Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Основные характеристики паішлломавирусов .. 10
1.1. Общие сведения о вирусе папилломы Ю
1.2. Структура и организация генома 10
1.3.Репликация вируса в эпителиальных клетках 12
ГЛАВА 2. Изменение морфологии клетки под влиянием папилломавирусов 15
2.1. Цитоморфология и гистоморфология нормального плоского эпителия. 15
2.2. Цитоморфология и гистоморфология клеток плоского эпителия, инфицированных вирусом папилломы 16
2.3. Цитологические и гистологические критерии злокачественности 22
ГЛАВА 3. Ультраструктура клеток в норме патологии 27
3.1. Просвечивающая электронная микроскопия клеток плоского эпителия в норме и при вирусной патологии 27
3.2. Сканирующая электронная микроскопия. Плоский эпителий 31
3.3. Атомно-силовая микроскопия 32
3.3.1. Принцип метода атомно-силовой микроскопии 32
3.3.2. Атомно-силовое исследование биологических объектов 34
Собственные исследования
ГЛАВА 1. Материалы и методы 39
1.1. Материалы 39
1.2. Кольпоскопия 39
1.3. Цитоморфологический метод 39
1.3.1. Традиционный цитологический метод 40
1.3.2. Метод жидкостной цитологии с применением системы «Цитоспин».. 41
1.4. Гистоморфологический метод 42
1.4.1. Подготовка препаратов для гибридизации in situ 42
1.5. Подготовка материала для исследования методом полимеразной цепной реакции 43
1.6. Подготовка препаратов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 44
1.7. Подготовка препаратов для исследования методом сканирующей электронной микроскопии 45
1.8. Подготовка препаратов для исследования поверхности клеток методом атомно-силовой микроскопии 46
1.8.1. Использование окрашенного материала 46
1.8.2. Использование неокрашенного материала 46
Результаты и обсуждение
ГЛАВА 2. Цитологические исследования в сопоставлении с клиническими данными 47
2.1. Характеристика клинических данных исследуемых пациенток и выявляемость койлоцитоза 47
2.2. Анализ способов получения материала 50
2.3. Выявление цитоморфологических признаков ПВИ и сопоставление с результатами молекулярно-биологических методов 52
2.4. Определение степени патологических изменений плоского эпителия... 60
ГЛАВА 3. Цитоморфология клеток плоского эпителия в сочетании с атомно-силовым исследованием 64
3.1. Контрольные образцы - цитология, атомно-силовая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия 64
3.2. Плоский эпителий, измененный папилломавирусной инфекцией -цитология, атомно-силовая микроскопия 69
3.3. Клетки плоскоклеточного рака с ороговением - цитология, АСМ-исследование 81
ГЛАВА 4. Гистоморфологические и ультраструктурные исследования биоптатов 88
4.1. Гистологическое исследование биопсий 88
4.2. Ультраструктурное исследование биопсий 91
Заключение 96
Выводы 98
Список литературы
- Структура и организация генома
- Цитоморфология и гистоморфология клеток плоского эпителия, инфицированных вирусом папилломы
- Атомно-силовая микроскопия
- Подготовка препаратов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
Введение к работе
Актуальность проблемы
Папилломавирусные инфекции (ПВИ) широко распространены среди людей, животных, вызывая тяжелые патологии слизистой оболочки и кожи. В основном это кондиломы и папилломы слизистых оболочек, бородавки и папилломы кожи, опухоли или опухолеподобные образования различной локализации. Как было установлено Н. Цурхаузеном в 1976 году [30], именно инфицирование эпителия шейки матки вирусом папилломы человека (ВПЧ) 16 типа создает условия развития рака этого органа.
По данным Международного агенства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется более 370 000 новых случаев рака шейки матки, умирает от него около 190000 женщин [48]. Каждый день в России от рака шейки матки умирает 17 человек [60]. Наряду с доброкачественными опухолеподобными разрастаниями, вызываемыми папилломавирусами низкой онкогенной группы (6, 11 типы и другие), папиллома-вирусы, вызывающие развитие рака шейки матки, относятся к высокоонкогенным вирусам (16, 18, 31, 45 типы) [39]. Еще в 1996 году в информационном бюллетене Всемирной организации здравоохранения было официально отмечено, что вирусы папилломы человека 16 и 18 типов являются особо канцерогенными [48], поэтому диагностика папиллома вирусной инфекции (ПВИ) была и остается актуальной.
