Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Антигены холерного вибриона 14
ГЛАВА 2. Методы контроля синтеза антигенов в биотехнологии производства химических вакцин 25
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
ГЛАВА 4. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕРОТИПОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ V. CHOLERAEQI С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ. 46
4.1. Сравнительное исследование специфической активности диагностических холерных адсорбированных сывороток ИнабаиОгава 47
4.2. Получение и характеристика мышиных поликлональных антител
к препаратам О-антигенов V. cholerae 01 Инаба и Огава 58
ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ГИБРИДОМНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К СПЕЦИФИЧЕСКИМ ЭПИТОПАМ V. CHOLERAE 01 ИНАБАИОГАВА 64
5.1. Создание банка гибридом и стратегия отбора позитивных клонов 65
5.2. Изучение стабильности антителопродукции гибридом in vitro и in vivo 69
5.3. Иммунохимические свойства моноклональных антител 74
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ТИФА В ПРОЦЕССЕ ПРОИЗВОДСТВА И КОНТРОЛЯ КОНЕЧНОГО ПРОДУКТА ХОЛЕРНОЙ БИВАЛЕНТНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ 85
6.1. Изучение биокинетики синтеза О-антигена при масштабируемом
культивировании производственных штаммов холерного вибриона
глубинным методом 87
6.1.1. Изучение синтеза О-антигена при масштабируемом культивировании производственных штаммов холерного вибриона в ДИА с применением поликлональных антител 88
6.1.2. Изучение синтеза О-антигена при масштабируемом культивировании производственных штаммов холерного вибриона в ДИА с применением панели МКА 96
6.2. Анализ содержания О-антигена на этапах получения полуфабрикатов и
готовых лекарственных форм холерной бивалентной химической
таблетированной вакцины 100
ГЛАВА 7. ТЕХНОЛОГИЧНОСТЬ И ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЫШИНЫХ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРИ ПРОЦЕССАХ ПРОИЗВОДСТВА И КОНТРОЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ХОЛЕРЫ 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 115
ВЫВОДЫ 126
ЛИТЕРАТУРА. 128
- Антигены холерного вибриона
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Создание банка гибридом и стратегия отбора позитивных клонов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Продолжающаяся более 40 лет седьмая пандемия холеры наносит серьезный социально-экономический ущерб многим странам мира, включая Россию (97,105, 109, 111,147,169). Более того, прогноз по этой инфекции на ближайший период остается неблагоприятным в России и других странах СНГ в связи с реальной возможностью ее завоза из-за рубежа, ростом миграционной активности населения, связанной с туризмом, развитием рыночной экономики, увеличением трансграничных перевозок, а также участившихся случаев межнациональных конфликтов, стихийных бедствий, техногенных катастроф и террористических актов (98, 103, 105,112).
Возбудителями этой опасной инфекции являются токсигенные штаммы Vibrio choleras 01 и 0139 серогрупп, последние из которых были обнаружены в начале 90-х гг. прошлого века в Индии и Бангладеш (162,163, 164, 227, 253). Однако, в настоящее время на эндемичных территориях эпидемиологическая ситуация характеризуется преобладанием заболеваний холерой, связанной с V. cholerae 01 (20,37,96,169,188).
Средства вакцинопрофилактики и методы диагностики этой инфекции продолжают совершенствоваться. В последние годы разработан ряд современных высокоэффективных холерных коммерческих (45) и экспериментальных (30,37,38, 45, 91, 99, 113, 114, 147, 217, 234, 240) генодиагностических тест-систем и иммунодиагностических препаратов (1, 2, 10, 72,279). Вместе с тем, коммерческие диагностические сыворотки для реакции агглютинации остаются по-прежнему востребованными практическими специалистами, в том числе, для контроля синтеза основных иммуногенов, входящих в состав холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Однако биотехнологические особенности их приготовления обуславливают все присущие поликлональным адсорбированным сывороткам недостатки, в первую очередь связанные с нестандартностью серий, значительным количеством фоновых неспецифических реакций, низкой активностью после проведения адсорбции и др.
