Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Иммунодефицитные состояния. Иммунотропные лекарственные средства, их классификация. 10
1.2. Современные представления о пептидных биорегуляторах. Химико-биологические характеристики, свойства, получение и применение 17
1.2.1. Химический состав пептидных биорегуляторов 17
1.2.2. Биологические свойства пептидных биорегуляторов 20
1.2.3. Механизмы действия пептидных биорегуляторов 25
1.2.4. Способы получения и применения пептидных биорегуляторов 29
1.3. Биологически активные факторы лимфатических узлов (АФЛ) и 35
лечебные препараты на их основе
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Предварительная оценка качества сырья 54
3.2. Выделение пептидных фракций лимфатических узлов и 54
определение их биологической активности
3.2.1. Фракционирование экстракта брыжеечных лимфатических узлов 58
3.3. Оценка иммунобиологической активности активной фракции
лимфатических узлов на модели азатиоприновой иммуносупрессии 66
3.3.1. Изучение влияния АФЛ-2 на показатели макрофагального звена
иммунного ответа относительно иммуносупрессии, вызванной 66
азатиоприном
3.3.2 Влияние АФЛ-2 на функциональное состояние гуморального иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии 69
3.3.3. Исследование функциональной активности клеточного звена иммунного ответа при введении АФЛ-2 71
3.3.4. Влияние АФЛ-2 на активность антигенспецифических Т-супрессоров антителообразования 73
3.3.5. Влияние АФЛ-2 на морфофункциональное состояние соматических лимфатических узлов мышей в условиях иммунодепрессии. 75
3.4. Нейротропная активность АФЛ-2 на фоне иммунодефицитного состояния, вызванного азатиоприном. 92
3.5. Определение качества и безопасности АФЛ-2 95
3.5.1. Сублимационное высушивание при атмосферном давлении биорегулятора, полученного из лимфатических узлов. 95
3.5.2. Анализ физико-химических свойств и состава биорегулятора 98
3.5.3. Оценка микробиологических и токсикологических показателей биорегулятора 101
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
ВЫВОДЫ 120
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121
ПРИЛОЖЕНИЯ 141
- Иммунодефицитные состояния. Иммунотропные лекарственные средства, их классификация.
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Предварительная оценка качества сырья
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время актуальность проблемы
восстановления иммунологических нарушений с помощью
* иммунокорригирующих средств несомненна, так как почти любое заболевание,
как правило, сопровождается развитием иммунодефинитных состояний.
Имеющиеся нарушения в организме человека возникают в результате
воздействия различных факторов, в том числе воздействие микробных агентов,
применение фармакологических препаратов, таких как антибиотики,
кортикостероиды, цитостатики, используемые при лечении воспалительных,
онкологических и других заболеваний. Это обусловлено снижением
иммунологической реактивности организма современного человека в целом и,
как следствие, повышением острой и хронической заболеваемости, связанной с
условно-патогенными микроорганизмами [139,144].
t Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы - создание
иммуностимуляторов на основе эндогенных биологически активных веществ.
* Из всей совокупности биологически активных веществ в настоящее время
большое внимание привлекают регуляторные пептиды, содержащиеся в
различных тканях организма и принимающие участие в межклеточном
взаимодействии [26, 65, 149]. К настоящему времени подобные по природе, но
отличающиеся по функциональной активности пептиды выделены практически «
из всех органов и тканей: они нетоксичны, применяются в небольших дозах и обладают высокой биологической и лечебной активностью.
Важную роль в качестве продуцентов биологически активных пептидов играют органы иммунной системы, которые, следует отметить, относят к отходам основного производства. Тимус, селезенка и лимфатические узлы
* убойных животных на сегодняшний день являются одними из перспективных и
дешевых источников биологически активных веществ.