Существуют различные методы диагностики ПВИ, среди которых особое место занимает скрининговый цитологический метод, получивший широкое распространение, как в России, так и за рубежом, который позволяет выявлять как морфологические признаки ПВИ, дисплазии и рак. Метод прост в исполнении, не требует длительного времени для постановки диагноза и дорогостоящей аппаратуры. Цитологический метод высокоспецифичен, то есть в цитологическом препарате при выявлении койло-цитов, наличие ПВИ подтверждалось в 95-98% случаев (51). Однако выявляемость койлоцитоза — основного морфологического признака ПВИ, низкая - до 30% [15, 95].
С другой стороны, существующие в настоящее время молекулярно-биологические методы диагностики ПВИ: полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод Hybrid Capture («Digene-тест») и другие выявляют наличие ДНК ВПЧ в материале, от больных с высокой точностью и чувствительностью [58, 16], но при этом теряется информация, как о локализации отдельных клеток, несущих вирусную ДНК, так и о степени патологических изменений эпителия. Поэтому следует иметь в виду, что
молекулярно-биологические методы не заменяют цитологический метод, а применяются комплексно, в-сочетании с ним, что позволяет поставить наиболее полный и обоснованный диагноз. Вместе с тем, сами, морфологические методы диагностики ПВИ- цитологический и, в меньшей степени, гистологический метод не дают полную информацию об изменении клеточных структур под воздействием вируса: Это связано с тем, что анализу подвергается двухмерное изображение клеток эпителия, пораженного вирусом, и не включается в рассмотрение объемное изменение поверхности таких клеток, что могло бы дать дополнительные морфологические критерии оценки. Поэтому возникает необходимость в модификации цитологического метода, с целью получения дополнительных критериев характеристики исследуемого объекта. Очевидно, чтобы улучшить качество диагностики необходимо углублять наши знания по объекту исследования, а именно по топографии эпителиальной клетки, инфицированной вирусом.
Как известно, для исследования поверхности клетки используют сканирующую электронную микроскопию [82, 113], однако это дорогостоящий метод и к тому же требующий і длительной подготовки образцов, что затрудняет его широкое использование в практической медицине. В настоящее время все большее применение находит, метод атомно-силовой микроскопии, позволяющий получить трехмерное изображение клетки, и изучить топографию ее поверхности. Этот метод, несомненно, было бьг целесообразно использовать для исследования поверхности эпителиальных клеток с цитоморфологическими признаками ПВИ:
Цели и задачи исследования
Цитоморфологическое исследование клеток плоского эпителия шейки матки в норме и при папилломавирусной патологии, структурное изучение их поверхности с помощью метода атомно-силовой микроскопии.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи: 1. Проведение цитологического анализа мазков с шейки матки пациенток, инфицированных вирусом папилломы человека (ВПЧ) и выявление клеток с морфологическими г признаками ПВИ: койлоциты, дискератоциты, паракератоциты, элементы гиперкера-тоза (чешуйки плоского эпителия, клетки с «тающими» ядрами) и сопоставление их с контрольными клетками при- учете клинических данных. Использование при этом в
7 контрольными клетками при учете клинических данных. Использование при этом в материале для контроля на наличие ВПЧ методов молекулярной биологии: полиме-разной цепной реакции, гибридизации in situ.
Получение АСМ-изображений поверхности клеток с морфологическими признаками ПВИ и нормальных клеток плоского эпителия.
Создание усредненных моделей структуры поверхности клеток с морфологическими признаками ПВИ и клеток без признаков патологии по результатам АСМ-исследования и сопоставление их с данными цитологического анализа.
Получение АСМ-изображений поверхности клеток с морфологическими признаками плоскоклеточного рака с ороговением и создание усредненной модели структуры поверхности этих клеток.
Изучение гистоморфологии и ультраструктуры клеток поверхностного и промежуточного слоев плоского эпителия шейки матки, инфицированного ВПЧ.
Научная новизна работы Нами впервые применен и адаптирован к клеткам плоского эпителия в норме и патологии метод АСМ, позволивший исследовать структуру поверхности клеток нормы, с цитоморфологическими признаками вирусной и раковой патологии. Обнаружены существенные топографические различия структуры поверхности таких клеток, по которым можно определять степень поражения клетки.
