и выставке (Италия, 2010), на Всероссийской школе-конференции для молодых ученых «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, российских и зарубежных изданий, а так же 5 статей в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (191 источник, из которых 8 отечественных и 183 иностранных). Работа иллюстрируется 6-ю таблицами, 24-мя рисунками и содержит 6 страниц приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты.
-
Выбор наиболее оптимального клеточного материала для создания трехмерных трансплантатов костной ткани и его характеристика.
-
Характеристика ММСК костного мозга овцы.
-
Усовершенствованный метод заселения ММСК кальций-фосфатного матрикса.
-
Доклиническое изучение полученных биологических эквивалентов костной ткани в организме овец.
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки — перспективный материал для тканевой инженерии костной ткани
Аутотрансплантат является собственной тканью пациента, которая берется из здоровой, донорской, области для восстановления поврежденного органа. Аутологичная кость является «золотым» стандартом в лечении костных дефектов. Она не вызывает иммунологических реакций и не отторгается организмом хозяина. Кроме того, при аутотрансплантации отсутствует риск передачи болезней и инфекций. Поскольку аутологичные костные трансплантаты содержат белки и остеогенные клетки, способные поддерживать рост костной ткани, они обладают остеоиндуктивными и остеогенными свойствами. Несмотря на очевидные преимущества, аутотрансплантаты обладают рядом недостатков. Так, например, применение аутотрансплантата для лечения больших дефектов костной ткани не всегда представляется возможным из-за ограниченного количества материала, поскольку, обычно, донорскими областями для получения аутологичной кости являются гребень подвздошной кости и ребра (Arrington E.D. et al., 1996; Taggard D.A. et al., 2001). Так же использование аутологичной кости
невозможно для лечения обширных дефектов у пожилых людей, а также у людей с врожденными заболеваниями и имеющих метастазирующие опухоли. Кроме того, существуют некоторые неудобства, связанные с получением аутологичной кости. Процедура забора аутологичного материала представляет собой отдельную операцию, поэтому пациенты часто испытывают болезненные ощущения в донорской области и различные постоперационные осложнения. Обычно в течение нескольких недель, или даже дней, боль проходит, но, иногда, такие осложнения остаются в течение долгого времени. Помимо боли, существует риск появления грыжи, постоперационного инфицирования, формирования гематом и потери крови (Cricchio G. et al., 2003; Arlington E.D. et al., 1996).
Альтернативой аутотрансплантату для лечения костных дефектов является аллотрансплантат (орган или ткань, пересаженные между аллогенными индивидуумами, т.е. между представителями одного и того же вида). В мире существует множество банков, где хранятся образцы аллогенной костной ткани. Этот материал доступен в необходимом количестве, может иметь различную форму и отличаться по минеральной плотности, поэтому такой трансплантат можно подобрать для каждого конкретного клинического случая (Khan М.Т. et al., 1998; Aho A.J. et al., 1998). Аллотрансплантат, как и аутологичная кость, обладает остеокондуктивными свойствами и обеспечивает структурную поддержку костной ткани, тем не менее, его остеоиндуктивные свойства достаточно слабые. Это явление можно объяснить тем, что при получении аутологичной кости она подвергается различным процедурам консервации, для последующего хранения и стерилизации, с целью снижения риска отторжения и передачи инфекций (Aho A.J. et al., 1998; Dunsmuir R.A. et al., 2003). Все эти процедуры снижают число остеогенных клеток и, тем самым, понижают остеоиндуктивный потенциал трансплантата, кроме того, иррадиация и высушивание замораживанием, влияют на структурную целостность аллогенного материала (Маппог L., 1960; PelkerR.R. et al., 1983). Тем не менее, даже такая интенсивная обработка костной ткани донора не может гарантировать отсутствие риска передачи болезни. Существуют данные о раннем и позднем инфицировании реципиента. В исследовании Palmer и др. было показано, что 8% головок бедренной кости, которые, как считалось, были пригодны для хранения в банке в качестве аллотрансплантата, помимо остеоартрита (который был выявлен до операции по забору аллогенной костной ткани) являлись носителями других заболеваний (Palmer S.H. et al., 1999).
