Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Открытие стволовых клеток взрослого организма 10
1.2. Строение костного мозга человека 12
1.3. Методы выделения ММСК костного мозга 16
1.4. Особенности морфологии и роста ММСК in vitro 17
1.5. Экспрессия поверхностных маркеров 20
1.6. Направленная дифференцировка ММСК 23
1.7. Пластичность ММСК костного мозга 24
1.8. Иммунологические свойства ММСК 28
1.9. Возможности клинического применения ММСК на примере трансплантации биоматриксов костной ткани 33
1.10. Заключение 39
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
2.1. Материалы и методы исследований 42
2.1.1. Культуральная посуда 42
2.1.2. Приборы и оборудование 42
2.1.3. Специальные среды и растворы 44
2.1.4. Методы исследований 45
2.2. Результаты исследований 57
2.2.1. Метод выделения ММСК костного мозга 57
2.2.2. Способность к формированию колоний in vitro, митотический индекс и клеточный цикл 60
2.2.3. Подбор условий для долгосрочного культивирования ММСК. 61
2.2.4. Анализ ММСК костного мозга в динамике культивирования in vitro 63
2.2.5. Анализ поверхностных маркеров, полученной популяции клеток 68
2.2.6. Способность к цитодифференцировке в клетки мезодермального происхождения 73
2.2.7. Локализация ММСК in vivo в организме мыши при внутривенном введении 79
2.2.8. Получение трехмерных трансплантатов костной ткани на основе ММСК костного мозга и кальций-фосфатного матрикса in vitro 79
2.2.9. Гистологический и иммуногистохимический анализ полученных
трехмерных трансплантатов костной ткани 81
2.2.10. Гистологический и иммуногистохимический анализ ТТКТ, имплантированных в организм мыши 83
2.2.11. Влияние полученных трансплантатов костной ткани
на организм овец при остеосинтезе 85
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 90
4. ВЫВОДЫ 103
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 105
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 106
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 107
ПРИЛОЖЕНИЯ 125
Введение к работе
Актуальность темы. Быстрое развитие естественных наук, в частности клеточной биологии за последние годы явилось результатом разработки новых современных подходов для лечения различных приобретенных и врожденных заболеваний человека и животных.
Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной биологии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальными свойствами. В настоящее время в ведущих научно-исследовательских институтах различных странах мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием физиологии и особенностей локализации стволовых клеток человека и животных. Изучение физиологических особенностей, функций и локализации в организме различных типов стволовых клеток помогает понять механизмы регенерации и поддержания организма. Знание механизмов возникновения различных заболеваний человека может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии [116].
Согласно общепринятому определению, стволовые клетки - это особая группа недифференцированных клеток организма, обладающих способностью к самовоспроизведению и к дифференцировке в специализированные ткани, кроме того, к основным свойствам стволовых клеток можно отнести значительный пролиферативный потенциал, позволяющий им многократно делиться и сохраняться как популяция в течение, как правило, всей жизни организма. В организме взрослого человека присутствуют несколько типов стволовых клеток, среди которых выделяют популяцию мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). В настоящее время активно изучается возможность использования этих клеток в лечение многих приобретенных и наследственных заболеваний [143, 147].
Выделение, длительное культивирование, возможность направленной дифференцировки стволовых клеток представляет собой одно из
перспективных направлений в клеточной биологии, регенеративной медицине и ветеринарии, поскольку позволяет создать биологические конструкции для заместительной терапии поврежденных органов и тканей.
Достижения мировой и отечественной клеточной инженерии показали, что открывается возможность массового получения «живых» тканей и органов, что позволит на порядок увеличить темпы регенерации повреждений организма.
В связи с этим, альтернативным и перспективным подходом является использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в качестве источника получения тканей мезодермального происхождения.