На сегодняшний день достаточно хорошо изучены пептидные препараты из тимуса, костного мозга, селезенки, применяемые как препараты
б медицинского назначения [9, 37, 78, 81, 87, 95, 96, 142]. Представляет интерес изучение пептидных препаратов, выделенных и из лимфоузлов, так как лимфатические узлы, которые условно относят к периферическим органам иммунной системы, играют не менее важную роль в развитии иммунологических реакций, чем центральные органы этой системы. В них происходит не только пассивный процесс фильтрации антигена, но и имеет место активное метаболическое действие, приводящее к запуску и реализации всех последующих этапов иммуногенеза.
С развитием нового научно-прикладного направления — фармаконутрициологии возникла необходимость разработки новых технологий биологически активных регуляторов, по внешнему виду относящихся к фармпрепаратам, а по содержанию и возможности массового применения - к пище [91, 123].
Исходя из вышесказанного, представлялось важным выделение биологически активных веществ с совокупными свойствами эндогенных биостимуляторов из органов иммунной системы животных (в частности из лимфатических узлов).
Цели и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилась разработка биологически активного средства на основе регуляторных пептидов из лимфатических узлов крупного рогатого скота и выявление возможности его использования для коррекции иммунодефицитных состояний.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Выделить пептидные фракции из лимфатических узлов крупного рогатого скота и исследовать их биологическую активность.
Изучить влияние нового биорегулятора на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа экспериментальных животных на модели иммунодепрессивного состояния.
Оценить нейротропную активность полученного биологически активного средства.
4. Оценить качество и безопасность биорегулятора по
микробиологическим и токсикологическим показателям.
5. Разработать технологическую схему получения биорегулятора.
Научная новизна работы.
Впервые на основе биологически активных факторов лимфатических узлов крупного рогатого скота получен новый биорегулятор (АФЛ-2).
Впервые были оценены иммуномодулирующие свойства биологически активного средства «АФЛ-2». Изучено органотропное действие цитомединов, входящих в состав «АФЛ-2», при оценке морфофункционального состояния лимфатических узлов экспериментальных животных. Установлена нейротропная активность «АФЛ-2» на лабораторных животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии.
Создана технология получения сублимированного порошка биологически активного средства «АФЛ-2».
Новизна исследования подтверждена приоритетной справкой на заявку № 2003114957 от 21 мая 2003 г. о выдаче патента РФ «Способ получения иммуномодулятора».
Практическое значение.
Полученные данные позволяют рекомендовать иммуномодулятор «АФЛ-2» в качестве биологически активной добавки к пище и для создания новых продуктов лечебно-профилактического назначения. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Выделены пептидные фракции из лимфатических узлов крупного
рогатого скота.
2. АФЛ-2 восстанавливает показатели клеточно-опосредованных реакций
иммунной системы, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета,
функции нервной системы при экспериментальной азатиоприновой
иммуносупрессии.
3. Исследована токсичность, безопасность и биологическая активность
биорегулятора в зависимости от условий и сроков хранения в соответствии с
нормативными требованиями.
4. Разработана технология получения сублимированной формы
биорегулятора АФЛ-2.
Апробация работы: основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
ежегодных научно-практических конференциях Восточно-Сибирского государственного технологического университета по секции "Химия биологически активных веществ" (Улан-Удэ, 2000,2001, 2003);
научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ 2001; 2003);
Международной конференции молодых ученых "От фундаментальной науки к новым технологиям" (Москва-Тверь, 2001);
Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах», (Улан-Удэ, 2002);
2-й Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, 2002);
1-м Международном Конгрессе «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва, 2002);
7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003);
на 1 съезде лимфологов России (Москва, 2003);
Международной научной конференции "Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных", посвященной 90-летию профессора В.Р. Филиппова (Улан-Удэ, 2003);
Международной научной конференции «Медицинские, социальные и экономические проблемы сохранения здоровья населения» (Турция, г. Анталия, 2003);
Международной научной конференции «Актуальные проблемы морфологии» (Красноярск, 2003).