Одним из путей улучшения качества таких препаратов, как и совершенствования технологии приготовления специфических иммунореагентов в
7 целом, является разработка биотехнологических приемов получения поликлональных моноспецифических антител, менее гетерогенных по классу, подклассу, специфичности, титру и аффинности иммуноглобулинов по сравнению с адсорбированными сыворотками, путем иммунизации биопродуцентов химически изолированными антигенами (2, 141, 142, 172, 230). Среди известных в настоящее время антигенов наиболее перспективными с позиций специфичности представляются препараты липополисахарида (ЛПС), на вариабельности О-боковых цепей которого основана внутри- и межвидовая классификация большинства грамотрицательных бактерий, в том числе возбудителя холеры (85, 254, 286, 265), что подтверждено и генетическими исследованиями (244). В то же время неясно - являются ли серологически идентичными субстанциями химически выделенные и термостабильные О-антигены К chokrae Инаба и Огава, какие структурные компоненты последних обеспечивают кросс-реактивность гомологичных антител и вовлечены в дифференциацию холерных вибрионов на отдельные серотипы в иммуносерологических тестах, в том числе, реакции агглютинации. Вышеизложенное диктует необходимость более глубокого изучения антигенной структуры и иммунохимических свойств серотипоспецифических антигенов представителей V. choterae Ol серо группы на молекулярном уровне, что невозможно без применения в качестве тонкого инструмента панели разноэпитопных моноклональных антител (МКА), обладающих высокой активностью, строгой специфичностью и стандартностью (9, 13, 78, 102, 159, 202, 209, 214, 221, 280), в совокупности с современными методами иммунной биотехнологии, иммунодиагностики, молекулярной иммунологии и иммуноанализа (13, 14, 35, 78, 118, 136). Более того, применение гибридомной биотехнологии и технологии получения мышиных поликлональных моноспецифических антител, стандартность которых обеспечивается использованием в качестве биопродуцентов инбредных мышей определенного генотипа, снизит затраты, связанные с основными этапами производства профилактических и диагностических препаратов против холеры.
В РосНИПЧИ «Микроб» налажено производство холерной бивалентной химической таблетированной вакцины, одним из важных компонентов которой является О-антиген (42, 58, 59, 60). Однако контроль его биосинтеза и содержания
8 в процессе производства осуществляется малочувствительными по современным представлениям методами - реакцией иммунодиффузии (РИД) (248) и реакцией непрямой гемагглютинации (РНГА) (76), не позволяющими в динамике определить уровень продукции этой антигенной субстанции, и, что очень важно, подтвердить сохранение эпитопнои специфичности О-антигена в процессе производства и контроля активности холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Эту задачу можно решить с помощью технически простых, но высокочувствительных вариантов ТИФА с использованием МКА.
Вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящей работы.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - разработка биотехнологических аспектов получения поли- и моноклональных антител к специфическим антигенам V. cholerae 01 серотипов Инаба и Огава и конструирование на их основе современных высокочувствительных вариантов ТИФА для контроля биосинтеза О-антигена на основных стадиях производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Провести сравнительное изучение иммунохимических свойств диагностических агглютинирующих адсорбированных холерных сывороток Инаба и Огава, применяемых при серотипировании возбудителя холеры в реакции агглютинации, с использованием современных методов иммуноанализа для идентификации конкретных антигенных субстанций холерных вибрионов и термостабильных О-антигенов, обеспечивающих специфичность и кросс-реактивность указанных реагентов.
Разработать технологию получения препаративных количеств поликлональных моноспецифических антител с применением химически выделенных препаратов ЛПС V. cholerae Ol серотипов Инаба и Огава, пригодных для последующего конструирования на их основе экспериментальных иммуноглобулиновых тест-систем.
С помощью гибридомной биотехнологии получить стабильные антителопродуцирующие гибридные клеточные линии, синтезирующие МКА к
9 отдельным эпитопам антигенов, ответственных за дифференциацию штаммов V. cholerae 01 на серотипы Инаба и Огава в иммуносерологических тестах.
Провести сравнительное исследование иммунохимических свойств препаратов химически выделенных и термостабильных О-антигенов V. cholerae 01 с использованием поли- и моноклональных антител.
На основе полученных поли- и моноклональных антител разработать варианты ТИФА, в том числе его дот-вариант, перспективные для применения в качестве современных высокочувствительных стандартных методов контроля биосинтеза О-антигена на основных стадиях производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины и провести сравнение их эффективности с регламентированными методами.