В 60-х годах 20-го века удалось выделить клетки-предшественники костной ткани, обладающих способностью самоподдержания и дифференцировки в остеогенные, хондрогенные и адипогенные типы клеток. При этом исходным материалом служили клетки костного мозга мыши [9]. В настоящее время ведутся успешные попытки использования данного типа клеток для получения всех перечисленных типов тканей с использованием биодеградируемых носителей [24, 79].
Решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения, культивирования и дифференцировки in vitro.
Таким образом, изучение ММСК человека является актуальным для применения в ветеринарной и медицинской практике.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека, а также создание на их основе костных структур. Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Оптимизировать способ разделения клеток в градиенте плотности
фиколла с фенотипом подобным ММСК костного мозга и охарактеризовать их.
Разработать условия для длительного культивирования ММСК костного мозга.
Изучить потенции ММСК костного мозга к дифференцировке in vitro.
Оптимизировать известный способ загрузки клеток в пористый кальций-фосфатный матрикс для создания ТТКТ человека in vitro и охарактеризовать их.
Провести доклиническое изучение полученных костных трансплантатов на экспериментальных мышах и овцах.
Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК и предложен усовершенствованный метод. Для выделения популяции ММСК определен параметр центрифугирования Равный 3000 об/мин. Разработаны оптимальные условия для длительного культивирования ММСК костного мозга человека. Впервые в России проведен широкий анализ антигенов, характеризующих ММСК.
Впервые, с учетом морфологических особенностей клеток представлены данные об оптимальном соотношении количества клеток на объем матрикса с учетом пористости носителя. Впервые показана зависимость плотности заполнения матрикса на дифференцировку клеток. На основе гистологических и иммуногистохимических методов доказано, что в результате культивирования in vitro ММСК костного мозга в матриксе в дифференцировочной среде получены трехмерные структуры костной ткани. Показано, что при эктопическом введении полученных трансплантатов в организм мышей, они не являются токсичными и не проявляют свойств туморогенности.
Впервые в России проведены предклинические испытания по влиянию полученных костных трансплантатов на организм овцы при смоделированных костных травмах.
Практическая значимость. Разработанный способ выделения ММСК костного мозга используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения для клинических целей (клиника «Бьюти Плаза»).
Метод получения и наращивания ММСК животных используется на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.
В ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН используются биотрансплантаты костной ткани для клинического изучения.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме и европейской научно-практической конференции (Германия, 2004); международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва, 2004); II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); на 4-ом ежегодном съезде Европейского общества по тканевой инженерии (Германия, 2005); международной конференции «Surface - Tissue Interaction» (Швейцария, 2005); Всемирной конференции по тканевой инженерии, 8-ом ежегодном съезде международного общества тканевой инженерии (Китай, 2006); 3-ем Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006); VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); на XI съезде международного общества по тканевой инженерии, европейском международном симпозиуме (Нидерланды, 2006).
На защиту выносятся следующие положения и результаты: 1. Усовершенствованный метод выделения ММСК костного мозга и их характеристика.
Условия длительного культивирования ММСК костного мозга.
Зависимость дифференцировки ММСК костного мозга в трехмерных пористых структурах от концентрации клеток.
4. Доклиническое изучение полученных биоимплантов в организме
иммунодефицитных животных и мелкого рогатого скота in vivo.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, 10 статей в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (163 источников, из которых 13 отечественных и 150 иностранных). Работа содержит 13 таблиц, 17 рисунков, 9 страниц приложений.
Открытие стволовых клеток взрослого организма
Долгое время исследователи пытались найти ответ на вопрос о путях и способах регенерации органов и тканей живых организмов, в частности человека. В дальнейшем понимание механизмов регенерации могло иметь огромное значение для широкого практического применения в медицине и ветеринарии.
