Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1.1 Кристаллизация рибосом и их субчастиц, кристаллографические исследования и определение структур 10
1.2 Малая рибосомная субчастица рибосомы 13
1.2.1 Структурные и функциональные особенности малой субчастицы 13
1.2.2 Декодирующий центр 14
1.2.3 Морфологические элементы малой субчастицы 15
1.2.4 Структура 30S субчастицы в комплексе с антибиотиками 16
1.3 Большая рибосомная субчастица 18
1.3.1 Структура и функциональные центры большой субчастицы рибосомы 18
1.3.2 Структура РНК большой рибосомной субчастицы 18
1.3.3 Пептидилтрансферазный центр 22
1.3.4 ПТЦ - проторибосома 24
1.3.5 Центр, ассоциированный с ГТФазной активностью (ГАЦ) 25
1.3.6 Белки большой субчастицы 25
1.3.7 Структура 50S субчастицы в комплексе с антибиотиками 27
1.4 Структура 70S рибосомы 28
1.4.1 Межсубъединичные мостики 32
1.5 Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы 36
1.5.1 тРНК-связывающие сайты 36
1.5.1.1 А-сайт 36
1.5.1.2 P-сайт 39
1.5.1.3 Е-сайт 40 1.5.2 Инициация 41
1.5.3 Элонгация и декодирующий центр 44
1.5.4 Формирование пептидной связи 47
1.5.5 Транслокация 48
1.5.6 Терминация 49
1.5.7 Рибосома – молекулярная машина 51
1.6 Рибосомный белок L1 как составная часть L1-выступа и регулятор синтеза белков своего оперона 52
1.6.1 Белок L1, как составная часть L1-выступа 52
1.6.2 Белок L1 - репрессор, ингибирующий трансляцию мРНК своего оперона 55
Материалы и методы 61
2.1 Материалы 61
2.1.1 Химические реактивы и ферменты 61
2.1.2 Буферы 61
2.1.3 Среды 62
2.1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды 62
2.1.5 Приборы 62
2.2 Методы 63
2.2.1 Методы генной инженерии и микробиологии 63
2.2.1.1 Полимеразная цепная реакция 63
2.2.1.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле 64
2.2.1.3 Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами 64
2.2.1.4 Очистка фрагментов ДНК 64
2.2.1.5 Лигирование ДНК 65
2.2.1.6 Получение компетентных клеток 65
2.2.1.7 Трансформация клеток E. coli 65
2.2.1.8 ПЦР-анализ клонов 65
2.2.1.9 Выделение и очистка плазмидной ДНК 66 2.2.1.10 Рестрикция плазмидной ДНК для транскрипции и ее последующая очистка 66
2.2.1.11 Экспрессия генов белка L1 и его мутантных форм в клетках Е. coli 66
2.2.2 Выделение и очистка белков 67
2.2.2.1 Выделение белка L1 из клеток Е. coli 67
2.2.2.2 Катионообменная хроматография на смоле СМ-Sepharosе 67
2.2.2.3 Аффинная хроматография на смоле Heparin- Sepharosе 67
2.2.2.4 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН 68
2.2.2.5 Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях 68
2.2.2.6 Проверка наличия/отсутствия РНКазной активности в полученном препарате белка 69
2.2.3 Выделение и очистка РНК 69
2.2.3.1 Получение специфических фрагментов рРНК 69
2.2.3.2 Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях 70
2.2.3.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих условиях 71
2.2.4 Получение и кристаллизация мутантных форм белка L1 и РНК-белкового комплекса 71
2.2.5 Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса 71
2.2.5.1 Биотинилирование фрагментов РНК 71
2.2.5.2 Модификация поверхности чипа 72
2.2.5.3 Определение констант ассоциации и диссоциации методом поверхностного плазмонного резонанса 73
Результаты и их обсуждение 74
3.1 Пространственная структура изолированного полноразмерного L1-выступа рибосомы 74
3.1.1 Получение и кристаллизация комплекса TthL1-рРНК 75
3.1.1.1 Клонирование гена специфического фрагмента рРНК 75
3.1.1.2 Получение фрагмента рРНК 76 3.1.1.3 Выделение и очистка рибосомного белка L1 76
3.1.1.4 Электрофоретический анализ комплексов белка L1 с фрагментами рРНК 3.1.1.5 Кристаллизация полноразмерного L1-выступа 79
3.1.2 Анализ структуры комплекса TthL1-рРНК 80
3.1.2.1 Структура фрагмента 23S рРНК 80
3.1.2.2 Взаимодействие белка L1 и рРНК в полноразмерном L1-выступе рибосомы 82
3.1.2.3 Вероятная роль спирали Н78 23S рРНК и домена II рибосомного белка L1 в функционировании рибосомы 83
3.1.2.4 Кинетический анализ комплексов белка L1 с фрагментами рРНК 84
3.1.2.5 Влияние неконсервативных взаимодействий на сродство L1 к РНК 86
3.2 Структурно-кинетические исследования влияния замен консервативного Тhr217 на РНК-связывающие свойства белка и его структуру, как в свободном состоянии, так и в комплексе с РНК 88
3.2.1 Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм белка L1 со специфическим фрагментм РНК 88
3.2.2 Кристаллизация белка TthL1 с заменой Thr217Val иего комплекса с РНК 89
3.2.3 Анализ структур TthL1 Thr217V и TthL1 Thr217V-рРНК 91
3.2.4 Кристаллизация TthL1 с заменой Thr217Ala в комплексе с РНК 91
3.2.5 Анализ структуры TthL1 Thr217Аla-рРНК 92
3.3 Роль N-концевой спирали 1 TthL1 во взаимодействии белка с РНК 92
3.4. Влияние С-концевых положительно заряженных аминокислотных остатков архейного белка L1 на взаимодействие белка с РНК 96
3.4 Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК 100
Выводы: 105
Список литературы 106
- Малая рибосомная субчастица рибосомы
- Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы
- Полимеразная цепная реакция
- Структура фрагмента 23S рРНК
Введение к работе
Актуальность проблемы
L1-выступ (L1-протуберанец) большой субчастицы рибосомы, содержащий белок L1 и спирали H76, H77 и H78 23S рРНК, является одним из наиболее подвижных элементов рибосомы, он способствует высвобождению деацилированной тРНК из Е-сайта в процессе трансляции. В течение долгого времени именно подвижность L1-выступа затрудняла определение его детальной трехмерной структуры в составе интактной рибосомы. Рибосомный белок L1 также интересен тем, что выполняет в клетке и внерибосомную функцию – является регулятором экспрессии генов своего оперона.
В лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН были определены кристаллические структуры рибосомного белка L1 из бактерий и архей, их комплексов с матричной РНК, а также структура гибридного комплекса архейного рибосомного белка L1 из Sulfolobus acidocaldarius (SacL1) c фрагментом 23S рРНК Thermus thermophilus, содержащим спирали Н76 и Н77. Данная структура комплекса L1 с укороченным фрагментом рРНК более 10 лет использовалась при построении моделей как бактериальной, так и архейной рибосом. Однако отсутствие структурных данных для полноразмерного L1-выступа не давало возможности проанализировать РНК-белковые взаимодействия, приводящие к удалению деацилированной тРНК из Е-сайта рибосомы.
В данной работе впервые с высоким разрешением (2,0 ) определена структура полноразмерного бактериального L1-выступа T. thermophilus, проведён детальный сравнительный структурно-кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий белка-регулятора L1 в рибосомном комплексе и в его комплексе с матричной РНК. В рамках диссертационной работы исследовано влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Т .thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства
Цель работы
Целью данной работы является определение структуры полноразмерного изолированного L1-выступа бактериальной рибосомы T. thermophilus с атомным разрешением, углубленное исследование РНК-белковых взаимодействий и изучение роли отдельных структурных элементов рибосомного белка L1 во взаимодействии с РНК, определение структурной основы регуляторных свойств рибосомного белка L1. Основные экспериментальные задачи: Получение 80-нуклеотидного специфического фрагмента 23S рРНК Thermus thermophilus, содержащего спирали H76, H77 и H78, для структурных и кинетических исследований. Получение пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов рибосомного белка L1 T. thermophilus (TthL1) и его мутантных форм в комплексе с данным специфическим фрагментом рРНК. Кинетический анализ взаимодействия TthL1 и его мутантных форм со
специфическим фрагментом рРНК T. thermophilus. Исследование влияния электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК.
Научная новизна и научно-практическая значимость
В рамках данной работы были получены кристаллы и определена с высоким разрешением (2,0 ) структура полноразмерного изолированного L1-выступа из термофильной бактерии T. thermophilus.
Показано наличие в рибосомном комплексе, по сравнению с комплексом TthL1-мРНК, двух дополнительных участков РНК-белкового взаимодействия. Один участок образован аминокислотными остатками спирали 1 домена I TthL1, а второй – петлями 5-6 домена II белка.
Структурные элементы, образующие дополнительные участки L1-связывания на рРНК (спираль H78 и петля В), отсутствуют в структуре мРНК, что обусловливает меньшее сродство рибосомного белка L1 к мРНК и, соответственно, регуляторные свойства белка.
Для детального исследования РНК-белковых взаимодействий в L1-РНК комплексе были получены кристаллы и определены структуры нескольких мутантных форм белка TthL1 как в изолированном состоянии, так и в комплексе c тем же самым фрагментом 23S рРНК T. thermophilus, что использовался при кристаллизации комплекса с белком дикого типа.
Показано, что, несмотря на изменения в структуре белков TthL1 c мутациями в участке связывания с РНК, комплементарность поверхностей РНК и белка, а также их взаимное расположение в комплексе полностью сохраняется.
Полученные в данной работе результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структурной организации рибосомы и дают возможность выявить детали и принципы специфического РНК-белкового взаимодействия.
Публикации
Основные результаты диссертации опубликованы в 6 печатных работах, в том числе в 3 статьях.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях.
Структура диссертации
Малая рибосомная субчастица рибосомы
Работа по кристаллизации рибосом и их субчастиц была начата более трех десятилетий назад. Рибосома считалась плохо кристаллизуемым объектом из-за внутренней неупорядоченности и подвижности ее отдельных элементов, функциональной гетерогенности и сложного химического состава.
