Введение к работе
Актуальность темы. Перспективность получения и применения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) – стволовых клеток взрослого организма, определяется их основными свойствами и признаками. Во-первых, достоверно установлено, что ММСК стабильно самообновляются в клонах без анеуплоидии, генетической нестабильности и малигнизации. При этом они способны пролиферировать в культуре длительное время, формируя стабильные диплоидные клеточные линии. Во – вторых, при индукции к дифференцировке они способны дифференцироваться в нескольких направлениях, в пределах тканевых производных одного зародышевого листка, образуя in vitro клетки других тканей (Савченкова И.П., 2009; Minguell J. J., 2001; Pittenger M. F., 2004; Yamanaka, S., 2012). ММСК обладают способностью заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем, в том числе для изучения вирусов.
Известно, что в ветеринарной и медицинской биотехнологии существует необходимость в разработке эффективных способов культивирования и накопления вирусов на чувствительных клеточных культурах, обеспечивающих их размножение in vitro. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, малигнизированны, и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим использование для этих целей ММСК является актуальным. Легкость их выделения и доступность биологического материала (подкожный жир, костный мозг, кожа), делает их, на сегодняшний момент, наиболее перспективной клеточной системой (Савченкова И.П., 2009).
Имеются сообщения о выделении ММСК из костного мозга (КМ) крупного рогатого скота (КРС) (Donofrio G. et al., 2005; Bosnakovski et al., 2005;), свиней (Bosch P. et al., 2006, Ringeje J. At al., 2002., Moscoso I. et al., 2005, Comiteab P. et al., 2010), лошадей (Arnhold et. al., 2007, Fortier LA et. al., 1998) и овец (McCarty et al., 2009), а также из подкожно-жировой ткани свиньи (Ringe et al., 2002; Wang et al., 2008, Williams K.J. et al.,2008). Во всех перечисленных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов (Аг) в зависимости от условий выделения и культивирования. Это свидетельствует о том, что свойства и признаки ММСК сельскохозяйственных животных изучены недостаточно.
В связи с перспективностью использования ММСК в биотехнологии целью наших исследований было выделение из тканей взрослых особей КРС клеток с фенотипом, подобным ММСК, и изучение их свойств и признаков in vitro.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
оптимизировать существующие и разработать новые методы выделения ММСК из КМ и жировой ткани (ЖТ) КРС;
охарактеризовать ММСК КРС в культуре;
провести анализ экспрессии поверхностных Аг - маркеров фенотипа ММСК на клетках, выделенных из КМ и ЖТ КРС;
изучить потенции полученных ММСК КРС, выделенных из КМ (ММСК КМ КРС) и ЖТ (ММСК ЖТ КРС) к направленной дифференцировке в клетки костной и жировой тканей in vitro;
оценить чувствительность культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам: инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС, диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), герпеса КРС типа 4 (BHV-4), энцефаломиокардита мышей (ЕМС), парагриппа-3 (ПГ-3), ринопневмонии лошадей (РПЛ);
депонировать культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН);
Научная новизна. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Впервые в России выделены культуры ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, которые депонированы в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН). Научная новизна подтверждена получением приоритетов на 2 патента: «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крупного рогатого скота (medulla ossium Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Волкова И.М., Викторова Е.В., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149133/10 от 02.12.2011 г; «Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани крупного рогатого скота (textus adiposus Bos taurus), для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии», Викторова Е.В., Волкова И.М., Савченкова И.П., Гулюкин М.И., в ФИПС № 2011149132/10 от 02.12.2011 г. Впервые охарактеризованы морфологические свойства ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС. Проведен анализ Аг, экспрессия которых характерна для ММСК. Впервые изучены потенции ММСК, выделенных из КМ и ЖТ КРС, формировать клетки костной и жировой тканей in vitro. Дана оценка чувствительности клеточных культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС к вирусам ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.
Практическая значимость. Оптимизированы способы получения биологического материала для выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС. Оптимизированы методы выделения ММСК из КМ и ЖТ КРС, которые могут использоваться для получения и наращивания культур ММСК КРС и последующего их применения в клеточной биотехнологии. На основе экспериментальных данных разработаны Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.П. Савченкова, Л.К. Эрнст, М.И. Гулюкин, Е.В. Викторова // М.: «Спутник +» - 2010. – 23с. - ISBN 978-5-9973-0926-8.
В Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ГНУ ВИЭВ им Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) депонированы культуры ММСК КМ КРС (№ 79) и ММСК ЖТ КРС (№ 80). Получены данные по чувствительности культур ММСК КМ КРС и ММСК ЖТ КРС, к вирусам: ИРТ, ВД-БС, BHV-4, ЕМС, ПГ-3, РПЛ.
Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно выполнял все этапы работы, в т.ч. анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.
В выполнении отдельных этапов работы принимали участие м.н.с. Волкова И.М., к.б.н. Кулешов К.В., в. н. сотрудник лаборатории вирусологии к.в.н. Шуляк А.Ф., за что автор им искренне благодарен.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, (Москва, 1-2 июня 2011); II-й Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 15-18 ноября 2011); XII-ой Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 11 апреля 2012); Международной Интернет-конференции «Биотехнология взгляд в будущее», (Казань, 17-19 апреля 2012); Международной научно-практической конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Украина, Алушта, АР Крым, 21-25 мая 2012).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, 6 статей в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста, которые включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список литературы состоит из 177 библиографических источников, в т.ч. 146 на иностранных языках. Работа иллюстрируется 11-ю таблицами, 14-ю рисунками и содержит 6 страниц приложений.