Понятие стволовой клетки взрослого организма было впервые введено российским ученым Александром Максимовым в начале прошлого века (1909 г.). На основе научных исследований в области гистогенеза крови и соединительной ткани удалось проследить основные этапы гистогенеза соединительных тканей и крови у различных животных, как в эмбриональном, так и постнатальном периодах. Выводы, сделанные им, свидетельствовали в пользу того, что все клетки крови развиваются из одного предшественника, который имеет вид «малого» лимфоцита. Им было высказано положение, что подобные предшественники, характеризующиеся чрезвычайно широкими дифференцировочными потенциалами имеются в тканях не только на эмбриональной стадии, но и во взрослом организме. Максимов впервые в отечественной науке использовал термин «стволовая клетка» [101]. Однако примерно в то же время (1907 г.) термин «stammzelle» был использован H.Schridde к недифференцированным клеткам эпителия передних отделов кишечной трубки в ходе эмбриогенеза [128]. Но, несомненно, заслугой Максимова является его предположение о стволовых клетках во взрослом организме.
Открытие ММСК костного мозга принадлежит Александру Фриденштейну и относится оно к 60-м годам 20-го века. В 1963 году группой А. Фриденштейна было показано, что после пересадки костного мозга под почечную капсулу мыши формируется костная ткань заселенная кроветворными клетками. При помещении клеток костного мозга в диффузионную камеру, клетки также формировали костную ткань, но заселения клетками крови не происходило. Благодаря полученным результатам был сделан вывод об остеогенном потенциале клеток костного мозга, в отличии, например, от клеток эпителия, и подтверждено, что остеогенные предшественники костного мозга отличаются от предшественников клеток крови [9]. Для доказательства того, что костный мозг содержит популяции клеток-предшественников костной ткани и клеток крови, был поставлен следующий эксперимент. Мышам-гибридам поколения F1 под почечную капсулу трансплантировался костный мозг родительской особи. Методом кариологического анализа было обнаружено, что образующаяся костная ткань образовывалась из клеток родительской особи, а гематопоэтическая ткань формировалась из клеток гибрида. Эти исследования подтвердили, что остеогенные и гематопоэтические клетки происходят из различных предшественников, также было показано, что гетеротопическая костная ткань самоподдерживалась и не заменялась клетками хозяина. Эти результаты позволяют классифицировать эти клетки как остеогенные стволовые клетки или ММСК [10, 87]. В последующих экспериментах было установлено, что при эксплантации клеток кроветворных и лимфоидных органов с низкой плотностью на 12-14-й день культивирования образовывались видимые невооруженным взглядом дискретные колонии фибробластоподобных клеток. Благодаря этим экспериментам удалось установить содержание этих клеток в различных органах и тканях организма в норме (2-3%), при различных патологических состояниях и различных воздействиях на организм (облучение, травма введение антигена, кровопотеря и т.д.) [52, 140]. Определяющим являлось установление клонального происхождения формирующихся колоний -колониеобразующих клеток - предшественников [12]. Показано, что во взрослом организме эти клетки находятся вне пролиферативного пула, в фазе Go и вступают в S-период, спустя 24-72 часа после эксплантации. Стромальные клетки-предшественники обладают высокими адгезивными свойствами (90% этих клеток прикрепляются ко дну культурального флакона за первые 30-60 минут после эксплантации) [54]. Фриденштейн выявил две категории остеогенных клеток - предшественников: детерминированные (в костном мозге) и индуцибельные (в мезенхимной строме внутренних органов и подкожной соединительной ткани). В дальнейшем было показано, что стромальные клетки костного мозга сохраняют свой остеогенный потенциал при длительном культивировании. Проходя около 50 удвоений численности, эти клетки сохраняли диплоидность [11]. Анализ дифференцировочных потенциалов моноклональных стромальных фибробластов костного мозга показал, что при обратной трансплантации в организм потомки одной стромальной клетки - предшественницы способны формировать костную, хрящевую, фиброзную и жировую ткани, а также ретикулярную ткань, пригодную для заселения кроветворными клетками [13]. Таким образом, было показано, что костный мозг содержит клеточную популяцию, отличающуюся от клеток гематопоэтического ряда, способную к длительному самоподдержанию и дифференцировке в ткани мезенхимного происхождения. Также было сформировано понятие о стволовых стромальных клетках кроветворной и лимфоидной тканей.