Первые трехмерные микрокристаллы рибосом были получены в начале 80-х годов. Для кристаллизации были выбраны рибосомы бактерий и архей, которые обитают в экстремальных условиях окружающей среды (высокая концентрация соли, высокая температура). В 1980 году А. Йонат (Институт Вейцмана, Израиль), Виттману (Институт Макса Планка, Германия) и сотрудникам удалось получить первые кристаллы большой рибосомной субчастицы умеренно термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus (Вst50S) (Yonath, et al., 1980), а позднее – кристаллы 50S рибосомной субчастицы галофильной археи Halobacterium marismortui (Нma50S) (Makowski et al., 1987). Первые кристаллы 30S субчастиц (Tth30S) и рибосом из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tth70S) были получены в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка (Trakhanov et al., 1987; Yusupov et al., 1987; Trakhanov et al., 1989) и в лаборатории Йонат (Yonath et al.,1988). Несмотря на большой размер кристаллов рибосом и их субчастиц (до 2 мм длиной у Вst50S) (Yonath et al., 1983; Yonath et al., 1986; Hansen et al., 1989; von Bohlen et al., 1991), они довольно плохо отражали рентгеновские лучи. Кроме того, мощности существующих генераторов не хватало для получения удовлетворительной дифракционной картины. Когда стало доступным использование синхротронного излучения высокой интенсивности, сильное радиационное воздействие на кристаллы рибосом стало причиной их быстрого разрушения при съемке. Для решения этой проблемы был применен новаторский подход набора данных с охлажденных до температуры жидкого азота кристаллов, что позволило значительно улучшить дифракционную картину.
Другой подход заключался в использовании ионов металлов при кристаллизации или посткристаллизационной обработке рибосом и их субчастиц. Добавление небольшого количества ионов металлов (Cd2+) при кристаллизации Нma50S позволило улучшить предел разрешения кристаллов с 6 до 2,8 . Нестабильность 30S субчастиц долгое время была причиной низкого (10 ) разрешения кристаллов (Yonath et al., 1988; Trakhanov et al., 1989). Получение тяжелоатомных производных с кристаллов Tth30S с помощью вымачивания их в растворе соединения, содержащего 18 атомов вольфрама, привело к повышению предела разрешения с 7-9 до 3,3 (Schluenzen et al. 2000). Схожий результат был получен при использовании гексаминхлорида осмия (Clemons et al., 1999). По всей видимости, при связывании ионов тяжелых металлов с рРНК и/или белками происходило уменьшение подвижности некоторых элементов рибосомы.
Период конца 90-х годов - начала 2000-х отмечен получением первых структур рибосом и их субчастиц с достаточно высоким разрешением. При определении структур широко использовалось синхротронное излучение и метод многоволнового аномального рассеяния (MAD) с использованием солей лантаноидов, осмия и иридия. Таким образом, усовершенствование условий роста кристаллов и методов сбора данных привело к быстрому прогрессу в определении структуры рибосомы. Кристаллизация рибосом с лигандами (тРНК, мРНК и факторами трансляции) также позволила улучшить качество кристаллов (Yonath, 2009).
Первая модель структуры 50S субчастицы H. marismortui с разрешением 9 (Ban et al., 1998) была определена в 1998 году в группе Стейца, а уже год спустя было сделано уточнение структуры до 5 (Ban et al., 1999). На картах электронной плотности с разрешением 9 была четко видна лишь плотность, соответствующая 23S рРНК. В модель были вписаны определенные ранее кристаллические структуры 10 рибосомных белков, сарцин-рициновой петли (СРП) 23S РНК, участка РНК, связывающегося с белком L11 и фрагмента 5S рРНК. В уточненной модели структуры Нma50S с разрешением 5 нанесены как крупные, легко узнаваемые структурные элементы большой субчастицы, так и отдельные фрагменты рРНК и белки. Кроме того, в рамках данной структуры, была предложена модель взаимодействия факторов трансляции с рибосомой.
В 2000 г. опубликована первая структура рибосомной субчастицы с высоким (2,4 ) разрешением (Ban et al., 2000). При этом разрешении удалось увидеть молекулы воды, металлов, модификации оснований рРНК. В группах Томаса Стейтца и Питера Мура была определена структура большой субчастицы в изолированном состоянии и в комплексе с аналогами 3 -концевой части тРНК (Ban et al., 2000; Nissen et al., 2000). В группе А. Йонат определена структура 50S субчастицы из мезофильного организма Deinococcus radiodurans (Dra50S) с разрешением 3,1 (Harms et al., 2001).
В это же время в группе В. Рамакришнана была определена структура Tth30S с разрешением 5,5 (Clemons et al., 1999), а в группе А. Йонат получена структура 30S субчастицы с разрешением 4,5 (Tocilj et al., 1999).
Первые модели структуры малой субчастицы рибосомы позволили увидеть узнаваемую морфологию субчастицы, некоторые белки, а также обозначить область 16S рРНК, с которой связывается мРНК при формировании инициаторного комплекса. Год спустя были опубликованы структуры 30S субчастицы с высоким разрешением - 3,3 (Schluenzen et al., 2000) и 3 (Wimberly et al., 2000, Clemons et al., 2001). Данные структуры содержали все упорядоченные области 16S рРНК и 20 рибосомных белков. Показано, что отсутствие белка S1 способствует получению упорядоченных кристаллов 30S субчастиц, отражающих рентгеновские лучи с высоким разрешением. Получение структур с атомным разрешением позволило суммировать биохимические и структурные данные и получить интересную информацию о структуре и функции 30S субчастицы.
