Введение к работе
Актуальность работы.
Синтез белков в любых клетках происходит на рибосомах, сложных рибонуклеопротеидных комплексах, состоящих из нескольких молекул рибосомных РНК и нескольких десятков различных рибосомных белков (р-белков). Биогенез рибосом требует значительных энергетических затрат и строго регулируется у всех организмов. Для экономии клеточных ресурсов и обеспечения эквимолярности синтеза рибосомных компонентов в процессе эволюции появились регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию рибосомных генов. У бактерий активность транскрипции рРНК зависит от состава окружающей среды и доступности питательных веществ (стимулируется на богатой среде и ингибируется на бедной), а синтез р-белков скоординирован с синтезом рРНК по принципу обратной связи (аутогенный контроль). Почти в каждом опероне р-белков один из продуктов является не только структурным компонентом рибосомы, напрямую взаимодействующим с рРНК на первых этапах сборки субчастиц, но и негативным регулятором, способным подавлять трансляцию своей мРНК, если его количество в клетке превышает количество свободной рРНК.
Молекулярные механизмы аутогенного контроля исследованы для многих оперонов р-белков, но не для всех. Так, регуляция оперона rpsB-tsf, кодирующего жизненно важные компоненты трансляционного аппарата клетки - р-белок S2 и фактор элонгации Ts, никогда не исследовалась, и даже промотор оперона не был локализован. О функциях р-белка S2 в трансляции известно мало. В отличие от большинства р-белков, которые служат аутогенными репрессорами, белок S2 не способен узнавать свободную рРНК и участвует в сборке 30S рибосомной субчастицы на последнем этапе; после него присоединяется только белок S1 - компонент рибосом, строго необходимый для связывания мРНК на этапе инициации трансляции. Для белка S1 было доказано, что он представляет собой исключение и является репрессором своего синтеза, хотя и не связывает свободную рРНК при сборке рибосомы. Априори нельзя было исключить такую возможность и для белка S2, который может быть вовлечен в регуляцию оперона rpsB-tsf как аутогенный репрессор, если синтезируется в избытке по отношению к другим рибосомным компонентам. Исследование регуляции экспрессии жизненно важных генов, вовлеченных в биосинтез белка, является актуальной задачей современной
биологии, так как в перспективе может дать абсолютно новые результаты, необходимые для понимания базовых принципов регуляции генной экспрессии у бактерий.
Цели и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы являлось исследование механизмов регуляции экспрессии оперона rpsB-tsfy Е. coli и родственных бактерий, поиск общих черт и различий по сравнению с известными примерами контроля экспрессии рибосомных оперонов. Были поставлены следующие задачи:
-
Изучить регуляцию оперона rpsB-tsf in vivo и исследовать роль р-белка S2 как потенциального аутогенного регулятора.
-
Локализовать промотор/промоторы оперона rpsB-tsf, изучить его структуру и свойства с помощью мутационного анализа.
-
Выяснить, на какой стадии контролируется экспрессия каждого из генов оперона, какие cis-элементы и trans-факторы участвуют в регуляции.
-
С помощью филогенетического анализа оценить консервативность механизма регуляции оперона rpsB-tsfy разных видов у-протеобактерий.
Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые картирован и охарактеризован промотор оперона rpsB-tsf. Впервые показано, что белок S2 является негативным регулятором обоих генов оперона in vivo и что оба гена регулируются за счёт связывания S2 с протяжённой 5'-нетранслируемой областью (НТО) мРНК перед цистроном rpsB. Филогенетический анализ выявил высокую консервативность промотора и вторичной структуры 5'-НТО у у-протеобактерий, а также ряд идентичных для всех исследованных у-протеобактерий последовательностей, которые, по результатам делеционного анализа, являются негативными регуляторными элементами. Показано, что механизм аутогенного контроля оперона rpsB-tsf консервативен в более широком спектре семейств у-протеобактерий, чем в случае оперонов rpsA и S10, что предусматривает различное время возникновения механизмов регуляции синтеза рибосомных белков в процессе эволюции. Показано нарушение аутогенного контроля не только в мутантах по гену белка-регулятора S2, но и в мутанте по гену белка S1, то есть в регуляции может участвовать комплекс этих белков. Возможность образования такого комплекса доказана с помощью иммунопреципитации. Это предполагает
принципиальное отличие механизма аутогенного контроля rpsB-tsf от известных моделей регуляции, в которых белку-репрессору не требуется помощник.
Таким образом, получены абсолютно новые данные о регуляции жизненно важного оперона rpsB-tsf, которые не только имеют важное фундаментальное значение, но в перспективе могут быть полезными для поиска новых ингибиторов бактериальных инфекций.
Апробация и публикация работы. По результатам диссертационной работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: 1) XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006", секция Биология, 12-15 апреля 2006, Москва; 2) VIII Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, 25-27 окт. 2006, Москва; 3) IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, Россия; 4) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2008», секция Биология, 8-11 апреля 2008, Москва; 5) XXI зимняя молодёжная научная школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 9-11 февраля 2009, Москва; 6).Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 1 октября 2009, Москва; 7) VII International conference «Ribosome synthesis-2006», August 16-20, 2006, Virginia, USA; 8) International Conference "Ribosomes 2007", June 3-8,2007, Cape Cod, MA USA; 9) II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorld-2007". 28 November-1 December 2007, Seville, Spain; 10) III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMocroWorld-2009". 2-А December 2009, Lisbon, Portugal.
Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на; страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит // таблиць!- и 'Л-Ь рисунков. Список цитируемых литературных источников включает ~// наименований.