Интенсивные исследования в данном направлении продемонстрировали, что популяцию ММСК можно получить и из других тканей взрослого организма. Так появились сообщения о получении популяции клеток с подобными характеристиками из мышц, сердца, печени [98,151] кожи [144], и жира [16,161].
Строение костного мозга человека
Долгое время исследователи пытались найти ответ на вопрос о путях и способах регенерации органов и тканей живых организмов, в частности человека. В дальнейшем понимание механизмов регенерации могло иметь огромное значение для широкого практического применения в медицине и ветеринарии.
Понятие стволовой клетки взрослого организма было впервые введено российским ученым Александром Максимовым в начале прошлого века (1909 г.). На основе научных исследований в области гистогенеза крови и соединительной ткани удалось проследить основные этапы гистогенеза соединительных тканей и крови у различных животных, как в эмбриональном, так и постнатальном периодах. Выводы, сделанные им, свидетельствовали в пользу того, что все клетки крови развиваются из одного предшественника, который имеет вид «малого» лимфоцита. Им было высказано положение, что подобные предшественники, характеризующиеся чрезвычайно широкими дифференцировочными потенциалами имеются в тканях не только на эмбриональной стадии, но и во взрослом организме. Максимов впервые в отечественной науке использовал термин «стволовая клетка» [101]. Однако примерно в то же время (1907 г.) термин «stammzelle» был использован H.Schridde к недифференцированным клеткам эпителия передних отделов кишечной трубки в ходе эмбриогенеза [128]. Но, несомненно, заслугой Максимова является его предположение о стволовых клетках во взрослом организме.
Открытие ММСК костного мозга принадлежит Александру Фриденштейну и относится оно к 60-м годам 20-го века. В 1963 году группой А. Фриденштейна было показано, что после пересадки костного мозга под почечную капсулу мыши формируется костная ткань заселенная кроветворными клетками. При помещении клеток костного мозга в диффузионную камеру, клетки также формировали костную ткань, но заселения клетками крови не происходило. Благодаря полученным результатам был сделан вывод об остеогенном потенциале клеток костного мозга, в отличии, например, от клеток эпителия, и подтверждено, что остеогенные предшественники костного мозга отличаются от предшественников клеток крови [9]. Для доказательства того, что костный мозг содержит популяции клеток-предшественников костной ткани и клеток крови, был поставлен следующий эксперимент. Мышам-гибридам поколения F1 под почечную капсулу трансплантировался костный мозг родительской особи. Методом кариологического анализа было обнаружено, что образующаяся костная ткань образовывалась из клеток родительской особи, а гематопоэтическая ткань формировалась из клеток гибрида. Эти исследования подтвердили, что остеогенные и гематопоэтические клетки происходят из различных предшественников, также было показано, что гетеротопическая костная ткань самоподдерживалась и не заменялась клетками хозяина. Эти результаты позволяют классифицировать эти клетки как остеогенные стволовые клетки или ММСК [10, 87]. В последующих экспериментах было установлено, что при эксплантации клеток кроветворных и лимфоидных органов с низкой плотностью на 12-14-й день культивирования образовывались видимые невооруженным взглядом дискретные колонии фибробластоподобных клеток. Благодаря этим экспериментам удалось установить содержание этих клеток в различных органах и тканях организма в норме (2-3%), при различных патологических состояниях и различных воздействиях на организм (облучение, травма введение антигена, кровопотеря и т.д.) [52, 140]. Определяющим являлось установление клонального происхождения формирующихся колоний -колониеобразующих клеток - предшественников [12]. Показано, что во взрослом организме эти клетки находятся вне пролиферативного пула, в фазе Go и вступают в S-период, спустя 24-72 часа после эксплантации. Стромальные клетки-предшественники обладают высокими адгезивными свойствами (90% этих клеток прикрепляются ко дну культурального флакона за первые 30-60 минут после эксплантации) [54]. Фриденштейн выявил две категории остеогенных клеток - предшественников: детерминированные (в костном мозге) и индуцибельные (в мезенхимной строме внутренних органов и подкожной соединительной ткани). В дальнейшем было показано, что стромальные клетки костного мозга сохраняют свой остеогенный потенциал при длительном культивировании. Проходя около 50 удвоений численности, эти клетки сохраняли диплоидность [11]. Анализ дифференцировочных потенциалов моноклональных стромальных фибробластов костного мозга показал, что при обратной трансплантации в организм потомки одной стромальной клетки - предшественницы способны формировать костную, хрящевую, фиброзную и жировую ткани, а также ретикулярную ткань, пригодную для заселения кроветворными клетками [13]. Таким образом, было показано, что костный мозг содержит клеточную популяцию, отличающуюся от клеток гематопоэтического ряда, способную к длительному самоподдержанию и дифференцировке в ткани мезенхимного происхождения. Также было сформировано понятие о стволовых стромальных клетках кроветворной и лимфоидной тканей.
