Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в Escherichia coli 11
1.2. Создание штаммов-продуцентов интерферона альфа-2Ь на основе Escherichia coli и их ферментационное культивирование 31
1.3. Выделение и очистка интерферона альфа-2Ь 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы 41
2.2. Методы 42
2.2.1. Генноинженерные методики 42
2.2.2. Ферментационное культивирование в 2-х л ферментере 46
2.2.3. Ферментационное культивирование в 30-и л ферментере 46
2.2.4. Получение телец включения 47
2.2.5. Получение грубого экстракта интерферона 47
2.2.6. Очистка интерферона на катионите SP-Toyopearl 48
2.2.7. Очистка интерферона с использованием ОФ-ВЭЖХ 48
2.2.8. Аналитические методы 48
2.2.8.1. Измерение концентрации белка 48
2.2.8.2. Постановка белкового SDS электрофореза 49
2.2.8.3. ВЭЖХ 50
2.2.8.4. Метод молекулярной гибридизации на остаточную ДНК штамма-хозяина и вектора 51
2.2.8.5. Метод ИФА на остаточные белки штамма-продуцента...55
2.2.8.6. Метод биологического тестирования активности интерферона 60
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа-F интерферона под контролем регуляторных элементов Т7-экспрессионной системы 62
3.1.1. Создание вариантов гена человеческого альфа-F интерферона с различными заменами редко встречающихся кодонов и их клонирование в векторную плазмиду рЕТ22(Ь+) 62
3.1.2. Влияние тандема терминаторов транскрипции в 3'- нетранслируемой области гена 66
3.2. Создание и ферментационное культивирование штамма- продуцента альфа-2Ь интерферона 70
3.2.1. Создание штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь70
3.2.2. Подбор условий культивирования на лабораторном 2-х л ферментере Multigen 72
3.2.3. Масштабирование ферментационного процесса на промышленном 30-и л ферментере Marubishi 77
3.3. Создание технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь 78
3.3.1. Получение грубого экстракта нативиого мономера интерферона 78
3.3.2. Хроматография на катионите SP-Toyopearl 550-С 84
3.3.3. Хроматография на полу препаративном ОФ-ВЭЖХ, ODS 87
4. Заключение 92
5. Выводы 94
6. Список литературы 96
- Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в Escherichia coli
- Материалы
- Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа-F интерферона под контролем регуляторных элементов Т7-экспрессионной системы
Введение к работе
Актуальность проблемы. С развитием молекулярной биологии и ряда ее методических приложений (генно-инженерных методик и методов жидкостной хроматографии) повышаются требования качества к продуктам, получаемым в данной области. Одним из основных примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий «рекомбинантных ДНК». Более конкретно это относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, - человеческому рекомбинантному интерферону альфа-2Ь.
Наиболее выгодным экономически является использование штаммов-продуцентов, в которых экспрессия целевого белка увеличена до количеств, измеряемых в процентах от суммарного клеточного белка (в этих случаях гетерологичный белок «складируется» в клетке в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).
Создание подобных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из которых - стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся аминокислотных кодонов, в гене, клонированном на мультикопийный экспрессионный вектор, подобная генетическая конструкция будет нежизнеспособна, или же, синтез целевого белка будет крайне низким. Другим фактором нестабильности мРНК гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно, если его экспрессия находится под контролем сильного бактериального или фагового промотора) с процессом репликации плазмидного вектора, что возможно даже при наличии теминатора транскрипции в нетранслируемой 3'-концевой области целевого гена.
Одновременно с развитием генно-инженерных технологий, повысились требования к чистоте конечной субстанции. Появились такие анализы на чистоту получаемого интерферона, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (ЛАЛ-тест). Усложнение аналитического контроля привело к принципиальным изменениям
технологий производства субстанции интерферона, т.к. применение старых технологических путей являлось не достаточным для получения высокоочищенного белка, или же, экономически невыгодным.
При суперэкспрессии гетерологичных белков в клетках Е. coli (в таких количествах, что экспрессируемый белок начинает образовывать тельца включения), бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих случаях бактериальная культура практически не растет после индуцирования синтеза целевого белка. Кроме того, в данных условиях стресса, синтезируемые в тельцах включения белки могут иметь всевозможные модификации, начиная с неотщепленного N-концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых аминокислотных остатков белка. Подобные модификации могут не удаляться различными видами гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографии (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как при модификации изменение их конформации не происходит, а изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению с нативной молекулой белка. Но при правильном подборе условий их можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а, следовательно, при их большом количестве относительно нативного белка, конечная субстанция не проходит анализ ВЭЖХ.