С помощью сконструированных в настоящем исследовании иммуноглобулиновых тест-систем провести изучение динамики синтеза О-антигена и ассоциированных с ним отдельных эпитопов на этапах глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона 569В и М-41, а также других стадиях приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
Получены стабильные линии гибридом, синтезирующие МКА к специфическим эпитопам К cholerae 01 Инаба и Огава. С использованием оригинальной панели поли- и моноклональных антител впервые определена локализация и структура отдельных иммунореактивных компонентов препаратов химически выделенных и термостабильных О-антигенов V. cholerae 01 серотипов Инаба и Огава, выявлены конкретные антигенные детерминанты, определяющие серологическую дифференциацию вибрионов 01 серогруппы на указанные серотипы. Изучены особенности антигенной композиции препаратов термостабильных О-антигенов V. cholerae Ol с выявлением специфических и кросс-реактивных компонентов. Впервые разработаны высокочувствительные иммунологические методы контроля, позволяющие в динамике на ранних этапах аппаратного культивирования производственных штаммов холерного вибриона количественно проводить оценку продукции О-антигена, а также осуществлять контроль качества конечного
10 продукта холерной бивалентной химической таблетированной вакцины. Использование иммуноферментных тест-систем на основе разноэпитопных МКА впервые дало возможность осуществить мониторинг за синтезом О-антигена в процессе масштабируемого культивирования производственных штаммов V.cholerae 569В и М-41 на уровне индивидуального эпитопа.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ состоит в создании на основе поликлональных антител к препаратам О-антигенов V. cholerae 01 Инаба и Огава и разноэпитопных МКА экспериментальной иммуноферментной тест-системы для быстрого и эффективного контроля в ТИФА и ДИА продукции О-антигенов на основных этапах приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.
Разработанные экспериментальные иммуноферментные тест-системы апробированы в технологической линии; производства холерной бивалентной химической таблетированной вакцины и находятся на стадии внедрения с оформлением изменений в соответствующую нормативную документацию.
По материалам диссертационного исследования составлены «Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания липополисахарида Vibrio cholerae 01 серогруппы на этапах экспериментального производства химической холерной вакцины», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 20 июня 1997 г.), утвержденные директором института.
Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций по общей микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб».
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Кросс-реактивность и относительно низкая специфичность диагностических холерных адсорбированных сывороток связана с их гетерогенностью и присутствием антител к белкам наружной мембраны с м.м. 30±2 - 93±2 кДа,
общих для холерных вибрионов 01 серогруппы серотипов Инаба и Огава биоваров классического и Эль Тор,
Препараты химически выделенных и полученных кипячением термостабильных О-антигенов не являются идентичными антигенными субстанциями за счет принципиальной разницы в структурной композиции составляющих их полипептидных и углеводных компонентов.
Применение в качестве иммунизирующего агента выделенных регламентированными методами О-антигенов V. ckolerae Ol серотипов Инаба и Огава обеспечивает выработку у инбредных мышей линии BALB/c поликлональных моноспецифических антител в высоких титрах, превосходящих по специфичности и активности коммерческие диагностические холерные адсорбированные сыворотки.
Разработаны и оптимизированы основные биотехнологические аспекты получения препаративных количеств мышиных поли- и моноклональных типоспецифических антител, перспективных для конструирования на их основе современных высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для выявления О-антигена — не менее 0,01-0,15 мг/мл в полуфабрикате независимо от модификации иммуноанализа, 0,06-0,25 мг/мл (в ДИА) и 0,3-0,5 мкг/мл (в ТИФА) в готовой лекарственной форме, соответственно.
Экспериментальные иммуноферментные тест-системы на основе мышиных поли- и моноклональных антител дают возможность более эффективно, чем регламентированные методы контроля (РИД и РНГА с холерной адсорбированной О-сывороткой) определять содержание и активность О-антигена на всех основных стадиях производства и приготовления холерной бивалентной химической таблетированной вакцины, что указывает на перспективу их применения в качестве современных высокочувствительных методов контроля биосинтеза данного антигена и позволит снизить себестоимость выпускаемой продукции за счет большей рентабельности и технологичности процесса приготовления указанных тест-систем.
