Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА І. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ВИРУСА ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА КАК ТИПИЧНОГО
ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СЕМЕЙСТВА RHABDOVIRIDAE 10
1. Структура генома вируса везикулярного стоматита 10
2. Строение и состав вириона везикулярного стоматита II
3. Транскрипция и репликация 12
4. Синтез вирусных белков 17
ГЛАВА II. СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА
БЕШЕНСТВА 20
1. Морфология'вириона бешенства 20
2. Физические характеристики и химический состав вируса бешенства 21
3. Антигенный состав вируса бешенства 27
ГЛАВА III. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА БЕШЕНСТВА С ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ КЛЕТКАМИ 33
1. Транскрипция и репликация генома 33
2. Синтез вирусных белков 38
ГЛАВА ІV.ИСТОРИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ШТАММ "ВНУК0В0-32П 41
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
1. Реактивы и радиоактивные изотопы 45
2. Буферные растворы 46
3. Вирус, очистка, концентрирование и выделение его компонентов 46
а) Клетки, их заражение и течение 46
б) Приготовление препарата вируса, используемого для изучения процесса гель-фильтрации 47
в) Получение вирусных компонентов 48
4. Получение цитоплазматичесмх экстрактов и анализ их структур 50
5. Фракционирование градиентов 51
6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.. 51
7. Сканирование окрашенных гелей 52
8. Авторадиография 52
9. Сканирование вирусных ^ ч)-белков 53
10. Пептидное картирование 53
11. Определение радиоактивности 54
12. Титрование инфекционного вируса на животных.. 54
13. Оценка иммуногенной активности инактивированного вируса 54
14. Определение содержания белка в вирусных препаратах 54
15. Гель-фильтрационная хроматография на макропористых кремнеземах 55
16. Электронная микроскопия 56
17. Статистическая обработка результатов 57
ГЛАВА VІ. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА БЕШЕНСТВА НА ДВУХ ПАС
САЖНЫХ УРОВНЯХ 58
ГЛАВА VII. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ КОНЦЕНТРАТОВ ВИРУСА
1. Изучение эффективности и параметров очистки вируса бешенства с помощью гельфильтрации на модифицированных винилпирролидоном макропористых кремнеземах
2. Очистка и концентрирование вируса с помощью центрифугирования 75
ГЛАВА VIII. ИНДИКАЦИЯ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСНЬК ЧАСТИЦ, ОЦЕНКА ИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС И МОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ 88
1. Плавучая плотность вири он ов бешенства 88
2. Молекулярные массы отдельных структурных белков 88
ГЛАВА IX. ИЗУЧЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦАХ 95
1. Анализ результатов депротеинизирующих воздействий 26
2. Анализ набора и поступления белков во внутриклеточных нуклеокапсидах 102
а) Условия лечения 104
б) Морфология нуклеокапсидов 10?
в) Выделение нуклеокапсидов с определением
набора белков НО
г) Кинетика поступления 114
ГЛАВА X. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКА G ВИРУСА БЕШЕНСТВА 119
1. Действие КР-40 на вирусные частицы 119
2. Выделение структурных белков в препаративных количествах 121
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 138
- Структура генома вируса везикулярного стоматита
- Вирус, очистка, концентрирование и выделение его компонентов
- Очистка и концентрирование вируса с помощью центрифугирования
Структура генома вируса везикулярного стоматита
Геном вируса везикулярного стоматита состоит из однонитчатой непрерывной линейной РНК, содержащей нуклеотидные последовательности, комплементарные вирусспецифическим мРНК.
Молекулярная Масса ГеНОМНОЙ РНК 4 . 10 . Bishop et al., ( 3-6) определили молекулярную массу РНК равной (3,82 + 0,14).106 дальтон. Авторы подвергали РНК перевариванию смесью РНК-аз, а за х) Ниже представлены литературные данные, относящиеся к наиболее хорошо изученному представителю рода рабдовирусов - вирусу везикулярного стоматита. В дальнейшем представленные характеристики будут использованы для сравнения как с литературными данными, так и с полученными нами собственными данными, относящимися к вирусу бешенства.