В группе Г. Ноллера была определена структура 70S рибосомы T. thermophilus (Тth70S) в комплексе с тРНК и мРНК с разрешением 7,8 (Cate et al., 1999). Позднее была получена модель структуры 70S рибосомы, содержащей 3 молекулы тРНК и мРНК, с разрешением 5,5 (Yusupov et al., 2001). В данной работе были также определены структурные свойства РНК-РНКовых и РНК-белковых мостиков, соединяющих субчастицы. В 2005 была представлена модель структуры рибосомы E. coli без лигандов с разрешением 3,5 (Schuwirth et al., 2005), которая значительно улучшила понимание взаимодействий внутри рибосомы и ее конформационной подвижности на молекулярном уровне. Следующим шагом было определение структуры рибосом T. thermophilus и E. coli с аналогом мРНК и двумя тРНК с разрешением 3,7 и 2,8 , соответственно (Korostelev et al., 2006; Selmer et al., 2006). Структурные исследования рибосомы были направлены на понимание ключевых аспектов ее функционирования, таких как связывание тРНК, декодирование мРНК, формирование пептидной связи, связывание с антибиотиками. Были получены модели структуры 70S рибосомы с различными факторами трансляции (Gao et al., 2009; Schmeing et al., 2009), детально описан механизм формирования пептидной связи (Gindulyte et al., 2006), прояснен механизм выбора тРНК, соответствующей кодону мРНК в А-сайте (Ogle et al., 2001) и многое другое.
Форма 30S субчастицы была схожа с моделями, полученными методами электронной микроскопии (ЕМ) и реконструкции с помощью криоэлектронной микроскопии (криоЕМ). Форма субчастицы определяется, в основном, 16S рРНК.
В структуре 30S субчастицы традиционно выделяют несколько основных морфологических элементов: «головку», боковой выступ или «платформу» и «тело». Каждый из этих элементов образован отдельным доменом 16S рРНК (Woese et al., 1983) и связанными с ним рибосомными белками (Schluenzen et al., 2000; Wimberly et al., 2000; Schuwirth et al., 2005) (Рис. 1).
Вторичная структура 16S рРНК, которая содержит 45 спиралей, представлена на рисунке 1А. 5 -домен формирует «тело», центральный домен – «платформу», а 3 -концевой минорный домен - «головку» и «тело» в межсубъединичном пространстве. Четыре домена рибосомной РНК радиально расходятся от центральной точки, расположенной в области «шеи» субчастицы. В этой области РНК упакована наиболее плотно, поскольку она является очень важной для функционирования частью субчастицы (Wimberly et al., 2000). При рассмотрении трехмерной структуры 30S субчастицы видны три продольные спирали РНК (h44, h7 и h16/17), идущие вдоль длинной оси субчастицы.
Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы
Центральным событием в биосинтезе белка является пептидилтрансферазная реакция, в ходе которой происходит нуклеофильная атака карбоксильной группы пептидил-тРНК -аминогруппой аминоацил-тРНК, приводящая к образованию пептидной связи. На 50S субчастице 3 -концы Р-сайтовой и А-сайтовой тРНК сближены в ПТЦ, тогда как 3 -конец E-сайтовой тРНК находится на расстоянии около 50 от ПТЦ.
ПТЦ расположен в V домене 23S рРНК, он представляет собой высоко консервативную область из 180 нуклеотидов (А - и Р-петли). Несмотря на то, что 15 белков связано с V доменом 23S рРНК H. marismortui, нет ни одного белка, который был бы расположен ближе, чем на 18 к ПТЦ.
В модели структуры полной рибосомы T. thermophilus белок L27 взаимодействует с ССА концом тРНК в Р-сайте. Рибосомы, лишенные белка L27, обладают заметно сниженной пептидилтрансферазной активностью (Wower et al., 1998).
В Нma50S нет гомологов L27, его место занято белком L21е, который не имеет контактов с Р-сайтовой тРНК. Было высказано предположение, что рибосомы из галофильных микроорганизмов не нуждаются в посреднике для связывания тРНК из-за высокой концентрации соли (A. Yonath, 2002).
Весьма вероятно, что роль рибосомных белков, важных для пептидилтрансферазной активности, сводится к поддержанию пространственной структуры 23S рРНК. Это было, в частности, показано для белка L16 (Teraoka and Nierhaus, 1978). Сам же ПТЦ, вероятно, сформирован лишь из нуклеотидов 23S рРНК (Barta et al., 1984; Nissen et al., 2000).
