Введение к работе
Актуальность проблемы. Фактор Некроза Опухолей (Tumor Necrosis Factor,TNF) -плейотропный провоспалительный и иммунорегуляторный цитокин, играющий важную роль в защите организма от внутриклеточных патогенов и организации структуры вторичных лимфоидных органов. Нарушение регуляции и избыточная продукция TNF приводят к развитию ряда аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, а в острых случаях может приводить к симптомам септического шока. Фармакологическая блокировка TNF оказалась эффективной при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний и была одобрена для применения в клинике. Однако, системная инактивация TNF является симптоматическим лечением и сопряжена с рядом осложнений, таких как повышенная восприимчивость к инфекциям, реактивация туберкулеза и некоторыми другими. Для преодоления побочных эффектов анти-TNF терапии ведется разработка альтернативных подходов к ингибированию действия TNF, в том числе и предложенная нашей лабораторией стратегия блокировки TNF из определенных клеточных источников.
Исследования нашей лаборатории показали, что некоторые биологические функции TNF зависят от вида клеток-продуцентов и их локализации (Grivennikov S, Immunity, 2005; Tumanov et al. Blood, 2010; Kruglov, JI, 2011). Так, блокирование цитокина, производимого отдельным типом клеток, или в определенных тканях может нейтрализовать преимущественно негативные эффекты TNF, сохраняя его защитные функции. Вместе с тем, роль индивидуальных клеточных источников TNF в патогенезе аутоиммунных заболеваний по-прежнему до конца не понята. Более того, на настоящий момент далеко не все подтипы клеток, экспрессирующих TNF, хорошо охарактеризованы, и не исключено, что существуют новые типы клеток - как иммунных, так и стромальных - продуцирующих TNF в норме и при различных патологиях.
Чтобы подробно охарактеризовать экспрессию TNF на молекулярном уровне, клеточном уровне и на уровне целого организма, нами получены и изучены 2 линии новых репортерных мышей, экспрессирующих два разных флуоресцентых белка. Во-первых, в сотрудничестве с Д. Чудаковым и С. Лукьяновым (Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) получены мыши, в которых транскрипция TNF сопряжена с экспрессией дальнекрасного флуоресцентного белка Katushka (TNF-2A-Kat, сокращенно Kat-TNF). Во-вторых, в сотрудничестве с И. Гореном и А. Вайсманом, (Медицинский факултьтет Университета им. Иохана Гутенберга в Майнце), были получены трансгенные мышиные модели, в которых
синтез TNF сопряжен с экспрессией зеленого флоресцентного белка eGFP (del RP23EGfp3126), сокращенно eGFP-TNF. Эти мыши были предоставлены нам для изучения.
В обоих случаях флуоресцентные белки являются репортерами синтеза TNF. Однако в eGFP-TNF репортерных мышах намеренно был ослаблен контроль экспрессии мРНК зеленого репортерного белка (по сравнению с TNF) и такая система, согласно дизайну, отражает продукцию «патогенного» TNF в отсутствие супрессорных механизмов (Kontoyiannis D, Immunity, 1999). Такую eGFP-TNF репортерную систему, отражающую продукцию «патогенного» TNF, было интересно изучить одновременно с репортерной системой Kat-TNF, которая содержит все регуляторные элементы и является физиологически корректной. Для этого линии мышей были скрещены друг с другом (сокращенное название гибридной линии Kat*eGFP-TNF).Оказалось, что репортерные белки eGFP и Katushka в Kat*eGFP-TNF мышах, когда синтезируются в одной клетке, не влияют на экспрессию друг друга (контроль репортерных мышей только с eGFP-TNF трансгеном не приведен в рамках этой работы). Благодаря этому была получена уникальная линия двойных репортерных мышей, которая отражает разные аспекты экспрессии TNF.