Иммунодефицитные состояния. Иммунотропные лекарственные средства, их классификация
Иммунологическая реактивность является наиболее лабильной функцией организма, изменяющейся под влиянием многих факторов. Некоторые изменения иммунной системы проявляются гораздо раньше, чем развиваются клинически выраженные признаки заболевания. Л.Н. Фонталин (1989) полагает, что многим болезням предшествует неявно выраженная неполноценность иммунной системы - врожденная или обусловленная факторами окружающей среды. Эта неполноценность предрасполагает к возникновению патологического процесса в ходе которого формируется истинный вторичный иммунодефицит. Термином "иммунодефициты" обозначают нарушения нормального иммунного статуса, которые обусловлены дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа [22,47,144].
Различают первичные или врожденные (генетические) и вторичные или приобретенные иммунодефициты. Врожденные иммунодефицитные синдромы и заболевания представляют собой довольно редкое явление. Причинами врожденных иммунодефицитов может явиться удвоение хромосом, точечные мутации, дефект ферментов обмена нуклеиновых кислот, генетически обусловленные нарушения мембран, повреждение генома в эмбриональном периоде и др. Большинство первичных иммунодефицитных состояний (ИДС) являются наследуемыми состояниями. Преобладающий тип наследования аутосомно-рецессивный, при этом многие классические формы первичных ИДС наследуются сцепленно с Х-хромосомой, поэтому в структуре первичных ИДС до 80% составляют мальчики [117]. Клиническая манифестация первичных ИДС начинается с расширения антигенной нагрузки в раннем детском возрасте. При этом клиническая картина первичного иммунодефицита определяется уровнем поражения иммунной системы, т.е. конкретным синдромом и составляющими факторами: условиями жизни, состоянием местного иммунитета, наследственностью, сопутствующими патологическими состояниями со стороны других органов и систем, адаптивными возможностями организма, ранней диагностикой иммунодефицитного состояния и лечебными мероприятиями [47].
В классификации первичных ИДС используется понятие синдром. При названии синдрома за основу принимается конкретный лабораторный показатель - определяемый дефект, например, гипер-IgM синдром; этиологический фактор, например: синдром золотистого стафилококка; фамилии авторов, впервые описавшие данный синдром или фамилия больного, на примере которого впервые описывался синдром, например: синдром Вискотта-Олдрича, синдром Джоба [47].
Вторичные иммунодефицитные состояния (ВИД) - это приобретённые нарушения в иммунной системе, которые формируются при воздействии на организм неблагоприятных, иммуносупрессирующих факторов.
Единой общепринятой классификации ВИД на сегодня не существует. Имеются классификации, в основу которых положен этиологический фактор , продолжительность по времени, например, транзиторные - длительность до 6 месяцев и системные - длительность более 6 месяцев [108, 144]. В отличие от первичных иммунодефицитов вторичная иммунная недостаточность не связана с генетическим блоком какого-либо звена иммунитета, а развивается под воздействием самых разнообразных повреждающих факторов. ВИД проявляются при старении, эмоциональном и физическом стрессе, патологических процессах, сопровождающихся лимфопенией и потерей белка (ожоги, эксудативные энтеропатии и т.д.), после воздействия радиации, назначения цитостатиков, являются результатом антибиотикотерапии, рентгенотерапии, сопровождают хронические вирусные и бактериальные инфекции, возникают при различных злокачественных новообразованиях, количественном и качественном нарушении питания, вызываются кортикостероидной терапией, обширными хирургическими операциями и чрезмерными физическими нагрузками, возникают в результате множественных травм, воздействия ядохимикатов и других факторов внешней среды [31, 33, 41,108, 116]. Выделяют следующие особенности вторичных иммунодефицитных состояний:
Материалы и методы исследований
Фракционирование лимфатических узлов молодняка КРС проводили по модифицированной нами схеме ВЛ.Ариона [7]. Фракционирование гомогената лимфатических узлов крупного рогатого скота проводили методом поэтапного удаления белка из фракций. Схема выделения фракций из лимфатических узлов крупного рогатого скота сводилась к следующему: ткань лимфатических узлов гомогенизировали на холоду, а затем гомогенат подвергали автолизу.