В настоящее время аллогенную кость в качестве трансплантата используют редко. В основном, она служит для получения деминералтзованного костного матрикса (ДКМ). Для этого кость режется или крошится на кусочки, затем обрабатывается кислотой, после чего материал промывают водой, спиртом и этиловым эфиром. Перечисленные стадии являются основными в процессе получения ДКМ, но различия могут заключаться в их продолжительности или температуре проведения манипуляций (Bigham A.S. et al., 2008; Pietrzak W.S. et al., 2005). Помимо аллогенной природы, деминерализованный костный матрикс может быть получен из ксенотрансплантатов костной ткани (Bigham A.S. et al., 2008). ДКМ обладает высоким остеоиндуктивным потенциалом, поскольку содержит такие ростовые факторы как костные морфогенетические белки, и в большом числе КМБ-7 (костный морфогенетический белок - 7) (Pietrzak W.S. et al., 2006). Но, стоит отметить, что степень остеоиндукции костной ткани варьирует от донора к донору, поэтому, при подготовке партии ДКМ необходимо, чтобы материал был только от одного донора. Форма коммерческого деминерализованного костного матрикса может быть различной - он доступен в виде порошка, гранул, чипсов, геля или пасты (Wang J.C. et al., 2007). Такое разнообразие позволяет лучше подобрать необходимый матрикс в зависимости от характера травмы. Важной характеристикой ДКМ является снижение остеоиндуктивного потенциала с уменьшением размера деминерализованных частиц (Sampath Т.К. et al., 1984; Zhang М. et al., 1997). В эксперименте на кроликах было показано, что заживление костной ткани с применением ДКМ было сопоставимо с результатами, полученными при использовании аутотрансплантата (Bigham A.S. et al., 2008).
Ксенотраснплантаты также нашли широкое применение в трансплантологии и ортопедии. Помимо ДКМ, для замещения костных дефектов, часто используют экзоскелет нескольких видов кораллов (Guillemin G. et al., 1987; Demers С. et al., 2002; Alvarez K. et al., 2002). Так, например, структура экзоскелета коралла вида Pontes напоминает структуру губчатой кости, a Goniopora напоминает её кортикальный слой. Перед использованием материал нарезают на кусочки необходимой величины и стерилизуют. Такие трансплантаты обладают остеокондуктивными свойствами и полностью резорбируются в организме (Zuki A. et al, 2006; Fadilah A. et al., 2004). Тем не менее, в основном, экзоскелет разных видов коралла используют для получения гидроксиапатита (ГА) (Chattopadhyay Р. et al., 2007). Существует множество коммерческих препаратов гидроксиапатита кораллового происхождения, размер пор которых составляет 200 мкм и 500 мкм (Damien Е. et al., 2004). Другим источником гидроксиапатита кесногенной природы является костная ткань быков (Eto A.L. et al., 2007).
Кроме того, для заживления повреждений костной ткани часто используют полимерные материалы естественного происхождения, в основном коллаген. Коллагеновые матриксы не обеспечивают структурной поддержки при замещении костной ткани, поэтому их используют для введения некоторых лекарственных средств в область повреждения (Lee С.Н. et al., 2001). Естественные трансплантаты обладают своими преимуществами и недостатками (Betz, R.R., 2002). В настоящее время широкое применение нашли синтетические материалы для восстановления костной ткани. Они сочетают в себе все положительные свойства натуральных матриксов, но, при этом, обладают рядом преимуществ. Так, например, в отличие от аутологичных трансплантатов, они могут быть получены в необходимом количестве и могут быть изготовлены определенного размера и формы, которая требуется в каждом конкретном случае. При использовании трансплантатов из синтетических материалов отсутствует риск передачи болезней и инфекций, как, например, в случае аллогенных и ксеногенных материалов. Кроме того, изменяя некоторые параметры синтетических матриксов, можно контролировать не только их механические характеристики, но и скорость резорбции. Данное свойство является важным условием эффективного заживления костного дефекта, поскольку, для его эффективного восстановления, необходимо, чтобы рост костной ткани был пропорционален скорости распада матрикса.