Практическая значимость работы В работе показана важность способа и зоны получения материала для цитологической диагностики ПВИ гениталий. При этом цитоморфологические признаки ПВИ (койлоцитоз, дискератоз, паракератоз, гиперкератоз) можно дополнить анализом тех же самых цитологических препаратов методом АСМ. Разработаны трехмерные модели структуры поверхности клеток с цитоморфологическими признаками ПВИ, которые позволяют сопоставлять исследуемые клетки с ними и выявлять клетки с вирусной патологией.
Апробация работы Результаты работ были представлены на следующих съездах и пленумах:
3-й съезд Клинических цитологов России (Самара, июнь 1999 г);
Международная конференция «Microbicides», (Вашингтон, 13 - 16 марта 2000 г);
- 3-й Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика в совре
менной медицине» отдела молекулярной биологии (г. Москва, 25 - 27 января 2000 г);
Заседание Пленума Ассоциации клинических цитологов России (Москва, 2006 г.);
Заседание Первой Всероссийской Школы-семинара «Современные достижения био-наноскопии» (Москва, МГУ, 11 -17 июня 2007 г.);
Заседание Пленума Центрального Исполнительного Совета Ассоциации Клинических цитологов России (г. Черноголовка, 6 -7 декабря 2008 г);
Заседание Форума по нанотехнологии (Москва, 3-5 декабря 2008 г).
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН от 29 января 2009 г.
Основные положения, выносимые на защиту
Оптимизация и адаптация метода АСМ к исследованию поверхности клеток плоского эпителия в норме и при вирусной патологии.
Изучение и сопоставление топографических изменений клеток плоского эпителия в норме и при патологии.
Разработка трехмерных моделей структуры поверхностей клеток с цитоморфологи-ческими признаками ПВИ: койлоцит, дискератоцит, паракератоцит, безъядерная чешуйка — элемент гиперкератоза
Публикации По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 7 статей в реферируемых российских научных журналах и тезисы докладов в сборниках российских и международных конференций, три из которых причисляются к списку ВАК.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает в себя 117 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 64 рисунка.
9 Ключевые слова Папилломавирусы, койлоцитоз, дискератоз, паракератоз, гиперкертоз, цито-морфология, атомно-силовая микроскопия.
10 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структура и организация генома
Папилломавирусы инфицируют млекопитающих (человек, домашние и дикие животные), птиц, пресмыкающихся, и вызывают образование бородавок различной формы и размеров на коже и слизистых оболочках. С 2002 года папилломавирусы были выделены в отдельное семейство Papillomaviridae, состоящее из 16 родов [31]. На рисунке 1 представлено филогенетическое древо папилломавирусов. В настоящее время известно более 120 типов папилломавирусов, из них полностью идентифицировано и секвенировано 85 типов (Zur Hausen 2000), при этом, аногенитальную область инфицируют 40 типов [48]. Alpha-papillomavirus Beta-papillomavirus Mu-papillomavirus
Gamma-papilloma virus. Структура и организация генома. Краткая характеристика некоторых продуктов экспрессии Вирион папилломавирусов имеет диаметр 45-55 нм. Он окружен белковой оболочкой, которая представляет собой капсид, содержащий 12 пентамеров и 60 гекса-меров, организованных по симметрии Т=7 [27]. Сердцевина вириона состоит из сверхспирализованной кольцевой двухцепочечной молекулы ДНК, с молекулярной массой 7200-8000 пар оснований, в зависимости от типа ВПЧ. Папилломавирусы уникальны тем, что в состав их сердцевины входят гистоновые белки, образующие нуклеосомные структуры с вирусной ДНК, подобные тем, которые имеют место в клеточной хромосоме.
Геномная карта ВПЧ (рис. 2) представляет собой кольцо, на внешней стороне которого расположены вирусные гены, обозначенные как Еь Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, Lb U [15, 30,42,48].
URR — зона вирусного генома, содержащая транскрипционные и регуляторные элементы. Транскрипция осуществляется по часовой стрелке, начиная с точки, обозначенной как Р97 (на внутренней стороне кольца). В процессе репликативного цикла геном ВПЧ экспрессирует от 8 до 10 белков. При этом ранние белки Ei - Е7 осуществляют подготовку репликации вирусной ДНК, саму репликацию и некоторые процессы, необходимые для поздних этапов жизненного цикла вируса. Экспрессия поздних белков Li и L2 образующих вирусный капсид, а также процесс формирования серд цевины из вирусной ДНК и гистоновых белков клетки завершает созревание вириона ВПЧ. К сожалению, на сегодняшний день достоверно известны функции только некоторых вирусных белков: - Li - белок вирусного капсида, ответственный за взаимодействие с рецептором эпи телиальной клетки. - L2 — вирусный белок, осуществляющий взаимодействие сердцевины с вирусным капсидом, при этом количество Li значительно больше в вирионе, чем L2. -Ei - ранний вирусный белок, обеспечивающий начало репликации ДНК ВПЧ, а Е2 является кофактором репликации.