Автолизат центрифугировали при 1273,8 сек"1, супернатант нагревали до 80 С, осадок удаляли. Полученный супернатант - активная фракция лимфатических узлов - 2 (АФЛ-2). К супернатанту добавляли ацетон (охлажденный до -20С), образовавшийся осадок собирали и высушивали. Ацетоновый порошок — АФЛ-3. Ацетоновый порошок растворяли в трис-HCl буфере, осаждали сульфатом аммония (25-50% насыщения). Обессоленный осадок - АФЛ-4. Осадок растворяли в трис-HCl буфере, подвергали ультрафильтрации через мембранный фильтр. Полученный фильтрат - АФЛ-5.
Содержание белка в полученных фракциях определяли по методу Лоури. Метод основан на сочетании двух цветных реакций - биуретовой - на пептидную связь и реакции Фолина - на ароматические аминокислоты [199]. Содержание белка, определяемого по Лоури, является показателем количественного содержания не только белков, но и небелковых фракций разной степени сложности, этот показатель хорошо коррелирует с биологической активностью исследуемых субстратов и может служить в качестве показателя концентрации биологически активных веществ.
Микробиологическое исследование биорегулятора
Изучение микробиологических показателей проводилось в соответствии с «Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов» № 5061-89, МЗ Л94. Оценку микробиологических показателей проводили в соответствии с СанПиНом 2.3.2.560-96, контроль согласно следующим ГОСТам: ГОСТ 10444.15-94; ГОСТ 10444.2-93; ГОСТ Р50480-93; ГОСТ Р50474-93; ГОСТ 10444.12-88.
Реакция активного розеткообразования (Еа -РОК)
Опыт проводили на морских свинках-самцах с массой 150-250 г. [153J. У животных под наркозом извлекали тимус и гомогенизировали его в среде 199.
Затем готовили суспензию с концентрацией 20 106 мл и добавляли 0,5% трипсин в соотношении 6:1 на 10 мин. Суспензию клеток дважды отмывали центрифугированием в течении 10 мин при 169,8 сек"1. Далее в 1-ю пробирку (норма) вносили 0,1 мл суспензии интактных тимоцитов, во 2-ю (контроль) и 3-ю (опыт) - 0,1 мл суспензии тимоцитов, обработанных трипсином в концентрациях 2 106 мл. В 3-ю пробирку добавляли исследуемое вещество. Затем во все пробирки добавляли по 0,1 мл 1% - ой суспензии свежих отмытых эритроцитов кролика в среде 199. Взвесь клеток перемешивали и центрифугировали 5 мин. при 84,9 сек"1. Клетки ресуспендировали и в камере Горяева подсчитывали процентное содержание розеткообразующих клеток [14].
Гистоморфологические методы исследования лимфатических узлов
Мышей умерщвляли дислокацией шейных позвонков. Лимфатические узлы извлекали спустя 5 дней после введения азатиоприна и на 8-е сутки после введения АФЛ. Материал фиксировали в 10%-ом нейтральном формалине с последующей стандартной спиртовой проводкой и заливкой в парафин по общепринятой методике [3]. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм на микротоме, которые окрашивали гематоксилин-эозином по ван Гизону для изучения изменений структуры органа. Подсчет клеток проводили на срезах, окрашенных азуром-11-эозином, при помощи микроскопа Биолам при увеличении объектива - 90 под масляной иммерсией по методу Стефанова СБ. с использованием 25-ти узловой морфометрической сетки (с шагом 10 мкм), вмонтированной в окуляр (9х) микроскопа. Плотность расположения клеток определяли по методу Стефанова СБ. [121] на единице площади гистологического среза, равной 880 мкм.