Созданные моноклональные типоспецифические иммуноферментные тест-системы пригодны для мониторинга за активностью и экспрессией основных
12 протективных эпитопов О-антигена, одного из компонентов выпускаемого в РосНИПЧИ «Микроб» профилактического препарата против холеры, с целью повышения его содержания в готовой лекарственной форме и, следовательно, улучшения качества холерной бивалентной химической таблетированной вакцины.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ, Материалы диссертационной работы были представлены на:
Международной конференции Академии Естествознания «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1996;
4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов, Бишкек, Кыргызстан, 1997;
Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997;
Юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии Минобороны России, Киров, 1998;
Второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1998;
Совещании проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону, 2002;
VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003;
4-ой межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 2003;
Итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2003, 2004;
VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях», Волгоград, 2005.
13 ПУБЛИКАЦИИ.
По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 289 источников, из них зарубеїкньїх — 133, Объем диссертации составляет 156 страниц машинописного текста, включая 13 таблиц и 17 рисунков.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Антигены холерного вибриона
Многолетними исследованиями показана сложность антигенной структуры холерных вибрионов. Антигены, представляющие собой белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и сложные комплексы этих веществ, делятся на две большие группы: структурные, из которых строятся клеточные структуры, и функциональные, выполняющие в клетке определенные биохимические функции (5,6,17,216,218).
Как известно, холерные вибрионы обладают термостабильными соматическими О-антигенами, термолабильным жгутиковым Н-антигеном, а также группой неспецифических антигенов. О-антиген обладает видовой и типовой специфичностью (5,216).
Первые шаги в изучении антигенного строения холерных вибрионов были сделаны в начале прошлого века Т. Kabeshima (211, 212), который показал существование двух серологических типов холерных вибрионов — Инаба и Огава и обнаружил в холерных вибрионах серовароспецифические антигены. С помощью сывороток против серовароспецифических антигенов он разделил холерные вибрионы на два серовара: I серовар - «оригинальный» (Инаба) и II серовар -"вариант" (Огава). К. Nobechi (245) подтвердил наличие двух сероваров холерных вибрионов и выявил Ш серовар - «промежуточный» (Хикошима) (5, 245). W. Burrows et al (175) провели детальный анализ антигенов холерных вибрионов и показали наличие 13 компонентов О-антигена, которые были обозначены буквами латинского алфавита от А до М. Основными антигенными О-факторами оказались А, В и С. Фактор А содержался во всех агглютинирующихся 01 сывороткой вибрионах и не обнаруживался у НАГ-вибрионов. Он является основным группоспецифическим О-антигеном истинного холерного вибриона и может в нем присутствовать один, но в большинстве случаев в ассоциации с В или С, которые являются типоспецифическими. Антигенная комбинация А и В факторов соответствует серологическому типу Огава, комбинация А и С факторов определяет серотип Инаба. Тип Гикошима соответствует О-антигенной формуле ABC. R. Sakazaki и К. Tamura показали, что О-антигенные различия вибрионов Огава и Инаба являются скорее количественными, чем качественными (255). Установлена возможность перехода серотипа Огава в серотип Инаба in vitro и in vivo (84). Современные исследователи также считают, что различия среди подтипов (серотипов) в значительной степени количественные, Огава штаммы производят А и В антигены и очень незначительное количество С, в то время как штаммы Инаба производят только А и С антигены (216). Подтип Гикошима содержит все три фактора, реагирующие с Инаба и Огава антисыворотками. Подтип Гикошима редок и непостоянен и не признан некоторыми авторами, которые обозначили бы культуры как Инаба или Огава, в зависимости от того, какая сыворотка дает наибольшую реакцию (261). В настоящее время серотип В рассматривают как вариант серотипа Огава (267,279).
Материалы и методы
Экспериментальную работу проводили на панели микроорганизмов, включающей: 36 штаммов V. cholerae ОІ серогруппы, 22 штамма К cholerae 0139 серогруппы, 3 штамма V. cholerae не 01, не 0139 - 169-68, Р-918, Р-1114; 3 других представителя рода Vibrio, в том числе 1 штамм V. parahaemolyticits, 1 - V. alginolyticus, 1 — V. paracholerae. Также в работе были использованы еще 11 штаммов условнолатогенных микроорганизмов: 2 — Salmonella typhis 4-5. paratyphi, 3 - Shigella sonnei, 4— S.Jlexneri, 10 - Escherichia coli, 4 - Staphylococcus aureus, 2;" — Proteus vulgaris, 1 — Aeromonas, 3 —- Pseudomonas, полученных из Государственной Коллекции Патогенных Бактерий «Микроб».