Было замечено, что количество и характер подобных примесей напрямую зависит от условий ферментационного культивирования штамма-продуцента интерферона, а не только от подбора условий технологии выделения.
Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции рекомбинантного белка представляет собой комплексную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные этапы.
Цели и задачи работы.
Целями работы являлись:
увеличение эффективности биосинтеза рекомбинантного интерферона бактериальными продуцентами (на примере лейкоцитарного интерферона oc-F человека);
исследование влияния условий ферментации рекомбинантных штаммов Е. coli на образование модифицированных примесей целевого белка (на примере штамма-продуцента интерферона а-2Ь человека);
исследование возможности создания технологии выделения и очистки интерферона а-2Ь биомассы штамма-продуцента с оптимальным соотношением «цена-качество».
В ходе работы были решены следующие задачи:
Созданы и клонированы варианты гена человеческого a-F интерферона с различными заменами редко встречающихся эукариотических кодонов.
Создан штамм-суперпродуцент человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.
Разработаны несколько вариантов регламента ферментации штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.
Созданы несколько вариантов технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы было подробно рассмотрено влияние редко встречающихся в E.coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного гена, представленного на мультикопийном векторе, под контролем регуляторных элементов на основе Т7 РНК-полимеразы.
Был разработан ферментационный протокол культивирования штамма-продуцента интерферона альфа-2Ь, в котором индукция синтеза интерферона осуществляется лактозой, вместо ИПТГ. Подобный подход значительно снижает себестоимость процесса ферментации. А так же позволяет получать больше количества продукта.
Было показано, что за счет оптимизации ферментационного процесса культивирования можно получать полупродукт более высокого качества, что позволяет упростить дальнейший процесс очистки интерферона, уменьшив количество хроматографических стадий, т.е. понизить себестоимость продукта.
Разработанные технологии позволили наладить рентабельное производство субстанции интерферона альфа-2Ь на базе предприятия ЗАО «Мосагроген», Москва. Получаемая субстанция интерферона альфа-2Ь используется для приготовления ветеринарных лекарственных препаратов «Миксоферон» и «Кинорон».
Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы в отечественных журналах и одно тезисное сообщение в материалах научных конференций.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изложена на 102 страницах, включая 12 рисунков и 18 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 128 источников, в том числе J_2 на русском языке.
Общая характеристика работы.
С развитием молекулярной биологии и ряда ее методических приложений (генно-инженерных методик и методов жидкостной хроматографии) повышаются требования качества к продуктам, получаемым в данной области. Одним из основных примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий «рекомбинантных ДНК». Более конкретно это относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, -человеческому рекомбинантному интерферону альфа-2Ь.
Одним из основных подходов к созданию новых промышленных продуцентов биологически активных соединений является обеспечение экспрессии гетерологичной генетической информации в клетках микроорганизмов.
В настоящее время наиболее изученной и потому представляющей как теоретический, так и практический интерес по-прежнему остается система E.coli. Разработанные методы достижения эффективной экспрессии генов в клетках этих бактерий во многом имеют практическое значение применительно и к другим организмам.
Для экспрессии клонированного гена в E.coli, как правило, используют:
увеличение числа копий гена в клетке (амплификация гена);
подстановку к структурной части чужеродного цистрона прокариотической регуляторной области, обеспечивающей его транскрипцию и трансляцию в новом организме;
стабилизацию образующейся мРНК и белкового продукта.
В ряде случаев задача оптимизации экспрессии этим и ограничивается. Однако если целевое соединение образуется в клетке в результате проявления энзиматической активности белкового продукта клонированного гена (генов, оперона/оперонов), либо при токсичности для клетки чужеродных
полипептидов, исследователям необходимо также обеспечить стабильность штамма-продуцента при хранении и культивировании.
Способы стабилизации штаммов определяются конкретными задачами биотехнологического производства и свойствами клонированных генов или оперонов.
Наиболее выгодным экономически является использование штаммов-продуцентов, в которых экспрессия целевого белка увеличена до количеств, измеряемых в процентах от суммарного клеточного белка (в этих случаях гетерологичный белок «складируется» в клетке в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).