Интенсивные исследования в данном направлении продемонстрировали, что популяцию ММСК можно получить и из других тканей взрослого организма. Так появились сообщения о получении популяции клеток с подобными характеристиками из мышц, сердца, печени [98,151] кожи [144], и жира [16,161].
Методы исследований
Костный мозг 20 здоровых доноров был получен в клинике «Бьюти Плаза», методом пунктирования гребня подвздошной кости. ММСК КМ получали методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин., с последующими промывками в ФБС и лизированием в специальном буфере. Полученную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн. клеток на 1 см2.
Длительное культивирование клеток проводили путем периодического пассирования. Снятие клеток с субстрата осуществлялось с помощью 0,05 Мойого раствора трипсина-ЭДТА в течение 5-6 мин. (Gibco, США) по мере формирования полного монослоя.
Тест на жизнеспособность проводили после ферментативного снятия клеток с культурального флакона. Клетки суспендировали в физиологическом растворе, помещали в ч. Петри для окраски, добавляли эквивалентный объем 4% раствора трипанового синего, время экспозиции 5 минут. 10 мкл полученной клеточной суспензии после окраски переносили в камеру Горяева и производили оценку сразу после ферментативной обработки клеток. В пяти больших квадратах камеры подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток путем прямого микроскопического наблюдения. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле:
Морфологические особенности ММСК костного мозга в культуре Характеристику ММСК проводили визуально, с помощью фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе Leica DMIRB. В качестве основных критериев использовали размер и форму клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, гомогенность цитоплазмы и наличие ядрышек в ядре.
Митотический индекс (интенсивность митотического размножения клеток в культуре, МИ) для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста как соотношение числа митозов к общему количеству подсчитанных клеток (не менее 1000), умноженное на 1000 (в %о). МИ=(количество митозов/общее количество клеток) 100%о.
Время генерации (удвоения), интервал между следующими друг за другом делениями клеток проводили путем подсчета количества клеток в десяти выбранных и отмеченных квадратах (2x2 мм) культуральной чашки через 18, 24, 36, 48 и 60 часов. Время удвоения было рассчитано относительно первой точки подсчета (18 часов).
Через 7 дней после посева клеток (500 клеток/см ) проводился анализ на клоногенность. Клетки фиксировали и окрашивали по Гимза. Образование колоний ММСК оценивали с помощью микроскопа.
Анализ ММСК костного мозга в динамике культивирования in vitro Изучение клеточных популяций проводили путем анализа клеток в фазе логарифмического роста, окрашенных иодитом пропидия, по пяти клеточным культурам.
Клетки фиксировали 70%-м этанолом, промывали в ФБС и ресуспендировали в ФБС с добавлением 40 мкг/мл иодита пропидия (Calbiochem, США), инкубировали 1 час и анализировали методом проточной цитометрии.