Относительно белка Е4 известно, что он вовлечен в контроль репликации вирусной ДНК и помогает интеграции сердцевины внутрь формирующегося вириона. О вирусных белках Е5, Еб, Е7 известно, что они являются онкобелками, осуществляющими трансформацию эпителиальной клетки. Относительно их роли в вирусной репликации практически ничего неизвестно. То же относится к белкам Е3, Eg. Имеется некоторая дополнительная информация о функциях белков Еь Е2:
Ei отвечает за поддержание персистенции вирусного генома в эписомальной форме, что необходимо для репродукции вируса. Е2 и URR область осуществляют активации и подавляют экспрессию ранних генов, кроме того, в гене Е2 происходит «разрыв» кольцевой формы генома и перехода его в линейную с последующей интеграцией в клеточный геном. Следует отметить, что белок Е4, помимо его роли в созревании вириона [56], взаимодействует с цитоскелетом клетки благодаря специфическому распознаванию кератиновых филаментов. Это приводит к разрушению цито-скелета, что необходимо для высвобождения вирионов из клетки [15, 18].
Репликация вируса в эпителиальных клетках Особенностью папилломавирусов является то, что они до настоящего времени нет монослойных культур клеток, обеспечивающих хорошую вирусную продукцию. Это связано с тем, что клетки плоского эпителия проходят определенные этапы созревания - от базальных до поверхностных клеток — окончательный этап дифферен-цировки. Вирус инфицирует только базальные клетки (рис. 3) и персистирует в клетках других слоев плоского эпителия по мере их дифференцировки и перехода в другие слои, вплоть до поверхностного слоя [15, 39, 95].
Цитоморфология и гистоморфология клеток плоского эпителия, инфицированных вирусом папилломы
Цитоморфология и гистоморфология клеток плоского эпителия, инфицированных вирусом папилломы Кондиломы ВПЧ является причиной возникновения доброкачественных поражений - кондилом (бородавок). Они подразделяются на экзофитные и эндофитные поражения различных участков эпителия вульвы, влагалища и шейки матки (также окружающих покровов и слизистых оболочек, включая анус). Экзофитные формы (генитальные бородавки) включают в себя разнообразные по внешнему виду и размеру остроконечные, папиллярные образования, частота которых по данным Минздрава РФ (2001 рл составляет 26 случаев на 100 000 инфицированных ВПЧ пациентов. Эндофитны формы (или субклиническая папилломавирусная инфекция) представляет собой ра _ личные морфологические изменения плоского эпителия без наружных разрастаний инвертированные кондиломы - растущие внутрь [34, 84] (рис. 5).
Плоские и остроконечные поражения отмечаются наиболее часто. При гистологическом исследовании срезов всех типов кондилом изменения отмечаются в клетках поверхностного и промежуточного слоев плоского эпителия: кератинизация - ороговение поверхностных слоев эпителия, нарушение дифференцировки клеток, появление клеток разной формы с гиперхромными, пикнотичными ядрами и перинуклеар-ным гало (койлоцитоз), также двух или многоядерные клетки. Клетки парабазального
слоя в кондиломатозньгх поражениях могут подвергаться пролиферации - увеличение количества клеток данного слоя [48].
Для цитологического анализа клетки эпителия переносят с поверхности слизистой оболочки с помощью щеточки Цито-Браш на предметное стекло, окрашивают и изучают под световым микроскопом (Pap-тест). Прежде чем перейти к подробной характеристике критериев цитоморфологических изменений клетки при ПВИ с помощью Pap-теста, следует кратко остановиться на истории их развития. В 1949 году впервые Ейр (J.Aure), а в 1954 году Г. Папаниколау описали перинуклеарные изменения в клетках при исследовании мазков с шейки матки, которые названы «балонными клетками» [56, 116, 117].
Однако это название не прижилось, и в 1956 году Грек (Greek) предложил другой термин «койлос», то есть «гало» («holloww-ігустой) [113]. В том же году Л. Косе (L. Koss) и Г. Дурф (G. Durfee) постулировали цитоморфологические признаки па-пилломавирусной инфекции и ввели в клиническую практику термин «койлоцитарная атипия». Авторы впервые отметили связь между койлоцитарной атипией, дисплазией и раком шейки матки [34, 56, 88].