Создание подобных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий. Для обеспечения высокого уровня синтеза белка в клетках Е. coli не всегда достаточно сильного промотора. Необходима оптимизация следующих критериев: стабильность мРНК, эффективность трансляции мРНК, ограниченность протеолиза продукта, а так же скоординированное включение аминокислот, правильность сворачивания белка и требования к пост трансляционной модификации продукта, такие как протеолитический процессинг или фосфорелирование [1].
Одним из факторов стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. Отличия во встречаемости тех или иных кодонов в разных организмах довольно значительны и являются частью эволюционного процесса общей регуляции экспрессии генов в данных организмах. Например, крайне редко встречающиеся в Е. coli аргининовые кодоны AGA, AGG (кстати, они являются часто встречаемыми для Н. sapiens) в основном, присущи белкам позднего стационара Е. coli. Подобных кодонов в Е. coli несколько (AGA, AGG - Arg; ATA - Не; ССС - Pro; СТА - Leu; GGA, GGG - Gly). При наличие редко встречающихся кодонов в гене, кодирующем гетерологичный белок, в гене, клонированном на мультикопийный экспрессионный вектор, подобная генетическая конструкция будет не жизнеспособна или же синтез целевого белка будет крайне низким, в виду созданной нестабильности мРНК.
Другим фактором нестабильности мРНК гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно экспрессирующегося под контролем сильного бактериального или фагового промотора) с процессом репликации плазмидного вектора, что происходит в
случае отсутствия теминатора транскрипции в нетранслируемой 5'-концевой области целевого гена. Показано, что экспрессия белка значительно увеличивается, если вместо одного терминатора транскрипции клонирован тандем терминаторов в нетранслируемой 5'-концевой области целевого гена.
Одновременно с развитием генно-инженерных технологий, повысились требования к аналитике конечной субстанции. Появились такие анализы на чистоту получаемого интерферона, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (ЛАЛ-тест).
Усложнение аналитического контроля привело и к принципиальным изменениям технологий производства субстанции интерферона, т.к. применение старых технологических путей являлось не достаточным для получения высокоочищенного белка. В основном, добиться прохождения большинства тестов возможно несколькими хроматографическими стадиями очистки, значительно (на порядки) снижая количества белковых, нуклеиновых и липополисахаридных примесей в очищаемой субстанции интерферона. Но, во-первых, данный процесс заведомо будет иметь низкие выходы целевого продукта. А во вторых, у подобной технологии будет высокая себестоимость, что не являлось критичным 15-20 лет назад, но в настоящее время, при появлении все новых и новых производителей субстанции интерферона и других цитокинов, имеет одно из ключевых значений. Помимо этого, полученные субстанции все равно не смогут пройти тест на чистоту по ВЭЖХ.
Показано, что при суперэкспрессии гетерологичных белков в клетках Е. coli, так что белок начинает образовывать тельца включения, бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Это видно из многочисленных статей, где приводят кривые роста - бактериальная культура практически не растет после индуцирования синтеза целевого белка. Подобные варианты с конститутивным синтезом так же отличаются низкими плотностями роста, либо вообще, не жизнеспособны. В данных условиях стресса, полученные в тельцах включения белки могут иметь всевозможные модификации, начиная с неотщепленного N-концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых аминокислотных остатков белка. Подобные модификации практически не удаляются различными видами гидрофобной и ионообменной хроматографии (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как изменение их конформации не происходит, а
изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению с нативной молекулой белка. Они так же обладают биологической активностью нативного интерферона. Но при правильном подборе условий их можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а, следовательно, при их большом количестве относительно нативного белка, конечная субстанция не проходит анализ ВЭЖХ.
Было замечено, что количество и характер подобных примесей напрямую зависит от условий ферментационного культивирования штамма-продуцента интерферона, а не только от подбора условий технологии выделения.
Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции рекомбинантного белка представляет собой комплексную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные этапы.
Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в Escherichia coli
Одним из способов повышения уровня экспрессии гетерологичных генов в E.coli является их амплификация, при этом в качестве векторов для молекулярного клонирования используют мультикопийные плазмиды. (Разработаны также экспрессионные векторные системы, в которых гетерологичные гены расположены в составе фаговых ДНК и биосинтез целевого белкового продукта индуцируется фаговой инфекцией растущих реципиентных клеток [2], однако эти векторы не получили широкого распространения.) Наибольшей популярностью пользуются векторы, имеющие СоШ-подобный репликон [3]. Описаны мутантные плазмиды, которые могут находиться в бактериальной клетке в количестве до 1000 копий при копийности исходных вариантов не более 15-20 на хромосомный эквивалент. Однако «конститутивная» амплификация, как правило, приводит к снижению жизнеспособности плазмидсодержащих бактерий.
Использование плазмидных векторов приводит в ряде случаев к нестабильности наследования рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках. Причиной структурной нестабильности может являться наличие в молекуле повторяющихся последовательностей или областей, гомологичных участкам хромосомы реципиента. Стабильность таких плазмид будет выше в клетках, дефектных по системе рекомбинации, однако эти штаммы, как правило, имеют пониженную жизнеспособность и плохо пригодны для использования в промышленных условиях.
Необходимо учитывать также возможную нестабильность наследования плазмид, обусловленную экспрессией расположенных в их составе гетерологичных генов. При необходимости обеспечения суперпродукции белка, токсичного для клеток реципиентного микроорганизма, проблема может быть решена созданием регулируемой генетической системы, обеспечивающей синтез полипептида только после накопления биомассы.
Вероятность спонтанной утраты плазмиды можно уменьшить при введении в ее состав локусов par, которые контролируют правильность распределения плазмид между образующимися при делении дочерними клетками [4]. Для стабилизации плазмид используют также локус сег плазмиды СоШ1 и некоторые другие участки геномов стабильных репликонов [5].Суммируя имеющиеся данные по клонированию гетерологичных генов в составе мультикопийных плазмид, можно заключить, что использование наиболее распространенных векторов приводит к амплификации (доза гена может составлять от нескольких десятков до тысяч копий) и, способно увеличить уровень синтеза соответствующих белков (в ряде случаев на 1-2 порядка). В то же время амплификацию, как единственный путь оптимизации, применяют для экспрессии в клетке лишь гомологичных или близкородственных генов. Для экспрессии гетерологичных генов первоначально осуществляют подстановку цистронов под контроль прокариотических регуляторных элементов. Последующую амплификацию можно осуществить, увеличивая как копийность плазмид, так и число копий гена в составе рекомбинантной молекулы ДНК, создавая опероны с повторяющимися цистронами [6].
В последнее время высокоэффективную экспрессию генов чаще обеспечивают за счет оптимизации этапов инициации транскрипции и трансляции, поэтому проблема амплифицации генов в составе мультикопийных плазмид не является столь актуальной. Имеющиеся данные показывают, что при использовании современных экспрессионных систем последующее увеличение копийности рекомбинантных плазмид в клетке не приводит к существенному возрастанию выхода целевого продукта [7].
Уже в ранних исследованиях для оптимизации транскрипции генов в E.coli осуществлялась их подстановка под контроль хорошо охарактеризованных и регулируемых прокариотических промоторов. В настоящее время имеется большой набор векторных систем, обеспечивающих возможность интеграции чужеродных фрагментов ДНК за такими регуляторными элементами, как P/acUv5, Р , Р/РР, VompF, РГГпв, Гесл, PtujB - E.coli, а также промоторами фагов X (PL, PR), Т5 (PN25, PJ5, PG2S), Т7 (РАЬ PA2, РАЗ) И др.
Широкое распространение получили также гибридные регуляторные участки. Так, часто используют гибридный промотор P/acuv5 - P/rp = Р/ас5 описана подстановка оператора лактозного оперона за конститутивным промотором гена липопротеина наружной мембраны E.coli (с образованием гибридного элемента - Pipp-Oiac) и за промотором Р5 фага Т5 (Р5-0/ас).
