Введение к работе
Актуальность проблемы.
Процессы репликации и репарации ДНК в клетках эукариот являются очень сложными и осуществляются большим набором ферментов и регуляторных белков. В норме процесс репликации обеспечивается группой специализированных репликативных ДНК-полимераз. Однако на поврежденной или модифицированной ДНК эти ДНК-полимеразы не способны эффективно функционировать, что вызывает блок репликации. Для решения этой проблемы в клетке активируются механизмы, задействующие специализированные репаративные ДНК-полимеразы, осуществляющие синтез ДНК через повреждение – TLS-ДНК-полимеразы. Одной из особенностей TLS-ДНК-полимераз является то, что они способны эффективно и во многих случаях корректно встраивать нуклеотиды напротив поврежденных оснований. Однако из-за структурных особенностей каталитических центров TLS-ДНК-полимеразы, по сравнению с репликативными ДНК-полимеразами, при синтезе ДНК на неповрежденных матрицах допускают ошибки намного чаще. Данный конфликт пользы (преодоление блока репликации и поддержание стабильности генома) и вреда (высокая частота ошибок синтеза, приводящая к мутациям, т.н. error-prone synthesis) в нормальных клетках разрешается жесткой регуляцией функционирования TLS-ДНК-полимераз как на уровне транскрипции, так и на посттрансляционном уровне. Тем не менее, некоторые двухвалентные катионы металлов способны не только провоцировать снижение точности синтеза ДНК, но и приводить к сильной активации отдельных TLS-ДНК-полимераз.
Изменение активности ДНК-полимераз в присутствии повышенных концентраций некоторых двухвалентных катионов металлов может негативно сказаться на многих ключевых процессах клетки. Так, около сорока лет назад была сформулирована мутационная гипотеза возникновения рака. Согласно этой гипотезе, ранние события канцерогенеза могут быть следствием генерации мутаций из-за снижения точности работы репликации и репарации. Было показано, что одним из механизмов увеличения уровня мутагенеза в клетках является дерегуляция активности репаративных ДНК-полимераз. В связи с этим, изучение биохимических свойств и особенностей регуляции репаративных ДНК-полимераз, в том числе и TLS-ДНК-полимераз, может лечь в основу понимания тех механизмов, которые происходят при злокачественной трансформации клетки. Одной из наиболее слабо изученных TLS-ДНК-полимераз является ДНК-полимераза йота (Рol ).
Рol относится к Y-семейству ДНК-полимераз и характеризуется крайне низкой точностью синтеза. К настоящему моменту биохимические свойства Рol описаны в значительном количестве работ, однако в большинстве из них изучались чистые препараты рекомбинантного фермента. В этом случае остается совершенно невыясненным то, как происходит функционирование Pol в живой клетке в присутствии содержащихся там разнообразных регуляторных факторов. Изучение активности Pol в экстрактах клеток может позволить в определенной мере решить эту проблему.
Цель и задачи работы.
Цель настоящей работы заключалась в изучении функционирования склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши. Были поставлены следующие задачи:
получение высокоаффинного и специфичного РНК аптамера к Pol ;
изучение воздействия полученного аптамера на активность как гомогенного препарата Pol , так и на активность этого фермента в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека;
изучение влияния 8 наиболее распространенных металлов в виде двухвалентных катионов на активность всего комплекса ДНК-синтезирующих ферментов;
изучение влияния концентрации Mn2+ на синтез ДНК и на активность Pol в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Исследовано влияния 8 распространенных и биологически значимых металлов (в виде двухвалентных катионов) на функционирование всего комплекса ДНК-полимераз в экстрактах клеток эукариот. Охарактеризовано влияние двухвалентных катионов металлов на точность синтеза ДНК. В работе показано, что наибольшее снижение точности синтеза ДНК вызывает Mn2+. Установлено, что снижение точности синтеза ДНК в присутствии Mn2+ обусловлено активацией некорректной активности ДНК-полимеразы йота (Рol ). Впервые получен и охарактеризован РНК-аптамер к Рol . Установлено, что полученный аптамер эффективно подавляет активность как гомогенного препарата Рol , так и активность Рol в экстрактах клеток нормальных и опухолевых тканей человека. Потенциально данный аптамер может быть использован в терапии для снижения уровня мутагенеза, обусловленного повышенной активностью Рol .
Основные положения, выносимые на защиту.
получение и характеристика РНК-аптамера к ДНК-полимеразе йота (Рol );
полученный аптамер способен эффективно подавлять ДНК-полимеразную активность как гомогенного препарата Рol , так и активность Рol в экстрактах клеток нормальных и опухолевых тканей человека;
охарактеризовано влияние 8 двухвалентных катионов металлов на точность синтеза ДНК (изучаемого в реакции элонгации радиоактивно меченого праймера) в экстрактах клеток млекопитающих;
снижение точности синтеза ДНК в присутствии Mn2+ обусловлено активацией склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота.
Публикации и апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи и 4 – материалы конференций.
Основные положения работы были представлены автором на 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2011), на 4-й Международной конференции молодых ученых «Молекулярная биология: достижения и перспективы» (Киев, Украина, 2011), на 8-й Международной конференции “Молекулярная генетика соматических клеток” (Звенигород, Россия, 2011).
Диссертационная работа была апробирована на заседании Ученого совета ФГБУН ИМГ РАН 23 сентября 2013 года и на семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 23 сентября 2013 года.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Материалы диссертации изложены на 115 страницах, содержат 24 рисунка и 3 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 246 источников.