В итоге были определены основные (койлоцитоз, дискератоз) и второстепенные (паракератоз, гиперкератоз) признаки ПВИ, которые представлены в таблице 1, где в третьей колонке указаны автор и год, когда был сформулирован критерий [66, 112, 117,75].
В таблице 2 представлены характеристики клетки, в таблице 3 - характеристики ядра. В таблице 4 - характеристики цитоплазмы, подробно охарактеризованы признаки койлоцитоза; вторая колонка представляет морфологические черты измененной клетки и ее органелл. Четвертая колонка таблиц 4 и 5 показывает сходные морфологические
Необходимо отметить, что образование околоядерного гало, несомненно, является главным признаком койлоцита, и поэтому оно было предметом исследования в ряде работ [5, 10, 30, 88, 112], на основании которых сделаны следующие заключения: - показано отсутствие органелл в околоядерном гало [88]; - дегенеративные изменения, некроз цитоплазмы вокруг ядра приводит к постепенному просветлению этой зоны и распространению к периферии клетки [10]; - по краю некротических участков концентрируются цитоплазматические фибриллы, что приводит к резкому отграничению перенуклеарной зоны [5, 112].
В 1976 А. Майзелс (A. Meisels), Р. Фортин (R. Fortin)/ Е. Пурола (Е. Purola), Е.Савиа (E.Savia) расширили цитоморфологические признаки ПВИ, включив диске 21 ратоз, паракератоз (табл. 5) [56, 112, 116, 117]. Дискератоциты являются вторыми, по частоте встречаемости признаками ПВИ, после койлоцитов.
В таблице 5 дана подробная характеристика паракератоцитов и дискератоци-тов, в отношении дискератоцитов А. Майзелс (A. Meisels) высказался кратко, как о клетках, имеющих ядра, сходные с койлоцитами, однако цитоплазма их интенсивно и густо окрашена и без полости (Alexsander Meisels, 1976, 1999 г.) [104].
В 1987 году A. Schneider (et all) описал койлоциты и дискератоциты со сниженной степенью ядерной атипии [112]. Некоторые авторы (доктор Н.Кремер, Dr. H.Kremer, 1999 г.) считают, что только ядерная атипия является признаком ПВИ. В то же время необходимо учесть то, что гало и ядерная атипия также могут быть связаны с воспалением. Споры по уточнению этих критериев актуальны и сегодня. Помимо кой-лоцитоза и дискератоза, с ПВИ связывают паракератоз и гиперкератоз. Следует отметить, что ряд авторов утверждает, что только атипический паракератоз с дискариозом
Атомно-силовая микроскопия
Одними из первых биологических объектов, для исследования которых применялись методы АСМ, были нуклеиновые кислоты. На сегодняшний день благодаря АСМ удается достичь разрешения, необходимого для визуализации витков двойной спирали ДНК. Так на образцах ДНК наблюдались протяженные цепочки, обладающие продольной периодичностью (период около 2-3 нм), на основании чего сделан вывод о визуализации витков двойной спирали [17]. Метод оказался удобным для проведения измерений длин молекул ДНК [38].
АСМ метод был применен к комплексам ДНК с различными соединениями, в частности антителами и некоторыми энзимами. Д. Клиновым была разработана методика (высокоточное картирование) для изучения структуры ДНК и комплексов ДНК с различными лигандами при помощи АСМ [17]. Проводились исследования ДНК-гидролизирующих антител с нуклеиновыми кислотами методом атомно-силовой микроскопии, что представляет интерес, так как данные антитела принимают непосредственное участие в патогенезе аутоиммунных заболеваний.
Показано, что антитела к ДНК являются эндонуклеазами, то есть производят однонитевые разрывы в молекулах ДНК, при этом отмечается образование стабиль ного иммунного комплекса, размеры которого превышают размеры отдельных макромолекул ДНК и антител [40]. Также проводились исследования структур и свойств белков, белковых кристаллов [19], вирусов, комплексов вирусов с антителами и взаимодействие вирусов с клетками (прикрепление вирусной частицы к мембране клетки-хозяина), поиск ингибиторов адгезии, позволяющих предотвратить инфицирование клетки [7].
