Введение к работе
Актуальность проблемы
На экспоненциальной стадии рост клеток E. coli прямо зависит от количества рибосом на клетку (Saito et. al., 1994) и масса рибосом составляет примерно 30 - 40% от массы клетки. Для биогенеза рибосом клетка тратит существенную часть ресурсов. Рибосома - сложно организованный супрамолекулярный комплекс, состоящий из трех молекул рРНК и 55 молекул белка; 21 белок и одна 16S рРНК входят в состав малой 30S субчастицы.
При биогенезе прокариотических 70S рибосом происходит раздельная сборка двух субчастиц. Определяющую роль в самосборке 30S субчастицы играют белки, которые первыми связываются с 16S рРНК (S4, S7, S8, S15), что приводит к формированию т. н. «структурного остова» малой субчастицы.
Синтез многих рибосомных (р-) белков сбалансирован с рРНК. Саито и коллегами (Saito et. al, 1994) был предложен механизм регуляции по типу обратной связи, когда избыток р- белка ингибирует трансляцию собственной мРНК. Это справедливо, в том числе и для стрептомицинового (str-) оперона, регулируемого белком S7 (рис. 2).
Основные работы по изучению механизмов регуляции экспрессии str-оперона были проведены для E. coli, данные для других бактерий немногочисленны. Аллен (Allen et al, 2004) сравнил регуляцию для двух оперонов Vibrio cholerae. Оказалось, что механизмы не универсальны не только для типа, но даже для класса гамма протеобактерий; например, отличаются для Pseudomonas aeruginosa. Сравнение структуры генов L5 для P. aeruginosa и E. coli показало, что потенциальные участки взаимодействия с S8 спектиномицинового (spc-) оперона P. aeruginosa и E. coli не могут иметь однотипную вторичную структуру (Allen et al, 2004).
В связи с этим, исследование универсальности механизмов регуляции экспрессии оперонов р-белков эубактерий, особенно для ключевых белков сборки рибосом, является крайне актуальной задачей современной молекулярной биологии. Наиболее интересны опероны, кодирующие белки, которые первыми связываются с 16S рРНК, а именно S4 и S7 из альфа- и str-оперонов E. coli, соответственно.
В задачу данной работы входило сравнительное изучение организации и экспрессии оперонов р-белков эубактерий, в частности E. coli и ряда патогенов.
Для этого выбраны два представителя из одного типа - Proteobacteria, поскольку к нему относится вид E. coli: один представитель того же порядка Enterobacteriales - Salmonella enterica серотип typhi (S. Typhiy), и второй, но относящийся к другому порядку - V. cholera. Два других представителя: типа Firmicutes - Staphylococcus aureus и типа Actinobacteria - Mycobacterium tuberculosis также относятся к патогенам.
Цель и задачи исследования
Цель работы - изучение геномной и оперонной организации генов, а также цистронов в оперонах р-белков патогенных бактерий из различных классов. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:
-
Охарактеризовать расположение генов р-белков в геномах различных эубактерий;
-
Сравнить организацию генов/цистронов р-белков в оперонах различных эубактерий;
-
Охарактеризовать и исследовать экспрессию стабильных бактериальных коротких РНК (бкРНК, (sRNA)), имеющих отношение к оперонам р-белков;
-
Разработать метод для изучения кинематики рибосом на полицистронной мРНК in vivo на примере sir-оперона E. coli, используя ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ);
-
Сравнить дифференциальную экспрессию отдельных цистронов sir- и альфа-оперонов р- белков, ключевых для биогенеза малой субчастицы.
Научная новизна и практическая значимость работы
Проанализировано положение генов р-белков на хромосомной карте E. coli, а также структура их оперонов для S. Typhi, M. tuberculosis, V. cholerae, S. aureus. В зависимости от эволюционных различий меняется взаимное расположение групп оперонов. Выделены опероны, которые чаще других расположены кластерами в геномах бактерий. Найдены различия в построении и составе самих оперонов. Наиболее яркий пример - альфа-оперон V. cholerae, в котором отсутствует ключевой ген регуляторного р-белка S4.
Проанализирована структура sir-оперона для всех пяти эубактерий. Для двух близких эубактерий: E. coli и S. Typhi (рис. 1), относящихся к одному порядку, не выявлено различий в структуре sir-оперона. Но для V. cholerae (другой порядок) показано наличие дополнительной копии гена фактора элонгации EF-G, находящейся вне sir-оперона в совершенно другом участке генома. S. aureus отличается только по копийности генов EF-Tu (одна копия, а не как в E. coli - две). M. tuberculosis отличается по копийности генов обоих факторов элонгации EF-G и EF-Tu.
В данной работе для S. Typhi, V. cholerae, S. aureus и M. tuberculosis выявлена 41 бкРНК, картированные в 15 р-оперонах. Их экспрессия показана Нозерн-блот гибридизацией: 14 бкРНК экспрессируются в зависимости от фазы роста бактерий: экспрессия некоторых значительна на стационарной фазе роста, для других она минимальна; некоторые бкРНК экспрессируются на всех стадиях роста. Для V. cholerae найдены три бкРНК (VcR_4520; VcR_4751; VcR_4371), экспрессия которых зависит от белка Hfq (РНК-связывающий бактериальный регулятор экспрессии генов).
Изучены профили представленности различных участков цистронов .уґг-оперона на разных стадиях роста E. coli. Показана активность одного из двух предполагаемых внутренних промоторов при росте на богатой среде.
Для различных физиологических условий впервые построен паттерн представленности ^ґг-оперона. Деградосома (полинуклеотидфосфорилаза) также участвует в модуляции представленности цистронов р-белков.
Проведен анализ профилей представленности различных участков цистронов альфа- оперона на разных фазах роста E. coli.
Публикации и апробации работы.
Работа апробирована на российских и международных конференциях "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2008), "Ломоносов-2009" (Москва, 2009), "Ломоносов-2011" (Москва, 2011), "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010), "Международный конгресс по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID" (Москва, 2012), 3d EMBO Meeting (Vienna, Austria, 2011); 4th EMBO Meeting (Nice, France, 2012), 37th FEBS Congress (Seville, Spain, 2012). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи.
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен оперонам р-белков), обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 52 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 134 цитированных работ. Работа выполнена при поддержке РФФИ и ДААД.