Потенциал ММСК к направленной ггитодифференцировке
Костный мозг 9 здоровых доноров был получен в клинике «Бьюти Плаза» при пунктирований гребня подвздошной кости, с информированного согласия пациентов. Аспират помещали в одноразовые стерильные пробирки с напылением LiHe и разбавляли физиологическим раствором, забуференным фосфатами (ФСБ), без ионов Са2+ и Mg2+, содержащим антибиотик/антимикотик (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В). ММСК из костного мозга выделяли по разработанной в Центре клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза» ранее методике (Чупикова Н.И. и др., 2004). Коротко, полученную из аспирата суспензию клеток центрифугировали в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин., затем полученную фракцию клеток последовательно промывали ФБС с антибиотиком/антимикотиком и проводили лизирование в специальном буфере. Выделенную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн. клеток на 1см2. Основной средой для культивирования клеток была среда ДМЕМ с низким (1г/л) содержанием глюкозы, дополненная СПК (10%), стократным раствором заменимых аминокислот, и антибиотиками пенициллин и стрептомицин. Конечная концентрация стрептомицина составляла 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед/мл. Периодическое культивирование осуществляли по мере формирования полного монослоя, снятие клеток с субстрата проводили, используя 0,05%-ный раствор трипсина-ЭДТА в течение 5-6 мин.
Количество полученных клеток оценивали подсчетом в камере Горяева, после чего клетки сеяли во флаконы площадью 150 см из расчета 1 млн. клеток на 1 см2.
Тест на жизнеспособность проводили после ферментативного снятия клеток с культурального флакона. Суспензию клеток окрашивали 4% раствором трипанового синего в эквивалентном объеме в течение 5 мин. Затем 10 мкл окрашенной суспензии клеток переносили в камеру Горяева и сразу производили оценку. Путем прямого микроскопического наблюдения производили подсчет окрашенных клеток в пяти больших квадратах камеры. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле: Витальность (%)= слоо.сиеыхклетоквЗ - тике) хШ% Ы\рбщеечислоклетокв5 — тике) Выделение MM Civ из подкожно-жировой клетчатки человека
Жировую ткань 10-ти здоровых доноров, полученную в клинике «Бьюти Плаза» при липоаспирапии, с информированного согласия пациентов, использовали для выделения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток подкожно-жировой клетчатки. Для этого полученную ткань промывали трехкратно в физиологическом растворе, забуференном фосфатами (ФСБ), без ионов Са и Mg , содержащим антибиотик/антимикотик (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В). Жировую ткань измельчали медицинскими ножницами в чашках Петри диаметром 10 см. Затем добавляли среду Игла в модификации Дюльбекко, содержащую антибиотик/антимикотик, и переносили суспензию в 50 мл пробирку.
К полученной суспензии добавляли раствор коллагеназы I типа (конечная концентрация 0.075%). Инкубировали 15 минут в С02 инкубаторе при 37С, затем 15 минут на шейкере при медленном покачивании. Полученную смесь тщательно перемешивали до получения однородной суспензии, затем добавляли 1 объем среды Игла в модификации Дюльбекко, содержащую 10% СПК (сыворотка плода коровы). Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 5 объемах холодного лизирующего буфера, содержащего 155 mM NH4CI, 10 тМ КНСОз, 0.1 тМ Na2EDTA. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Полученную суспензию разбавляли в 2 раза средой Игла в модификации Дюльбекко, содержащей антибиотик/антимикотик, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Осадок суспендировали в среде Игла в модификации Дюльбекко, дополненной 20% СІЖ (сыворотка плода коровы) и антибиотиком/антимикотиком (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В). Полученную клеточную суспензию фильтровали последовательно через фильтры с размером пор ЮОмкми Юмкм.
Периодическое культивирование осуществляли по мере формирования полного монослоя, снятие клеток с субстрата проводили с помощью 0,05%ного раствора трипсина-ЭДТА, в течение 5-6 мин.
Тест на жизнеспособность проводили аналогично описанному для костного мозга. Количество полученных клеток оценивали подсчетом в камере Горяева, сеяли во флаконы площадью 150 см2 из расчета 1 млн. клеток на 1см2.