Выращивание штаммов V. cholerae проводили на агаре Хоттингера, рН 7,6 при температуре 37 С в течение 16-18 ч, остальных микроорганизмов - на той же среде при рН 7,2 и температуре 37 С в течение 48 ч. Культивирование производственных штаммов V. cholerae 569В, М-41 и КМ-76 проводили в реакторе РЗРП-6/05 (Россия) объемом 250 л в бульоне из триптического гидролизата казеина при аэрации с канамицином (для штамма КМ-76) и подкормкой глюкозой и аммиаком в течение 10 -11 ч.
Предварительно обеззараженные взвеси бактерий в концентрации 1х109 м.клУмл, приготовленные по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, использовали для постановки ТИФА, ДНА, иммунизации животных и в концентрации 5х1010 м.клУмл -для проведения ПАГЭ - SDS. 3.2. Антигены
Термостабильные О-антигены V. cholerae обоих серотипов, приготовленные согласно требованиям регламента № 1312-03 (120), были любезно предоставлены канд. мед. наук Т. В. Аленкиной. Препараты химически выделенных О-антигенов из штаммов V. cholerae М-41 серотипа Огава и 569 В серотипа Инаба, экстрагированные насыщенным раствором сульфата аммония (58), любезно предоставлены канд. мед, наук О.В. Громовой.
Все вышеназванные препараты использовались для иммунизации животных, в ТИФА, ДИА, ПАГЭ-SDS и иммуноблоттинге.
Создание банка гибридом и стратегия отбора позитивных клонов
Согласно литературным данным, иммунизация биомоделей препаратами экстрагированных химическими методами О-антигенов V. cholerae 01 стимулирует выработку гомологичных антител в высоких титрах (160). Действительно, применение нами для обработки мышей BALB/c химически выделенных препаратов О-антигена из штаммов V. cholerae 569В и М-41 позволило получить высокоактивные моноспецифические антисыворотки (гл. 4.2). Однако гибридизация с использованием спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных химически изолированными препаратами О-антигена, не всегда приводит к получению гибридом-продуцентов МКА требуемой специфичности. Так, Л.П. Алексеевой (9) сообщалось, что при использовании в качестве иммуногена препаратов ЛПС Инаба была получена панель МКА, некоторые из которых вступали в реакцию только с вибрионами серовара Огава, а другие узнавали ограниченное количество штаммов серотипа Инаба (20 %) в реакции агглютинации, т.е. отличались относительно низкой специфической активностью. Согласно современным представлениям, это может быть связано с потерей части специфических эпитопов в процессе экстракции, при которой обнажаются консервативные участки молекулы ЛПС, что ведет к преимущественной выработке перекрестнореагирующих Ig. Так, при иммунизации ЛПС Е. coli 0157 были получены МКА, перекрестнореагирующие с Citrobacter freundii, Salmonella urbana и V. cholerae Ol Инаба (221). Более того, известно о получении панели МКА, направленных к детерминантам серотипов Огава и Инаба, большинство из которых оказались кросс-реактивными и демонстрировали перекрест со штаммами Brucella abortus и Yersinia enterocolitica 09 в реакции слайд-агглютинации (209). Хотя группой ученых под руководством В. Gustafsson была получена панель МКА к ЛПС V. cholerae серотипов Инаба и Огава, они не были детально охарактеризованы, а изучение их специфичности проводилось только на исходном препарате (92), что не позволяет в полной мере оценить специфичность генерированных моноклональных иммуноглобулинов и косвенно свидетельствует об их невысокой диагностической значимости. Таким образом, многие исследователи сообщают о сложностях получения высокоактивных МКА к серотипоспецифическим детерминантам V. cholerae Ol, особенно серотипа Инаба. Указанные трудности могут быть связаны также с низкой частотой экспонирования большинства антигенных детерминант компонента Инаба на поверхности вибрионов (9), а также с наличием у ЛПС холерных вибрионов иммунодоминантного эпитопа, общего для серотипов Инаба и Огава, в организацию которого вовлечены структуры кора и О-специфического полисахарида или О-антигена (31).