В предыдущих вариантах TNF-репортерных мышей использовались другие, менее совершенные, типы меток и методы детекции сигнала. Так, в линии мышей CAT-TNF (Beutler, PNAS, 1992) экспрессия TNF определялась по активности хлорамфеникол-трансферазы в гомогенатах тканей. В этом случае невозможно проанализировать экспрессию TNF на уровне отдельных клеток, и неприменимы микроскопические методы анализа. При биолюминесцентной детекции в TNF-Luc модели (Kravchenko, Science, 2008), в свою очередь, достигается меньшее разрешение, нежели чем при флуоресцентных методах анализа. Использование генетически запрограммированной флуоресцентной метки позволяет сортировать популяции живых клеток, помеченных флуорофором, и анализировать фенотип TNF-продуцентов на уровне одной клетки ex vivo. При помощи микроскопических методов in vivo можно локализовать помеченные клетки внутри органа, проследить их динамику и межклеточные взаимодействия в тканях живых экспериментальных животных.
Таким образом, нами были получены и/или охарактеризованы новые животные модели для детального изучения роли TNF, производимого отдельными типами клеток, в норме и при патологиях на молекулярном, клеточном и организменном уровнях. Подобные модели в перспективе применимы и для разработки/тестирования нового поколения ингибиторов TNF.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение и/или характеристика новых линий TNF-репортерных мышей с генетически-запрограммированной флуоресцентной меткой, экспрессируемой совместно с TNF. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Получение и характеристика новой линии репортерных мышей Kat-TNF, где экспрессия TNF сопровождается экспрессией красного флуоресцентного белка Katushka. Характеристика двойной репортерной линии мышей Kat*eGFP-TNF, в которой есть еще один маркер экспрессии TNF - зеленый флуоресцентный белок eGFP.
-
Анализ соответствия экспрессии флуоресцентных меток TNF-продукции в иммуноцитах репортерных мышей в ответ на TNF-индуцирующий стимул in vitro, а именно, изучение экспрессии флуоресцентных маркеров и TNF в миелоидных клетках после стимуляции липополисахаридом (ЛПС) и в лимфоцитах после стимуляции форбол-12-миристил-13-ацетатом (ФМА) совместно с иономицином.
-
Анализ транскрипционной регуляции и экспрессии TNF, закодированного трансгенной вставкой Kat-TNF, и красного флуоресцентного белка, в первичных культурах макрофагов из Kat-TNF линии мышей.
-
Анализ применимости флуоресцентной репортерной системы Kat-TNF для изучения экспрессии TNF in vivo в моделях септического шока, индуцированного ЛПС, аутоиммунного гепатита, индуцированного конканавалином - А (Кон А) и при экспериментальном энцефаломиелите - мышиной модели рассеянного склероза.
-
Анализ экспрессии TNF, красного и зеленого репортерных белков в лимфоидных органах из наивных неиммунизованных Kat*GFP-TNF мышей.
Научная новизна работы. В ходе этой работы была получена и охарактеризована новая уникальная линия генетически модифицированных мышей Kat-TNF, в геном которых методом трансгенеза была интегрирована репортерная конструкция, программирующая параллельную экспрессию TNF и красного флуоресцентного белка Katushka. В состав конструкции для получения линии мышей Kat-TNF включены все известные регуляторные элементы гена TNF, в том числе последовательность самого гена TNF с энхансерным элементом в 3-м интроне и З'-нетранслируемой областью, что обеспечивает сохранение правильной регуляции трансгена. Белок Katushka обладает уникальными спектральными характеристиками }^х=588нм и Хеш =633нм (Shcherbo, Nat.Methods, 2007) , длины волн возбуждения и эмиссии этого белка попадают в «оптическое окно», благоприятное для проникновения флуоресценции сквозь живые ткани (630-1100 нм). Следует отметить, что на момент создания Kat-TNF -репортерной модели была опубликована только одна трансгенная линия мышей, созданная с использованием белка Katushka (Dieguez-HurtadoR, Genesis, 2011).
Одновременно и независимо коллегами из Университета им. Йохана Гутенберга в Майнце, была получена другая трансгенная TNF-репортерная линия мышей eGFP-TNF, в которой экспрессия TNF сопряжена с экспрессией зеленого флуоресцентного белка с улучшенными спектральными характеристиками. В случае eGFP-TNF мышей использовалась другая
конструкция на основе искусственной бактериальной хромосомы (bacterial artificial chromosome, ВАС). Особенностью этой конструкции является то, что экспрессия eGFP регулируется только промоторной областью TNF и в ней отсутствуют важные регуляторные элементы - AU-богатые участки, расположенные в 3' -нетранслируемой области гена TNF.