Бактерии Исследование белков сибиреязвенного микроба методом АСМ показало хорошую корреляцию, симметричность и упорядочность наноструктуры в образуемых ими слоях. На АСМ-изображениях отчетливо видны параллельные ряды упорядоченных линейных цепочек белков с высотами 2-3 нм для белка Sap и 7-8 для ЕА1 [189]. Вирусы Атомно-силовая микроскопия плодотворно использовалась и для изучения структуры вирусов. Кузнецов (Kuznetsov Y.G.) с соавторами представили АСМ-изображения ряда растительных вирусов, вирусов насекомых и человека: вирус табачной мозаики (STMV, d - 17 нм); бромовирус мозаики злаковых (BMV, d - 28 нм); желтый мозаичный вирус турнепса (TYMV, d - 28 нм); вирус мозаики цветной капусты (CaMV, d - 48 нм); радужный (переливчатый) вирус насекомых (TIV, d -120 нм); вирус герпеса (Herpesvirus), (d - 100 нм); вирус вакцины (Vaccinia virus), с наружной липо-протеиновой мембраной и диаметром частицы от 20 до 40 нм [96, 97]. Ямин-ским были также исследованы различные растительные вирусы: вирус табачной мозаики, бромовирус мозаики костра, полувалентный вирус мятлика, вирус штрихова-той мозаики ячменя, вирус мозаики люцерны. При этом удалось визуализировать не только палочкообразную форму вирусов, но и форму многогранников. На этих изображениях представлены вирионы, в которых можно различить субъединицу капсида.
Яминский предложил создать библиотеку АСМ — изображений вирусов, полагая, что это позволит точно идентифицировать вирионы различных вирусов. Автор подчеркивает, что вирионы каждого типа вируса имеют фиксированные размеры. При этом не только длина, высота, диаметр вирусных частиц являются критериями идентификации вирусов с помощью АСМ, но также эластичные и вязкие свойства внешних поверхностей и их взаимодействие (вирусных частиц) друг с другом [7].
Возможно, что результаты этих исследований будут способствовать развитию новых диагностических методов. Представляет несомненный интерес АСМ-исследование взаимодействия штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/NIB/23/89M (H1N1) вируса гриппа с аналогом клеточного рецептора, белком фетуином, так как инфицирование клеток вирусом гриппа начинается с взаимодействия с клеточными рецепторами. Были определены силы взаимодействия штаммов. Отмечалось, что связь первого штамма с фетуином менее прочная, чем второго [53]. В настоящее время ведутся широкомасштабные исследования механизмов клеточной адгезии различных вирусов, поиск их клеточных рецепторов, а также эффективных ингибиторов адгезии, позволяющих предотвратить инфицирование клетки, которые, в перспективе, могут использоваться для профилактики и лечения вирусных заболеваний. Изучение с помощью АСМ строения, морфологии и антивирусных свойств синтезированных ингибиторов позволит осуществить последовательную оптимизацию структуры ингибиторов, ведущую к повышению его противовирусной активности [11].
Исследование структуры бактериофагов методом атомно-силовой микроскопии показали некоторое преимущество этого метода по сравнению с просвечивающей электронной микроскопией (ПЭМ). Так при приготовлении бактериофагов для ПЭМ контрастирующий раствор уранил-ацетата воздействует на хвостовой отросток, изменяя его длину и высоту, при воздействии же АСМ в процессе сканирования хвостовые отростки бактериофагов не деформируются. Основное преимущество, отмеченное Мацко, заключается в том, что АСМ позволил визуализировать центральное тело - сердцевину бактериофага, что с помощью просвечивающей электронной микроскопии было практически невозможно [36]. Исследовали также процесс взаимодействия бактериофагов с бактериями. Был разработан протокол для визуализации методом АСМ такого взаимодействия: клетки Escherichia coli (штамм 57) и бактериофаги v 18/А 157 к ним; клетки Salmonella enteridis (штамм 89) с бактериофагами 39/s.e к ним; показано цитопатическое действие фагов на клетки. [21]. Изучение физических свойств оболочки почвенных бактерий Arthrobacter методом СЗМ позволили определить локальный модуль упругости оболочки [6].
Структура поверхности животных и человека клеток Особый интерес представляют АСМ-исследования клеток, инфицированных вирусами. Однако таких работ в настоящее время немного, но есть исследования, посвященные трехмерной структуре нормальных и трансформированных клеток. Пока зана возможность получения точных атомно-силовых изображений про- и эукариот, оценки формы и размеров клеток, а также детали рельефа и деформаций клеточных поверхностей изученных объектов [81].