Данные о взаимном расположении генов ВВС были получены при определении размеров мишеней отдельных генов облученного ультрафиолетом вируса с последующим использованием этого вируса в бесклеточных системах синтеза РНК (20) и сопряженного синтеза РНК и белка (31). Таким образом, сопоставление размеров мишени для каждого гена и размеров индивидуальных мРНК позволило определить следующий порядок генов: 3 - ж - us - м - G - ь - 5 .
Последовательность нуклеотидов, соответствующая гену белка и , начинается не на 3 - конце, а после небольшого участка, состоящего приблизительно из 70 нуклеотидов. С этого участка транскрибируется так называемая "лидирующая" РНК, синтез которой необходим для начала последовательной транскрипции вирусных генов (46).
Реактивы и радиоактивные изотопы
В работе использовали вирус бешенства, штамм "Внуково-32". Исходным материалом служила вируссодержащая жидкость, собранная через 7-9 суток после заражения культуры первичных клеток сирийских хомяков и инкубации их при 32С.
Инфекционный титр вируса составлял 6,0 - 6,5 ig ЛД с/ОіОЗ мл при титровании на мышах.
Для получения меченых препаратов использовали систему: вирус бешенства штамм "Внуково-32" - клетки ВНК-2І. Через 60 часов после заражения клеток вирусом бешенства (множественность заражения I ЛД50/ клетка) вводили " С-гидролизат белка хлореллы в концентрации 20-50 мкКи/мл.
а) Клетки, их заражение и мечение
Клетки ВНК-2І выращивали при 35С на поверхности стекла, либо во флаконах из-под антибиотиков, либо в культуральных матрасах различной емкости (от 100 до 1.500 мл). В качестве питательной среды использовали среду Игла, содержащую 10% сыворотки крупного рогатого скота, 100 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
Через четверо суток сформировавшийся монослой клеток BHK-2I инкубировали в течение одного часа при 35С с вирусеодержащей жидкостью таким образом, чтобы множественность заражения составляла I ЛД о/клетка. Затем жидкость удаляли, клетки заливали свежим раствором питательной среды и далее инкубировали при 35С.
В некоторых случаях для изучения меченых белков в клетках инкубировали клетки с 1 С-гидролизатом белка хлореллы (20 мкКи/мл) в течение 60 минут. Затем клетки лизировали и белки подвергали электрофорезу.
Очистка и концентрирование вируса с помощью центрифугирования
Исходную вируссодержащую жидкость получали, заражая клетки первичных культур сирийских хомяков вирусом бешенства штамм "Внуково-32" на 107 или более позднем пассаже, как описано в "Материалах и методах".Поддерживающая питательная среда содержала человеческий альбумин в концентрации 0,4-0,6%.
Для получения первичных концентратов вируссодержащую жидкость центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы 20-60% (равновесное центрифугирование), приготовленном на буферном растворе - 0,331 Naci ; О,OBI фосфатный буфер, рН 7,5; 0,00Ш ЭДТА -В ПРОТОЧНОМ роторе К-6 центрифуги Mark II Electronuclecnk»OflHH цикл центрифугирования обеспечивал приблизительно 50-кратное концентрирование частиц из нескольких десятков литров вируссодержа-щей жидкости.
После сбора фракций из каждой было взято по 0,05 мл пробы для оценки электрофоретнческого спектра белков. В окрашенном геле выявлены большие количества человеческого сывороточного альбумина, молекулярная масса которого 69.000 дальтон, что затруднило оценку препаратов.
Поэтому пробы из каждой фракции развели раствором НТЗ и центрифугировали для осаждения вирусных частиц с целью их дополнительной очистки от балластных материалов. Осадки суспендировали в 0,2 мл раствора НТЭ, что соответствовало концентрированию исходного материала в 5.000 раз. Часть суспензии использовали для изучения электрофоретического спектра белков (рисунок 9), остаток для определения общего содержания белка.
