Введение к работе
1.1 Актуальность темы
В настоящее время культура клеток стала одним из основных инструментов биотехнологии, цитологии, вирусологии, генетики, иммунологии и других бурно развивающихся биологических наук. Клеточные культуры являются важным объектом в изучении механизмов канцерогенеза и днфференцировки клеток. Именно метод культуры клеток привел в свое время к бурному развитию вирусологии и до сих пор остается одним из ее "золотых стандартов". Клеточные линии являются незаменимой экспериментальной моделью и широко используются при проведении вирусологических исследований и в биотехнологии при производстве противовирусных вакцин.
Сегодня известно уже более 450 линий клеток, полученных от пресноводных, проходных и морских видов рыб. Благодаря большому разнообразию полученных клеточных линий рыб и их применению в вирусологии, обнаружено около половины из открытых на сегодня почти 400 ихтиовирусов. Новые клеточные линии позволяют обнаруживать и новые вирусы. От осетровых рыб получено 23 клеточные линии. Их сравнительную немногочисленность можно объяснить тем, что интерес к разведению этих рыб в мировой аквакультуре возник сравнительно недавно - примерно 30 лет назад и обусловлен как угрозой исчезновения ряда ценных видов осетровых под влиянием неблагоприятного антропогенного воздействия, так и увеличением спроса на икру и мясо этих рыб. Одновременно с интенсификацией осетроводства появляются новые вирусные болезни, которые представляют серьезную угрозу и наносят ощутимый ущерб аквакультуре осетровых в мире [И.С. Щелкунов, 2000]. Для своевременного выявления возбудителей болезней необходимо иметь набор клеточных линий, чувствительных к широкому спектру вирусов.
Большинство известных в настоящее время культур клеток осетровых рыб получены в США. Среди них наиболее распространены культуры клеток белого осетра, Acipenser transmontamis, чувствительные к таким опасным вирусным агентам, как ирндовирус белого осетра (WSIV) [R.P. Hedrick et al.,
1985], герпесвирусы белого осетра первого и второго типов (WSHV-1, WSHV-2) [R.P. Hedrick et al., 1991; L.R. Watson et al., 1995] и др. В нашей стране постоянные клеточные линии осетровых рыб были впервые получены в 1995 г. во ВНИИ пресноводного рыбного хозяйства [Т.И. Щелкунова и др. 1997], однако не все из этих линий клеток охарактеризованы. Это касается и постоянной линии клеток SSO-3 пула почки, печени и селезенки сеголетков сибирского осетра. В то же время, лишь всесторонняя характеристика культуры предоставляет возможность сравнить ее с другими клеточными линиями, позволяя сделать обоснованный выбор в пользу той или иной линии, наиболее полно отвечающий целям и задачам планируемых работ. В конечном итоге только исчерпывающая характеристика линии клеток дает ей шанс на депонирование в специализированных национальных и международных депозитариях - коллекциях клеточных культур. Поэтому изучение и описание свойств полученных клеточных линий являются актуальными.
1.2 Цель и задачи исследований
Целью данной работы было охарактеризовать постоянную клеточную линию SSO-3 пула паренхиматозных органов сибирского осетра, Acipemer baerii и оценить возможность ее использования для изучения и диагностики вирусных болезней рыб.
Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить цитоморфологическую и кариологическую характеристики
постоянной клеточной линии SSO-3;
определить влияние параметров культивирования на пролиферативную активность клеток постоянной линии SSO-3;
- подтвердить видовую принадлежность постоянной линии клеток
SSO-3;
- определить чувствительность полученной клеточной линии к
распространенным в России и за рубежом вирусам рыб разных
таксономических групп;
оценить возможность использования постоянной линии клеток SSO-3 в экспериментальных и диагностических работах с ихтиовирусами;
провести паспортизацию клеточной линии SSO-3 и депонировать ее в Российской коллекции клеточных культур.
1.3 Научная новизна
Изучены морфологические, культуральные, кариологические и другие свойства постоянной клеточной линии SSO-3.
Определена чувствительность клеточной линии SSO-3 к широко распространенным вирусам рыб из семейств карповых, лососевых, осетровых, угревых и щуковых.
Установлена возможность использования клеточной линии SSO-3 для серологической идентификации вирусов рыб и выявления вируснейтрализующих антител в сыворотке крови рыб.
Получен патент "Постоянная линия клеток SSO-3 пула паренхиматозных органов сибирского осетра, Acipenser baerii" № 2348688, зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 10 марта 2009 г.
1.4 Практическая значимость
Штамм постоянной линии клеток SSO-3 пула паренхиматозных органов сибирского осетра паспортизирован и депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции клеточных культур при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН).
1.5 Основные положения, выносимые на защиту:
постоянная линия клеток SSO-3 пула паренхиматозных органов происходящая от сибирского осетра, имеющая эпителиоподобную морфологию и обладающая высокой пластичностью, позволяющей ей расти в широком диапазоне меняющихся условий среды;
оптимизированные технологические параметры культивирования клеточной линии SSO-3, позволяющие достигать концентрации клеток 1500±37тыс./см3;
- оценка чувствительности постоянной линии клеток SSO-3 пула
паренхиматозных органов сибирского осетра к вирусам пяти разных
семейств рыб;
- результаты исследований по использованию постоянной линии клеток
SSO-3 пула паренхиматозных органов сибирского осетра для
диагностических и экспериментальных работ с ихтиовирусами.
1.6 Апробация и публикация результатов работы
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на заседаниях Ученого Совета ФГУП "ВНИИ пресноводного рыбного хозяйства" в 2006-2009 г.г.; Международной научно-практической конференции "Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов - 2" (17-20 июля 2007 г., г. Борок); Третьей двусторонней российско-американской конференции "Здоровье водных и морских животных" (12-20 июля 2009 г., г. Шефердстаун, США); Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию "ВНИТИБП" "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (9-Ю декабря 2009 г., г. Щелково); Материалы диссертации представлены на Научно-практической конференции "Проблемы ихтиопатологии в начале XXI века" (7-11 декабря 2009 г., г. Санкт-Петербург).
Основные результаты диссертации опубликованы в 11 научных работах, в том числе: 4 статьи в журналах по перечню ВАК, 1 статья в центральном зарубежном журнале, 2 статьи в сборнике научных трудов, 3 статьи - в материалах научных конференций, 1 патент.
1.7 Личный вклад
Основная часть диссертационной работы выполнена автором самостоятельно.
Исследования проведены в лаборатории ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ". ПЦР-тестирование клеточной линии SSO-3 на наличие микоплазм проводили на базе лаборатории "Бактериология" ГНУ ВНИИВВиМ (к.в.н. И.Ю. Егорова). Видовую идентичность культуры подтверждали молекулярно-генетическими методами в Центре молекулярно-
генетической идентификации (руководитель к.б.н. В.А. Барминцев) Научного органа СИТЕС в Российской Федерации в отношении осетровых видов рыб.
Автор выражает признательность всем исполнителям и участникам этих работ.
1.8 Объем и структура работы