Материалы
TGI {supE, hsd, thi, Щас-proAB), r[traD36, proAB\ lacfi, lacZAM\5]) -хорошо известный лабораторный штамм, полученный из коллекции ВКПМ, и использованный для трансформации созданных in vitro рекомбинантныз плазмид и их последующего выделения; BL21(DE3) {dcm, ompT, hsdS(vB- mB-), gal, (DE3)) [8, 9] - этот штамм является лизогеном по ШЕЗ, который содержит ген РПТ7 под контролем P/acuvs-промотора. Данный штамм использовался в работе для экспрессии генов, находящихся под транскрипционным контролем РПТ7. Штамм BL21(DE3) получен от проф. F.W. Studier (США), за что авторы выражают ему глубокую благодарность. С600 [pPR-IFN-ctF-2] - плазмидный продуцент рекомбинантного hIFN-aF [27] из коллекции лаборатории [27]. Два этих штамма-продуцента использовались в качестве доноров плазмидных ДНК для последующей модификации клонированных в их составе эукариотических генов.
В работе использованы векторные и рекомбинантные плазмиды E.coli: pET-22b(+), "Novagen", США, (www.novagen.com);
Олигонуклеотиды. Химический синтез олигонуклеотидов, используемых в дальнейшем в качестве праимеров для проведения полимеразнои цепной реакции (PCR) осуществлялся фирмой Sintol (Москва, Россия) на коммерческой основе.
Реактивы ферментов (ДНК лигазы, рестрикционные эндонуклеазы, ДНК-полимеразы, наборы для ПЦР и получения радиоактивно-меченной ДНК) производства фирмы «Fermentas», Литва использовались согласно инструкции фирмы производителя.
Лабораторное и производственное культивирование штаммов-продуцентов. Использовали триптон и дрожжевой экстракт фирмы Difco, реактивы солей производства «Реахим», Россия, квалификация осч, IPTG - производства Serva.
Глюкоза (Dextrose monohydrate) - производства фирмы Maize Products, Индия, Лактоза (Lactose monohydrate) - Danone GMBH, Германия. Реактивы для выделения интерферона. Реактивы солей - производства Serva, гуанидин гидрохлорид - Fluka, США, 2-меркаптоэтанол - Sigma, США. Получение ТВ осуществлялось на следующем оборудовании: сепарация биомассы на сепараторе ОМ-1, Россия. Дезинтеграция биомассы проводилась на проточном дезинтеграторе (френч-пресс), Россия. Центрифугирование осадка ТВ осуществляли на центрифуге Beckman J2-21, на роторе JA-10 (6x500 мл) - 7 т об/мин (8670 g), 20 мин, +4С.
Для очистки интерферона использовали следующие ультра фильтрационные установки, хроматографические колонки и сорбенты. Осветление раствора S-сульфоната интерферона осуществляли на аппарате для тупиковой фильтрации УСФ-293-7 с использованием фильтров КФБЖ, ЦНИИ Целлюлозо-бумажной промышленности, Волжск, Россия и ММК-0,65 «Владипор», Владимир, Россия. Диафильтрацию проводили с использованием рулонного мембранного элемента МИФИЛ ПС-3,0-10М (10 к Да), ООО «Мифил», Беларусь. Хроматографическую очистку интерферона проводили на колонке 5,8 X 64 см, Pharmacia, упакованной сорбентом SPoyopearl 550-С, Tosoh Bioscience, Япония. Концентрирование хроматографических фракций интерферона осуществляли на ультра фильтрационной системе Pellicone 5 kDa, Millipore. Реактивы для аналитических методов. Использовались реактивы производства Sigma, США. Оборудование для аналитических методов. Постановку белкового SDS-ПАА гель электрофореза осуществляли на приборах для электрофореза Protein И, Biorad и VE-4, Хеликон в соответствии с инструкциями производителей. Для ВЭЖХ использовали оборудование фирмы Gilson, США. В качестве хроматографической колонки использовали стальную колонку, 250x4,6 мм, С18,300 А, 5 мкм, Jupiter, Phenomenex.
Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа-F интерферона под контролем регуляторных элементов Т7-экспрессионной системы
Человеческий интерферон альфа-F является одним из человеческих интерферонов класса альфа (лейкоцитарные). В своем природном варианте ген интерферона a-F содержит редко встречающиеся для Е. coli кодоны -аргининовые - 6 кодонов AGA и 4 кодона AGG, а так же относительно редко встречающиеся пролиновые (2 - ССС), изолейциновые (2 - AUA), лейциновые (1 - CUА) и глициновые (2 - GGA) кодоны (См. рис 2 и табл 8). Одним из факторов стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена [92]Существует большое количество данных, когда замена редко встречающихся в Е. coli аргининовых кодонов AGA/AGG в гене, кодирующем гетерологичный белок, приводила или к многократному увеличению его продукции (от нескольких до десятков раз), или к супер экспрессии данного белка от 20% до 50% от суммарного клеточного белка [92 - 95]. В Е. coli эти кодоны встречаются со следующими частотами - AGA - 2,8 на тысячу кодонов, AGG - 1,7 на тысячу, при максимальной встречаемости аргининовых кодонов -CGU, CGC - 20,6. В то время, как, например, у человека - 11,5 и 11,3 соответственно (максимальное - CGG - 11,6). В природном гене IFN-aF находится 10 таких кодонов (6 % от всех кодонов в гене). Наличие тандемов AGA или AGG кодонов, с большой вероятностью приводит к фреймшифтингу [97]. Подобных тандемов в гене интерферона альфа-F два - AGGAGG - 37-42 пар оснований и 490-495 п.о., при общем размере гена - 500 п.о. Одиночные аргининовые кодоны встречаются исключительно как AGA. См рисунок 2.Методом ПЦР в природном гене интерферона были заменены редко встречающиеся для Е. coli кодоны, на часто встречающиеся. В ходе исследовательской работы были созданы пять вариантов гена интерферона альфа-F. Гены клонированы на рЕТ22Ь(+). Полученными плазмидными ДНК был трансформирован штамм TG1. После отбора клонов методом рестрикционного анализа, соответствие последовательности генов теоретически заданной последовательности, было подтверждено сиквенированием ДНК методом Сэнгера. Характер нуклеотидных замен и их количество для разных генов интерферона альфа-F, представлены в таблицах 9 и 10.Полученными плазмидами с различными вариантами гена, был трансформирован штамм BL21(DE3). Трансформанты (в тех вариантах, где они были) культивировали в пробирках, в V = 5 мл жидкой среды LB // 100 мкг/мл ампициллина, при 37 С и 240 rpm, до значений оптической плотности 0,5-0,6 и индуцировали 1 мМ IPTG, после чего культивировали еще 2 часа, и определяли количество интерферона методом белкового SDS электрофореза и методом биологического тестирования. Результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11. Данные белкового электрофореза и биотеста штаммов BL21(DE3)[pET22b(+)-IFN-aIphaF-/. Где і - варианты гена. Данные биотеста нормированы на OD культуры.
Вариант № 1 представлял собой природный ген альфа-F интерферона, без изменения кодонов, клонированный на рЕТ22Ь(+) с плазмиды pPRGATG-CI-IFN-F. Проверка клонов показала очень низкий процент вставки. По рестрикционному анализу был отобран всего один клон из 100. Трансформанты штамма BL21(DE3) после шщукции, демонстрировали полное отсутствие продукта. Как показал последующий сиквенс гена с отобранного клона, в ходе амплификации произошла мутация (вставка лишнего нуклеотида в середине гена), повлекшая за собой сдвиг рамки считывания, благодаря чему, вероятно, и удалось клонировать ген. Варианты № 3 и № 4 не давали клонов после трансформации ими штамма BL21(DE3). Характеристики роста индуцированных штаммов с вариантами гена № 2 и № 5 были примерно одинаковыми (ODKOHe4HM 1,5), но у штамма с вариантом Гена № 6 (у КОТОрОГО Заменены ВСе реДКО ВСТречаЮЩИеСЯ КОДОНЫ) СШК0Нечная была в 3 раза выше ( 4,5).
Как видно из таблицы № 10, жизнеспособными оказались штаммы с вариантами ген, у которых есть замены аргининовых кодонов в З -области (R, 484-486: AGA - CGT и тандем R-R, 490-495: AGGAGG - CGTCGT), что, похоже, является обязательным условием выживаемости конструкции. Количество остальных редко встречающихся кодонов в гене интерферона альфа-F влияет на выход продукта и характеристики роста культуры. Чем их больше, тем хуже рост и меньше нарабатывается белка. Возможно, большое количество редко встречающихся в Е. coli кодонов (клонированные гены представлены на мультикопийной плазмиде, с регуляцией экспрессии под контролем сильного фагового промотора), приводит к истощению всего пула соответствующих аминоацилированных тРНК, в первую очередь - продуктов генов argWU, и тем самым - в дефекте трансляции каких-либо жизненно важных белков E.coli, содержащих в структуре своих генов аналогичные редкие AGG/AGA 8 -КОДОНЫ.