В результате скрещивания Kat-TNF и eGFP-TNF была получена еще одна линия двойных репортер ных мышей Kat* eGFP-TNF, которая отчасти представляет собой пример комплементации двух трансгенов.
Две созданные модели представляют собой первый пример использования флуоресцентного белка для мечения TNF-экспрессирующих клеток. Использование флуоресцентной метки является перспективным подходом для выявления экспрессии TNF на уровне одной клетки, позволяющим осуществлять всесторонний анализ с использованием современных флуоресцентных методов.
В работе по характеристике Kat-TNF и Kat* eGFP-TNF мышей было показано, что экспрессия флуоресцентных белков соответствует экспрессии TNF. Таким образом, впервые становится возможным с большой точностью и разрешением определять клетки, экспрессирующие TNF в ответ на различные стимулы in vitro и in vivo. Совместно с доктором Ф.Сиффриным из Лаборатории иммунодинамики в центральной нервной системе, Медицинского Университета в Майнце, при помощи Kat-TNF репортерных мышей удалось наблюдать TNF-продуценты в инфильтратах спинного мозга в модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в живых экспериментальных животных.
При анализе двойных репортерных мышей была обнаружена выраженная базальная экспрессия eGFP в иммуноцитах из наивных, неиммунизованных мышей, указывающая на корректное функционирование промотора гена TNF в составе eGFP-TNF конструкции, при нарушенной регуляции AU-богатыми участками. Таким образом, Kat*eGFP-TNF мыши представляют собой первый пример флуоресцентной репортерной системы с высокой чувствительностью к транскрипции гена TNF in vivo.
В результате, полученные модели (каждая из которых имеет свои особенности) являются не имеющим аналогов инструментом для изучения регуляции биосинтеза и биологических функции TNF в норме и при патологиях с использованием современных методов флуоресцентного анализа. При помощи этих моделей удалось обнаружить конститутивную экспрессию циоткина Т-клетками в пейеровых бляшках кишечника.
Научно-практическая ценность. Модели TNF-репортерных мышей, охарактеризованные в данной работе, могут быть в дальнейшем использованы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии TNF с применением современных методов флуоресцентного анализа.
В линии Kat-TNF мышей методами проточной цитофлуориметрии с высокой точностью можно определить фенотип TNF-экспрессирующих клеточных субпопуляций in vitro и в условиях модели ЛПС-токсичности in vivo. Более того, линия Kat-TNF репортерных мышей была положительно охарактеризована для in vivo микроскопии нервной системы в условиях модели экспериментального энцефаломиелита . Таким образом, применение Kat-TNF мышей в других моделях TNF-зависимых заболеваний (коллаген-индуцированный артрит, колит, индуцированный CD4 CD45RB ' Т-клетками и др.) позволит определить фенотип TNF-экспрессирующих клеток, проследить за их миграцией и межклеточными взаимодействиями in vivo, и установить роль этих клеток в патогенезе заболеваний. Методы проточной цитофлуориметрии так же позволяют выделять высокоочищенные субпопуляции жизнеспособных TNF-экспрессирующих клеток для последующего транскриптомного анализа.
Результатом отсутствия регуляторных AU-богатых элементов в конструкции для получения eGFP-TNF репортерной модели стало то, что клетки, в которых транскрипция TNF в норме незначительна (или даже отсутствует), экспрессируют детектируемые уровни зеленого, репортерного для TNF белка. Такая модель представляет собой интерес для чувствительного поиска новых источников TNF в наивных неиммунизованных мышах - эти клетки могут оказаться важными для развития патологии. С другой стороны, транскрипция гена TNF не означает экспрессию цитокина этими клетками. Характеристика синтеза TNF eGFP клетками является фундаментальной задачей для будущих работ.
Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном коллоквиуме Лаборатории молекулярной иммунологии и Лаборатории иммунорегуляции при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук. Результаты работы были представлены на 13-ом международном TNF конгрессе, « TNF 2011», Хиого, Япония, 2011.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, которые соответствую требованиям, предъявляемым Высшей аттестационной комиссией.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( глав),
раздела «Материалы и Методы» ( глав), результатов и обсуждения ( глав), заключения и
выводов. Диссертация изложена на странице машинописного текста, содержит