Анализ иммунофенотипа ММСК костного мозга и ПЖК человека
Клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии на цитометре Beckman Coulter. Окрашивание проводилось по стандартной методике (Ziegle G., 1980) . В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела против CD10, CD13, CD14, CD19, CD25, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD49a, CD49b5 CD49d, CD49f, CD54, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD120a, CD124, CD133, CD166, HLA ABC, HLA DP, HLA DQ, HLA DR, Strol (BD Pharmingen, США). В качестве вторичных антител использовали козьи анти-мышиные IgG антитела, меченые РЕ. Направленная дифференцировка ММСК костного мозга и ПЖК человека Клетки высевали в концентрации 5x103 клеток на см2. Через 24ч. проводили смену рабочей среды на дифференцировочную в опытных лунках и на стандартную - в контрольных. В качестве среды для направленной остеогенной дифференцировки использовали ДМЕМ, дополненную СПК (10%), дексаметазоном (10-7 М), Р-глицерофосфатом (10 мМ) и аскорбат-2-фосфатом (0,05 мМ). Смена среды проводилась каждые 3 дня, в течение 28 дней. Через 28 суток клетки окрашивали красителями Alizarin Red S.
Окраска Alizarin Red S включала две стадии: сначала клетки фиксировали метанолом 5 минут, после чего инкубировали 10 мин в 40мМ растворе красителя Alizarin Red S (рН= 4,1-4,3), затем окрашивали гематоксилином по Майеру.
Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека
На сегодняшний день отработаны методики выделения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из различных тканей организма (плацента, тимус, дерма, фетальные ткани и другие), в том числе подкожно-жировой клетчатки (ПЖК) и костного мозга. ММСК из различных источников отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью к дифференцировке не только в клетки мезенхимного происхождения, но и в клетки других зародышевых листков. ММСК из разных источников имеют одинаковые характеристики, с незначительными отличиями в профиле экспрессии поверхностных антигенов и различной эффективностью направленной цитодифференцировки (Kern S. et al., 2006). Для создания эффективного биологического эквивалента костной ткани необходимо было определить оптимальный источник клеточного материала, мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). Наиболее легкодоступным источником данного вида клеток является подкожно-жировая клетчатка. Тем не менее, для восстановления костных дефектов наиболее часто используемым источником ММСК является костный мозг. Поэтому в данной работе было произведено сравнение популяций ММСК, выделенных из двух источников — подкожно-жировой клетчатки и костного мозга.
В Центре клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза» уже были выделены и охарактеризованы клетки, из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки, с фенотипом подобным ММСК (Teplyashin A.S. et al., 2005а и b). В данной работе был проведен сравнительный анализ иммунофенотипа клеточных популяций из двух источников, а также проведен анализ потенциала к направленной отсеогенной дифференцировке. Как уже было отмечено, для ММСК не существует специфического маркера, тем не менее, они экспрессируют характерный набор поверхностных антигенов. Эти клетки положительно окрашиваются антителами к CD 105 и CD73. К данным антигенам были синтезированы специфичные антитела -SH2, SH3 и SH4 (Haynesworth S.E. et al., 1992). SH2 антитела распознают CD 105, эндоглин, который является рецептором трансформирующего фактора роста pi (TGF pi) (Barry F. et al. 1999). SH3 и SH4 антитела распознают 5 -нуклиотидазу - CD73. В 2006 году Международное общество клеточной терапии выдвинуло предложение, согласно которому, одним из основных критериев ММСК должна быть экспрессия определенного набора антигенов. Помимо CD 105 и CD73, популяции клеток должны положительно окрашиваться ( 95%) антителами к CD90 (Thy-І) и не должны экспрессировать ( 2%) общий лейкоцитарный маркер (CD45), маркер ранних предшественников гемопоэтических клеток (CD34), CD14 или CDllb (маркеры макрофагов), маркеры В-лимфоцитов (CD79a или CD 19), а также молекулы II класса комплекса гистосовместимости (Dominici М. et al. 2006). Клетки, выделенные нами из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки, имели ту же панель экспрессии. При сравнении иммунофенотипа клеточных популяций, выделенных из двух источников, было выявлено значительное различие по экспрессии а4-интегрина (CD49d) и молекулы клеточной адгезии VCAM (CD 106). ММСК костного мозга, в отличие от подкожно-жировой клетчатки, активно экспрессировали CD 106, в то время как экспрессия CD49d была умеренной. В свою очередь, для ММСК подкожно-жировой клетчатки наблюдалась высокая экспрессия CD49d и низкая экспрессия CD106. Полученные результаты подтверждают данные различных лабораторий (De Ugarte D.A. et al, 2003).