«Стенки» пептидилтрансферазного центра состоят из А- и Р-петель (Рис. 4), А-петля удерживает ССА конец тРНК в А-сайте, при этом С74 тРНК взаимодействует с нуклеотидом U2590, С75 формирует Уотсон-Криковскую пару с G2588, в то время как А76 контактирует с U2590 и G2618. Р-петля удерживает акцепторный конец тРНК Р-сайта, нуклеотиды С74 и С75 образуют Уотсон-Криковские пары с G2284 и G2285 соответственно, при этом А76 взаимодействует с рибозой А2486 и образует водородную связь с ее 2 -гидроксильной группой (нумерация нуклеотидов соответствует H. marismortui). Рис. 4. Структура пептидилтрансферазного центра рибосомы. А. Изображение большой субчастицы рибосомы H. marismortui, на котором отмечено положение пептидилтрансферазного центра. Р-петля отмечена голубым, А-петля – красным, стенки ПТЦ отмечены желтым цветом. Б. А-петля (зеленая) связывает ССА конец (синий) аналога субстрата, расположенного в А-сайте. В. Р-петля (зеленая) формирует Уотсон-Криковские пары с нуклеотидами С74 и С75 пептидил тРНК. Прерывистые линии показывают водородные связи (Рисунок взят из Simonovic et al., 2009). «Дно» ПТЦ открывается в тоннель выхода полипептида (Simonovic et al., 2009). ПТЦ выглядит как карман с выходящим из него тоннелем, через который растущий полипептид покидает рибосому. В Dra50S тоннель образован компонентами доменов III и I 23S рРНК и некоторыми белками (L4, L22, L23, L24 и L29). В Hma50S дополнительно два белка (L31e и L39e) являются частью нижнего участка тоннеля.
ПТЦ присуща псевдозеркальная симметрия, не характерная для остальных элементов рибосомы (Yonath and Bashan, 2004, Wekselman et al., 2009). Было высказано предположение, что древняя проторибосома могла формировать пептидную связь с участием молекулы РНК, способной димеризоваться (димерного рибозима).
Одним из наиболее интересных и распространенных структурных мотивов рРНК являются А-минорные взаимодействия. В таком мотиве остатки аденозина одноцепочечных областей рРНК встраиваются в малый желобок соседней спирали рРНК, при этом образуются как водородные связи, так и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия между контактирующими участками рРНК.
А-минорные взаимодействия не только образуют много важных структурных контактов, они также тесно связаны с функцией рибосомы (Rodnina and Wintermeyer, 2009). Двойные спирали и «стопки» аденозинов, образующие с ними А-минорные связи, распределены по шести доменам молекулы 23S рРНК более или менее хаотично, за единственным исключением: в V домене наблюдается необычное скопление двойных спиралей, и практически нет аденозиновых «стопок». Таким образом, А-минорные взаимодействия, образуемые пятым доменом, являются однонаправленными (Bokov and Steinberg, 2009). Этот факт может свидетельствовать о том, что эволюция молекулы 23S рРНК могла начаться с домена V или с какой-то его части.
А-минорные взаимодействия необходимы для поддержания стабильной трехмерной структуры той части молекулы, к которой принадлежит аденозиновая «стопка», но они не влияют на стабильность той ее части, к которой принадлежит двойная спираль. Если предположить, что 23S рРНК развивалась постепенно из простой молекулы-предшественницы, то сначала должны были появляться двойные спирали, и только потом к ним могли «пристраиваться» аденозиновые «стопки». Поскольку в V домене находится важный функциональный центр рибосомы – ПТЦ, Боковым и Штейнбергом была высказана гипотеза, что ПТЦ является проторибосомой, способной удерживать две молекулы тРНК и сближать в пространстве прикрепленные к ним аминокислоты. 1.3.5 Центр, ассоциированный с ГТФазной активностью (ГАЦ)
Данный центр стимулирует ГТФазную активность белковых факторов трансляции. В отличие от ПТЦ, образованного, в основном, 23S рРНК, ГАЦ включает большей частью белки: L7/L12 выступ, белок L11 и его участок связывания (спирали Н43-Н44), а также сарцин-рициновую петлю 23S рРНК (спираль Н95). Протуберанец L7/L12 является единственным морфологическим элементом рибосомы, построенным, в основном, из белков. В его состав входит четыре копии (два димера) белка L7/L12 и одна копия белка L10.
С центром связывания факторов связывается два фактора элонгации трансляции (EF-G и EFu), фактор инициации IF2 и фактор терминации RF3, все эти белки являются ГТФазами, связывание с этой областью рибосомы стимулирует их ГТФазную активность (Ban et al., 1999). Белки L12 (белок L7 является N-ацетилированной формой белка L12) и L10 вовлечены во взаимодействие с факторами трансляции.
Белки большой субчастицы Белки рассеяны по всей структуре и сосредоточены, в основном, на поверхности субчастицы. Однако, область, обращенная к 30S субчастице, а также ПТЦ образованы РНК. Общей особенностью многих рибосомных белков являются длинные, нерегулярные петли, которые проходят сквозь субчастицу между спиралей рРНК. В отличие от сферических вирусов, где белки образуют оболочку вокруг нуклеиновой кислоты, с которой они ассоциированы, и от нуклеосомы, где белки, напротив, окружены нуклеиновой кислотой, белки большой субчастицы действуют скорее как строительный раствор, заполняя бреши в скелете, образованном рРНК.