При исследовании методом АСМ поверхности эритроцитов было выяснено, что дискоциты, в большинстве случаев примерно одинакового диаметра - около 7 мкм, а кривизна центрального углубления значительно варьирует. На малых полях сканирования можно исследовать тонкую структуру мембранной поверхности. В случае нормальных дискоцитов на их поверхности выявлены регулярные округлые выступы шириной 10-20 нм, как в углублении, так и на возвышенной части тора. При исследовании с помощью микрозонда с жесткостью 10 Н/м определяются упругие свойства эритроцитов в различных участках поверхности: жесткость на возвышенной части тора ниже, чем жесткость в центральном углублении [35].
В результате АСМ-исследования поверхности цитоплазматической мембраны эритроцитов при остром лимфобластном лейкозе было выявлено увеличение размеров эритроцитов до 9-10 мкм, а при уменьшении окна сканирования до 600 нм визуализировалась гранулярная структура поверхности цитоплазматической мембраны эритроцита с размером гранул от 10 до 50 нм [26].
Визуализация процессов адгезии и агрегации тромбоцитов методами АСМ позволили проследить поэтапно процесс адгезии тромбоцитов к чужеродной поверхности, при этом дисковидная форма тромбоцитов менялась на сферическую форму с образованием выростов - филлоподий (длина - 0,5-3,0 мкм, толщина 0,05-0,30 мкм), при дальнейшем развитии процесса - ламеллоподий (толщина до 70 мкм) [25]. Также АСМ использовался для изучения и других клеток крови человека, лимфоцитов. При исследовании мембранных и подмембранньїх структур лимфоцитов, отмечалось, что поверхность средних лимфоцитов (размер - 7,8 мкм) оказалась более гладкой по сравнению с поверхностью малых лимфоцитов (размер - 4,15 мкм) [41].
Подготовка препаратов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
На рисунке 36 в центре клетка с признаками койлоцитарной атипии (стрелка). Наличие койлоцитов - основной цитологический признак папилломавирусного поражения эпителия. Это клетки плоского эпителия неправильной формы, разного размера, с четкими контурами и наличием околоядерной зоны просветления с неровными границами и четко очерченной уплотненной цитоплазмой по периферии. Ядра ги-перхромные, разной степени увеличения, мембрана неровная, складчатая. Рядом с койлоцитом (справа) — клетка плоского эпителия с признаками дисплазии легкой степени. Выше и ниже койлоцита видны чешуйки плоского эпителия и клетки с «тающими ядрами» - признаки гиперкератоза. Остальные клетки без видимых патологических изменений.
На рис. 37 — трехмерное изображение (слева) и плоское (справа) АСМ-изображение, описанного выше койлоцита. В центральной части отмечена выпуклая зона, окруженная глубоким провалом, за которым виден подъем рельефа по периферии клетки. Сопоставляя эту картину с цитологическими изменениями, можно утверждать, что выпуклая зона соответствует ядру, углубление - зоне просветления цито плазмы, подъем рельефа по периферии клетки — зоне уплотнения цитоплазмы. На плоском АСМ-изображении видна тонкая белая линия, по которой проводили графический анализ рельефа. На графике рельефа отмечается пшрокий пик в центре (1608 нм), соответствующий ядру, углубления слева и справа от пика (969 нм) — зона просветления цитоплазмы, левый и правый пик от зоны углубления (1087 нм) — зона уплотнения цитоплазмы. При этом правый экстремальный пик соответствует прохождению линии графического анализа через крупное цитоплазматическое включение. Такое включение в виде пиков отчетливо наблюдается на трехмерном изображении слева.
Двуядерныйкойлоцит - это клетка, имеющая те же признаки, что и у выше описанного койлоцита, кроме двуядерности. Ядра расположены очень плотно друг к другу с образованием перемычки в виде «пенсне» (рис. 38). То, что выше описанные изменения плоского эпителия связаны с ПВИ было подтверждено позже методом по-лимеразно-цепной реакции.
На АСМ-изображении рельефа, которое, как ну предыдущих (и последующих) объектов проводится через различные вертикальные слои ядра и цитоплазмы, отмечается провал вокруг ядра (глубиной до 300 нм), в зоне уплотнения отмечался подъем высоты до 850 нм, высота поверхности в зоне ядра составляла 900 нм. Размер клетки 54 х 48 мкм (рисунок усредненной модели полученных данных - 39, графическое изображение - 40).