Дифференцировка остеогенных клеток характеризуется экспрессией различного набора генов, которые характерны для каждой отдельной стадии.
Маркером ранней стадии дифференцировки ММСК в клетки остеогенной линии является остеопонтин (Mark М.Р. et al. 1987). Экспрессия остеокальцина характеризует боле поздние стадии образования костной ткани, и указывает на полную дифференцировку клеток в остеобласты (Tracy R.P. et al 1990). В то время как костный сиалопротеин является наиболее специфичным маркером остеогенеза (Chen J. et al., 1992). Его экспрессия указывает на процесс минерализации костного матрикса.
При анализе экспрессии генов, маркеров стадий остеогенеза, во время культивирования ММСК из двух типов тканей в среде с индукторами остеогенной дифференцировки, было выявлено отличие в экспрессии поздних маркеров. Экспрессия остеопонтина определялась на 14-й день культивирования ММСК (как из костного мозга, так и из ПЖК) в остеогенной среде и сохранялась на 28й день культивирования. Однако значительные отличия наблюдались в экспрессии остеокальцина и костного сиалопротеина. В ММСК костной ткани остеокальцин детектировался на 14-й день и его экспрессия наблюдалась до 28-го дня культивирования. Но, в ММСК ПЖК экспрессия данного гена не выявлялась. Костный сиалопротеин в ММСК костного мозга определялся только на 21й день культивирования. Поскольку экспрессия данного гена является маркером поздних стадий остеогенеза, нами был сделан вывод, что уже на 21-й день культивирования происходит минерализация матрикса, синтезированного клетками, направленных в остеогенную дифференцировку. ММСК ПЖК не экспрессировали данный ген даже на 28-й день культивирования.
Морфологические изменения в культуре ММСК КМ, при добавлении в культуральную среду индукторов остеогенеза, наблюдалются уже на 14-й день культивирования, в то время как ММСК ПЖК ещё слабо синтезируют внеклеточный матрикс. На 28-й день культивирования это различие между двумя клеточными популяциями сохраняется. Эффективность остеогенной дифференцировки на 28 день культивирования в среде с индукторами остеогенеза составила 98+0,05% для ММСК КМ и 57±0,04% для ММСК ПЖК. В литературе имеются различные данные по сравнению ММС КМ и ПЖК. Результаты данного эксперимента согласуются с данными некоторых исследователей (Winter A. et al., 2003; Lee R.H. et al., 2004; Im G.I. et al., 2005), однако, существуют работы, показывающие одинаковые потенции этих клеток к остеодифференцировке (Dragoo J.L. et al., 2003; Hattori H. et al., 2004).
Таким образом, несмотря на фенотипическое сходство, ММСК, выделенных из разных источников, в частности, костного мозга и подкожно-жировой клетчатки, эти клетки обладают несколько различными потенциями к дифференцировке в клетки остеогенной линии. Поэтому, для дальнейших экспериментов по созданию трехмерных трансплантатов костной ткани нами были выбраны ММСК, выделенные из костного мозга.
Несмотря на то, что доклиническое изучение ТТКТ проводят на моделях экспериментальных животных, в частности овцах, ММСК, выделенные из их костного мозга недостаточно охарактеризованы. Поэтому перед нами была поставлены задача выделения и характеристики клеток, подобных ММСК костного мозга.