Белки расположены по поверхности субчастицы относительно равномерно (Рис. 5), за исключением поверхностей, взаимодействующих с малой субчастицей, и ПТЦ рибосомы. Если смотреть сбоку, то белки формируют как бы решетку поверх ядра из рРНК (Рис. 5). Все белки в субчастице, за исключением L12, взаимодействуют напрямую с рРНК, и все, кроме 7 белков (L1, L10, L11, L24, L29, L18e, L7e), взаимодействуют более чем с одним доменом рРНК. Белок L22 контактирует со всеми 6 доменами 23S рРНК.
Полимеразная цепная реакция
Амплификацию фрагмента ДНК проводили с использовнием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Температуру отжига олигонуклеотидов определяли с помощью программы “Gene Runner 3,0” (Hastings Software, США). Реакционная смесь (50 мкл), содержала буфер для ProofStart ДНК-полимеразы, смесь дезоксирибонуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP в концентрации 0,35 мМ каждого), олигонуклеотиды-праймеры (по 100 пМ каждого), Mg2+ 2,5 мM, 50 нг плазмидной ДНК и 1,2 единицы активности ProofStart ДНК-полимеразы (QIAGEN). ПЦР-реакции проводились в амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer, Inc., США). Программа амплификации представлена в таблице 2. После окончания ПЦР двадцатую часть реакционной смеси анализировали электрофорезом в геле агарозы. Продукт ПЦР выделяли в чистом виде с помощью фирменного набора QIAquick PCR Purification Kit. Табл. 2. Программа амплификации ПЦР-фрагмента.
Рестрикцию ДНК проводили с использованием сайт-специфических эндонуклеаз Hind III и Xmal. Обработку плазмидной ДНК (6 мкг), а также ПЦР-фрагментов (6 мкг) проводили последовательно и раздельно, с добавлением БСА до конечной концентрации 0,1 мг/мл в объеме 35 мкл в течение 3 часов при температуре 37С. Количество фермента соответствовало рекомендациям фирмы - производителя. Для оценки полноты рестрикции реакционную смесь и анализировали электрофорезом в агарозном геле. После обработки первой эндонуклеазой рестрикции плазмидную ДНК/ПЦР-фрагмент очищали с помощью фирменного набора QIAquick PCR Purification Kit. После обработки второй эндонуклеазой рестрикции плазмидную ДНК/ПЦР-фрагмент очищали элюцией из агарозного геля (материалы и методы, 2.2.1.4) разделяли при помощи электрофореза в 1 или 2% агарозном геле с бромистым этидием при комнатной температуре. Гель анализировали в ультрафиолете и зоны геля, содержащие целевые фрагменты, вырезали. Экстракцию образца из геля проводили с использованием фирменного набора QIAquick Gel-Extraction Kit в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. 2.2.1.5 Лигирование ДНК
Лигирование ПЦР-фрагментов ДНК и плазмидной ДНК, обработанных эндонуклеазами рестриции, проводили в течение ночи при 22С в объеме 20 мкл: 2 мкл буфера 10-ти кратной концентрации, вектор, ПЦР-фрагмент, 2 единицы активности фермента Т4 ДНК лигаза (ThermoScientific). В одну реакцию мы добавляли 100 нг плазмидной ДНК, а количество вставки подбиралось таким образом, чтобы молярное соотношение вектор: вставка составило 1:5. Для последующей трансформации использовали всю лигазную смесь.
Клетки E.coli штаммов BL21(DE3) и XLl-Blue высевали на чашки с агаризованной LB-средой и инкубировали при 37С в течении ночи . Затем несколько колоний засевались в 50 мл среды (SOB) и растили при 37С до оптической плотности ODs90=0,5 ОЕ, осаждали клетки при 10 минут 3000g, ресуспендировали в 16 мл буфера ТВ, снова осаждали клетки 10 минут при 3000g, ресуспендировали в 4 мл буфера ТВ, и добавляли 280 мкл DMSO. Суспензию разделяли на аликвоты по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С.
Для трансформации использовали 200 мкл суспензии компетентных клеток. К компетентным клеткам добавляли 20-50 нг плазмидной ДНК или лигазную смесь, содержащую 100 нг ДНК, и помещали на 40 мин в лед. Температурный шок проводили при 42С в течение 40 сек. После охлаждения на льду (5 мин) к клеткам добавляли 0,8 мл среды LB и инкубировали в течение 1 часа при 37С. Клетки осаждали центрифугированием (5000g, 1 мин) и ресуспендировали в 100 мкл LB среды. Клеточную суспензию наносили на чашки с агаризованной средой LB и антибиотиком (100 мкг/мкл и 50 мкг/мкл ампициллина и канамицина, соответственно), а затем инкубировали при 37С в течение ночи.
Анализ полученных после транформации лигазной смесью клонов проводили методом ПЦР. Половину выросшей после трансформации лигазной смесью колонии пересевали на твердую селективную среду, половину ресуспендировали в 30 мкл деионизованной воды. Раствор кипятили 5 минут и затем центрифугировали в течение 5 минут при 13400 об/мин. Для проведения ПЦР брали 1 мкл супернатанта. Анализ клонов проводился с помощью ПЦР в объеме 25 мкл. Праймеры выбирались так, чтобы один был специфичен к плазмиде (pUC18 for), а другой к гену (rRNA rev). Реакционная смесь (25 мкл) содержала 1 мкл клеточной суспензии, 2,5 мкл буфера 10-ти кратной концентрации, 1 ед. активности Taq ДНК полимеразы (СибЭнзим), смесь дезоксирибонуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP в концентрации 0,35 мМ каждого), олигонуклеотиды-праймеры (по 25 пМ каждого). После окончания реакции 5 мкл смеси анализировали в агарозном геле.
Рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку, были переданы в компанию «Синтол» для секвенирования.
Изолированную колонию клеток штамма XL1-Blue, трансформированную плазмидой, инокулировали в 5/1000 мл жидкой среды LB, содержащей антибиотик, и растили в течение ночи при температуре 37С при интенсивном перемешивании (200 об/мин). Клетки осаждали центрифугированием (14000g, 3/30 мин). Выделение плазмидной ДНК из биомассы клеток проводили с помощью наборов QIAquick Spin Miniprep Kit/QIAGEN Plasmid Maxi Kit в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.
Рестрикция плазмидной ДНК для транскрипции и ее последующая очистка
Рестрикцию плазмидной ДНК (0,5 мг) проводили с использованием сайт-специфической эндонуклеазы SmaI или EcoRI в буфере, поставляющимся фирмой производителем, в объеме 500 мкл в течение 3 часов при 37С. Для проверки полноты рестрикции отбирали пробу из реакционной смеси и анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле. Для очистки ДНК от белков использовали фенольную депротеинизацию. Раствор ДНК смешивали с равным объемом фенола, насыщенного водой, и тщательно встряхивали до образования однородной эмульсии. Для разделения фаз эмульсию центрифугировали (14000g, 3-5 мин). Водную (верхнюю) фазу аккуратно отбирали и смешивали с равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (соотношение 24/1). После перемешивания и центрифугирования водную фазу отбирали, ДНК осаждали добавлением 1/10 объема 3М Na-Ацетата, рН 5,5 и этанола (2,5 объема), выдерживали при -20С в течение ночи. Агрегировавшую ДНК собирали центрифугированием (14000g, 30 мин, 4С) и растворяли в деионизированной воде.
Клетки E. coli BL21(DE3), трансформировали плазмидой, содержащей ген рибосомного белка L1 T.thermophilus, и засевали в жидкую среду LB (ампициллин 100 мкг/мл, канамицин 50 мкг/мл). При экспрессии MjaL1 клетки трансформировали также плазмидой pUBS 520, которая несет ген аргининовой тРНК, узнающий редкие для E.coli кодоны аргинина AGA и AGG, а также ген kan, обусловливающий устойчивость к канамицину. Растили при 37С с интенсивным перемешиванием (200 об/мин) до оптической плотности OD590=0,5 ОЕ, после чего в среду добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ. После добавления индуктора клетки продолжали инкубировать в тех же условиях в течение 3 часов.
Структура фрагмента 23S рРНК
Показано, что никаких изменений в структуре мутантного белка и его комплекса с рРНК, по сравнению со структурой белка дикого типа и его комплекса с рРНК, не наблюдается. Исходя из полученных данных, можно предположить, что наличие спирали а1 в белке увеличивает дискриминацию между мРНК и рРНК, обеспечивая надежную регуляцию трансляции белков L1 оперона. N-концевая часть спирали al ТШЛсодержит значительный положительный заряд. Для выявления влияния положительно заряженных остатков на сродство белка и РНК мы воспользовались определенной ранее структурой рибосомного белка из L1 археи Methanococcus jannaschii, так как в стуктурах белков семейства LI N- и С-концы пространственно сближены.
Влияние С-концевых положительно заряженных аминокислотных остатков архейного белка MjaL1 на взаимодействие белка с РНК В отличие от других бактериальных и архейных белков L1 на С-конце аминокислотной последовательности рибосомного белка L1 из археи Methanococcus jannaschii (MjaL1) имеется неконсервативный кластер, содержащий 6 аминокислотных остатков лизина. MjaL1 имеет высокую скорость взаимодействия и образует очень стабильный комплекс с РНК.
Данный С-концевой участок в свободном белке MjaL1 (Nevskaya et al., 2000) и в комплексе MjaL1-мРНК неупорядочен и не виден на карте электронной плотности (Nevskaya et al., 2006). В нашей лаборатории была создана мутантная форма белка MjaL1 (MjaL1_8C), лишенная восьми С-концевых аминокислотных остатков (KKEKAKKK). Плазмида, несущая ген мутантной формы белка, была предоставлена Никоновой Е.. Белок был выделен, очищен и закристаллизован.
Наблюдались отличия при кристаллизации мутантного белка: MjaL1_8C образовывал более стабильные кристаллы, чем белок дикого типа, они не таяли при повышенной температуре, в отличие от кристаллов MjaL1, которые приходилось зашивать в парах глутарового альдегида (Tischenko et al., 1998). Условия кристаллизации и фото полученных кристаллов представлены в таблице 12.