На рисунке 41 представлен фрагмент цитологического препарата пациетки с положительным результатом на 31 тип ВПЧ по ПЦР. В монослое стрелками отмечены клетки с различными цитологическими признаками, характерными для папилломави-русной инфекции. Этот фрагмент интересен тем; что здесь одномоментно можно наблюдать- все четыре цитоморфологические признаки ПВИ, отмеченные соответствующими стрелками (а, Ь, с, d).
Койлоцит - клетка характеризуется неправильной формой, четкими границами, увеличенным ядром со смазанным хроматином, зоной просветления цитоплазмы и зоной уплотнения цитоплазмы по периферии (рис. 41-а). На АСМ-изображении также отмечался провал вокруг ядра и всплеск высоты по периферии. Размер клетки 14x11 мкм2 На графическом изображении (по белой» графической линии) высота поверхности клетки в зоне ядра 1400 нм, в зоне просветления цитоплазмы высота 300 нм, в зоне уплотнения цитоплазмы 1300 нм (рис. 42). На рисунке 43 представлена усредненная модель полученных измерений. Дискератоцит- второй основной цитоморфологи ческий признак ПВИ. Это эпителиальная клетка небольших размеров, вытянутой формы, с вытянутым, гиперхромным ядром и плотной блестящей цитоплазмой (рис. 41-Ь).
На АСМ-изображении дискератоцита (через эту клетку проходит прямая белая линия, пересекающая ядро и цитоплазму) отмечается выраженная неоднородность плотности как цитоплазмы так и ядра с хаотичным чередованием полей светлых и темных участков. При анализе графического изображения отмечается, что высота цитоплазмы в одних участках до 1400 нм, а в других участках цитоплазмы - падение высоты до 800 нм, в зоне ядра высота поверхности клетки 1250 нм (рис. 44). На усредненной модели наших измерений наглядно виден небольшой перепад высот поверхности дискератоцита (рис. 54).
Паракератоцит - мелкая одиночная клетка плоского эпителия полигональной формы, с округлым ядром, расположенным центрально, со зрелой цитоплазмой (рис. 41-е). При АСМ-исследовании паракератоцита отмечалось, что значения высоты всей клетки были высокими. На графическом изображении паракератоцита не отмечалось больших перепадов высот между ядром (1550 нм) и цитоплазмой (1450 нм) (белая прямая линия в верхней части проходит через цитоплазму и ядро паракератоцита, а в нижней части рисунка линия проходит через безъядерную чешуйку) (рис. 46, усредненная модель - рис. 47).
Безъядерная чешуйка плоского эпителия, характерная для гиперкератоза-патологического ороговения (избыточное накопление в цитоплазме белков - цитоке-ратинов) с удалением (разрушением) ядер поверхностных клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия. Гиперкератоз тоже относится к второстепенным признакам ПВИ (рис. 41-d). В безъядерной чешуйке на АСМ-изображении отмечались более светлые и более темные участки. При сопоставлении с графическим изображением поверхности, колебания высоты в различных участках чешуйки (по белой графической линии) от 500 нм до 800 нм (рис. 48, рис. усредненной модели -49). Для наглядности полученные данные по АСМ-исследованию сведены в таблицу 13.
Из таблицы видно, что зона ядра является самым высоким участком поверхности клетки, как в клетках с признаками патологии, так и в клетках без патологических изменений. Исключение составляют наиболее плотные участки в цитоплазме диске-ратоцита. Высота поверхности безъядерной чешуйки намного превосходит высоту цитоплазматической зоны клетки нормы и ближе всего по значениям к зоне уплотнения цитоплазмы у койлоцитов и менее плотных участков цитоплазмы дискератоцита. Отмечается небольшая разность высот поверхности между ядром и зоной уплотнения цитоплазмы у койлоцитов, так же между ядром и более плотными участками цитоплазмы у дискератоцита.
Маленькая клетка - паракератоцит оказалась очень плотной, значения высоты поверхности несколько превышают высоту поверхности дискератоцита, а разность высот ядерной и всей цитоплазматической зоной невелика. При сопоставлении исследуемых образцов методом световой и атомно-силовой микроскопии мы выяснили, что клетки с различной патологией, различаемые в световой микроскопии по интен сивности окраски, форме ядра и цитоплазмы, при АСМ-исследовании отличались разностью высот цитоплазматической и ядерной зон поверхности клетки, что выступает как дополнительный признак для цитологической диагностики.