Влияние полученных in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на организм овец при остеосинтезе
При недостаточном количестве ММСК, или неравномерном заполнении матрикса происходит неэффективная остеогенная дифференцировка клеток внутри пористого матрикса (Teplyashin A.S. et al., 2005 d). Только при достаточной клеточной плотности клетки не только равномерно заселяют клеточный матрикс, но и эффективно дифференцируются в клетки остеогенной линии, что было показано с помощью экспрессии одного из маркеров остеогенеза - остеопонтина. Известно, что межклеточные N-кадгериновые контакты играют важную роль не только в процессе хондрогенной дифференцировки, но и при остеогенезе. (Arnsdorf E.J. et al., 2009). Одним из воможных молекулярных путей участия N-кадгериновых контактов в остеогенезе является Wnt - сигнальный путь.
Существуют два возможных пути Wnt сигнального каскада — канонический и неканонический. Канонический путь Wnt изменяет концентрацию внутриклеточного Р-катенина, который, переходя в ядро, образует комплекс с TCF и LEF. Данный комплекс активирует работу различных генов, в том числе и Runx2, который известен как фактор транскрипции остеогенной дифференцировки. При неканоничсеком пути активации не происходит накопление р-катенина, а накапливается RhoA и NLK. NLK так же активирует экспрессию Runx2, в то время как RhoA участвует в регуляции организации компонентов цитоскелета, а именно, контролирует образование стресс-фибрилл и фокальных контактов. Кроме того, для неканонического Wnt сигнального пути было показано, что нитоплазматический пул Р-катенина может быть повышен и без изменений в его фосфорилировании. Было показано, что при активации неканоничсекого сигнального пути наблюдаются изменеия во взаимодействии N-кадгеринов и Р-катенинов, что приводит к активации генов, ответственных за остеогенную дифференцировку (Arnsdorf E.J. et al., 2009; Ling L. et al., 2009).
Как уже было отмечено, N-кадгерины играют важную роль и в процессе хондрогенной дифференцировки. Таким образом, сигналы, поступающие от данных молекул межклеточной адгезии, являются регуляторами дифференцировки ММСК. Возможно, взаимодействие N-кадгеринов, Wnt каноничсекого пути и Р-катенина могут также включать и активацию RhoA, посредством Wnt5a. На данный момент, достоверно доказано, что Wnt учатсвуют как в процессе остеогенеза, адипогенеза, так и хондрогенеза. Но не ясно, какие именно сигнальные пути задействованы в конкретном процессе дифференцировки. Имеются данные о влиянии концентрации Wnt белков на дальнейшую дифференцировку клеток (de Boer J. et al., 2004). Возможно, разногласия, существующие в литературных данных, являются результатом отличия систем исследования, которые были использованы в работах разных авторов.
Разработанный нами метод позволяет равномерно заселить пористые матриксы клеточным материалом, где клетки контактируют друг с другом по всему объему трансплантата, что способствует эффективной остеогенной дифференцировке. Таким образом, с помощью данного метода были получены структуры, подобные костной ткани. Следующим этапом работы стало изучение влияния полученных in vitro ТТКТ на организм овец при имплантации в область дефекта болыпеберцовой кости. Для данного исследования была выбрана модель двойной остеотомии с целью формирования дефекта критической величины, то есть дефекта, при котором его восстановление с помощью собственных резервов организма не возможно.
При заживлении дефекта костной ткани, например, при её переломе, важную роль играют несколько факторов — степень сопоставления отломков и неподвижность краев костной раны. При оптимальном сопоставлении отломков заживление кости происходит без образования костной мозоли (первичным костным сращением). При отсутствии сопоставления костных отломков, восстановление костной ткани происходит с образованием костной мозоли. В данном эксперименте костные отломки не контактировали друг сдругом, но в область дефекта были имплантированы созданные in vitro биологические эквиваленты костной ткани.
При заживлении костной ткани без репозиции отломков, гистологически можно выделить три стадии восстановления дефекта. Сначала наблюдается воспалительная реакция. Промежуток между отломками заполняется кровью из разорвавшихся сосудов, и формируется гематома. Затем в области дефекта начинаются реакции, характерные для острого травматического повреждения, характеризующиеся миграцией лейкоцитов и моноцитов. Первый этап завершается формированием рыхлой волокнистой соединительной (грануляционной) ткани, посредством миграции фибробластоподобных клеток. Этот этап занимает около 2-х суток (Быков В.Л., 2000; Берченко Г.Н., 2011).