Кроме этого, образуется два солевых мостика с боковыми группами аминокислотных остатков лизина, принадлежащих симметричным молекулам белка. Все эти факторы повлияли на качество кристаллов мутантной формы белка и повысили их предел разрешения. На источнике синхротронного излучения кристаллы MjaL1 отражали с пределом разрешения 1,85 , кристаллы MjaL1_8C даже на лабораторном источнике рентгеновского излучения отражали с более высоким разрешением – 1,75 . Отсутствие неупорядоченного заряженного участка привело к получению более упорядоченных и стабильных кристаллов белка.
Кинетические исследования взаимодействия MjaL1_8C с мРНК показали, что отсутствие 8 С-концевых аминокислотных остатков (KKEKAKKK) не влияет на взаимодействие MjaL1_8C с РНК. Стабильность комплексов MjaL1_8C-мРНК не изменилась, а константа скорости ассоциации уменьшилась всего в 2 раза (Табл. 13). Табл. 13. Кинетические данные взаимодействия MjaL1 и его мутантной формы MjaL1-8C со специфическим фрагментом Кроме того, мы показали, что в отличие от ранее опубликованных данных (Kohrer et al., 1998), не наблюдается зависимости между стабильностью РНК-белковых взаимодействий и термальной устойчивостью микроорганизмов. Так, MjaL1 и АаеL1 являются рибосомными белками из гипертермофильных организмов, однако их сродство к РНК отличается почти на 3 порядка (Табл. 14).
Восемь аминокислотных остатков N-концевой спирали TthL1 важны как для взаимодействия с мРНК (образует 2 водородные связи), так и для взаимодействия с рРНК (образует 6 водородных связей). С-концевой участок белка MjaL1, содержащий 6 аминокислотных остатков лизина, оказывает слабое влияние на ассоциацию с мРНК и никакого влияния на стабильность комплекса. Поскольку комплекс MjaL1 с рибосомной РНК обладает очень высокой скоростью ассоциации и очень низкой скоростью диссоциации (даже в присутствии 1 М NaCl), значения которых находятся на грани чувствительности прибора, мы не обнаружили вообще никаких отличий во взаимодействии с рРНК мутантной формы белка MjaL1 по сравнению с белком дикого типа.
Отсюда можно сделать вывод, что влияние спирали a1 на сродство белка к рРНК определяется дополнительными водородными связями ее N-конца со спиралью Н78 рРНК, а не ее зарядом.
Многие РНК-связывающие белки заряжены положительно, вероятно, важную роль в образовании и стабильности их комплексов с РНК играют электростатические взаимодействия между аминокислотными остатками лизина, гистидина и аргинина и сахаро-фосфатным остовом РНК (Ahmad et al, 2011). Для изучения вклада электростатических взаимодействий в стабильность и формирование комплекса L1-мРНК мы провели кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий, как в условиях с различными значениями рН (от 6,5 до 8,5), так и при увеличении ионной силы (от 150 мМ до 1 М NaCl) (Сарских и др., 2013).
ППР эксперименты показали, что при изменении концентрации NaCl от 150 до 1000 мМ константа скорости ассоциации уменьшается в 206 раз, а константа скорости диссоциации увеличивается всего в 5 раз (Табл. 15).
Аналогичное влияние изменения концентрации соли на константы скорости ассоциации РНК-белковых комплексов было описано в работах (Katsamba et al., 2002, Auweter et al., 2006)
Рибосомный белок TthL1, как и большинство других рибосомных белков, имеет изоэлектрическую точку в щелочной области рН (рI=9,4). Изменение ионной силы влияет на распределение зарядов и на белке, и на РНК. Чем выше ионная сила раствора, тем больше ионное окружение молекул. Взаимодействие белка с молекулой РНК приводит к вытеснению ионов в окружающий раствор. Таким образом, увеличение концентрации соли препятствует связыванию белка, значительно уменьшая скорость ассоциации (GuhaThakurta et al., 2000) как при специфическом, так и неспецифическом взаимодействии.
Для изучения влияния рН раствора на формирование и стабильность комплекса белка L1-мРНК мы варьировали значения рН от 6,5 до 8,5. Результаты кинетических экспериментов были проанализированы и определены константы скоростей ассоциации, диссоциации, а также равновесная константа диссоциации комплексов. Данные представлены в таблице 16.
Показано, что изменение значения рН влияет в равной степени как на константу ассоциации, так и на константу диссоциации. Данное влияние может быть связано с изменением заряда боковых групп аминокислотных остатков, расположенных на участке взаимодействия с РНК. Так, при изменении значения рН могут протонироваться или депротонироваться боковые группы следующих аминокислотных остатков: His3, Lys5, Arg6, Tyr7, Lys36, Glu42, His44, Asp166, Lys167, His172. Однако, в исследованном диапазоне рН от 6,5 до 8,5 могут изменять заряд только боковые группы аминокислотных остатков гистидина (Рис. 32) (His3, Нis44 и Нis172).
При сравнении изменения заряда гистидина и констант скорости ассоциации и диссоциации видно, что они изменяются синхронно. При рН 8,0 и 8,5 заряд гистидина практически не изменяется, так же как не меняются значения констант скоростей ассоциации и диссоциации комплекса белка L1 с мРНК (Рис. 33). На основании полученных результатов можно заключить, что основной причиной изменения скорости образования и стабильности комплекса в данном диапазоне значений рН является изменение зарядов аминокислотных остатков His3, Нis44 и Нis172.