Клеточный состав определяли в следующих структурных компонентах лимфатического узла: в корковом веществе, герминативных центрах, паракортикальной зоне, медулярных тяжах, лимфатических синусах и мозговом веществе. Подсчитывали следующие виды клеток: стромальные (фибробласты, фиброциты, ретикулярные), лимфоидные (средние и малые лимфоциты, плазматические). Малодифференцированные (большие лимфоциты, бластные формы), а также макрофаги, клетки в состоянии деструкции и митотического деления. Учитывались только те клетки, которые приходились на узловые точки сетки. В каждом структурном компоненте дифференцировали по 500 клеток. Затем вычисляли среднее процентное содержание клеточных элементов и ошибки.
Предварительная оценка качества сырья
На этапе предварительной оценки качества сырья установлено, что брыжеечные лимфатические узлы крупного рогатого скота имеют темно-желтый или коричневый цвет. Лимфатические узлы собирали у здоровых животных, в соответствии с требованиями ГОСТ 21192-75. Оценка микробиологических показателей сырья показала, что общая и патогенная микрофлора в сырье не превышала предельно допустимых концентраций, предусмотренных гигиеническими нормативами по микробиологическим показателям (табл.3.1.1).
Обозначения: "-" колонии не обнаружены
Выделение пептидных фракций лимфатических узлов и определение их биологической активности
Пептидные фракции лимфатических узлов выделены методом поэтапного удаления высокомолекулярных белков из гомогената, включающего последовательные этапы гомогенизации, экстракции, автолиза, осаждения ацетоном, сульфатом аммония, растворения и ультрафильтрации. В результате получены 4 фракции АФЛ (активная фракция лимфатических узлов): АФЛ-2; АФЛ-3; АФЛ-4; АФЛ-5. Количественное содержание выделенных фракций лимфатических узлов представлено в таблице 3.2.1, из которой видно, что наибольший выход биологически активных веществ во фракции АФЛ-2.
Фракции лимфатических узлов Выход фракции в мг из 1 кг лимфатических узлов
Учитывая, что макрофаги, первыми включаясь в процесс формирования клона иммунокомпетентных клеток-эффекторов, в значительной степени определяют величину развиваемой иммунной реакции, биологическую активность фракций лимфатических узлов исследовали по реакции фагоцитарной активности макрофагов в отношении Staphyllococcus aureus на фоне азатиоприновой иммуносупрессии in vitro (табл. 3.2.2.).
Как следует из таблицы 3.2.2, введение в культуру клеток азатиоприна вызывало ингибицию активности и интенсивности фагоцитоза на 45,0 % и 40,6 %, соответственно, по сравнению с данными в интактной группе. Внесение в культуральную среду ПМ с бактериальной культурой Staph, aureus исследуемых фракций по-разному отражалось на фагоцитарной активности макрофагов. Внесение фракции АФЛ-2 в концентрации 1 и 0,1 мг/мл восстанавливало функциональную активность ПМ до уровня показателей фагоцитоза интактных макрофагов, при этом активность фагоцитоза увеличивалась на 38.8% и 47%, соответственно, а интенсивность возрастала лишь при использовании концентрации 0,1 мг/мл на 44% по сравнению с уровнем супрессии.
Аналогичный эффект вызывала фракция АФЛ-5 при использовании концентрации 0,1 мг/мл, показатели фагоцитоза в данном случае увеличивались на 41% (активность) и 33% (интенсивность). При этом установлена зависимость регуляции функций фагоцитоза макрофагов от концентрации испытуемых фракций. Оптимальной явилась концентрация 0,1 мг/мл. Также выявлено, что фракции АФЛ-3 и АФЛ-4 оказывали незначительное стимулирующее влияние на фагоцитарную активность ПМ, находящихся в состоянии иммуносупрессии. Таким образом, в результате проведенного эксперимента нами выявлена наибольшая активность фракций АФЛ-2 и АФЛ-5. Процесс получения второй фракции имеет некоторые преимущества: он менее трудоемок, исключает воздействие агрессивных химических реагентов, позволяет получать больший выход биологически активных веществ, что более целесообразно при создании биологически активных добавок. Так, из 100 г лимфатических узлов можно получить предложенным способом 280 мл АФЛ -2 (в пересчете на сухое вещество — 3,5 г).
Похожие диссертации на Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности
