Введение к работе
Актуальность проблемы. Программированная клеточная смерть (ПКС) является чрезвычайно важным процессом для нормального развития и жизнедеятельности многоклеточных организмов. Этот процесс позволяет организму избавляться от поврежденных или избыточных клеток. Одной из наиболее изученных форм ПКС у животных является апоптоз. Известно, что основными исполнителями апоптоза являются каспазы - белки семейства цистеиновых протеаз. Каспазы активируются в процессе ПКС и осуществляют гидролиз ограниченного числа белков-мишеней после остатка аспарагиновой кислоты в специфическом сайте узнавания.
ПКС протекает и в тканях растительных организмов. Морфологические проявления программированной клеточной смерти в тканях животных и растений имеют некоторые общие черты, что может указывать на биохимическое сходство процессов, протекающих в апоптотических клетках животных и растений, и, в частности, на возможное участие каспазоподобных протеаз в программированной смерти растительных клеток. Однако компьютерный поиск генов каспаз, структурно схожих с каспазами животных, в геномах растений не дал результатов. Известно, тем не менее, что в погибающих при ПКС клетках растений регистрируется специфическая каспазоподобная аспартазная активность. Свидетельства участия каспазоподобных ферментов в ПКС у растений в основном основываются на ингибирующих эффектах, наблюдаемых в присутствии специфических белковых и синтетических ингибиторов каспаз животных. Вероятно, некоторые протеазы растений, участвующие в ПКС, структурно не являются каспазами, но функционально обладают сходной субстратной специфичностью.
В нашей лаборатории из листьев табака N. tabacum был выделен фермент, обладающий рядом свойств, характерных для каспаз животных: он гидролизовал агробактериальный белок VirD2 после остатка аспарагиновой кислоты, расположенного в специфическом сайте узнавания TATD; мутация аспартата предотвращала гидролиз. Протеолитическая активность каспазоподобного фермента подавлялась ингибитором, созданным на основе сайта узнавания; ингибирование фермента приводило к подавлению ПКС. Найденный фермент получил название «фитаспазы» (phytaspase, phyto - растительный (лат.), asp - специфичный в отношении остатка аспарагиновой кислоты, ase - фермент). Была получена кДНК, предположительно кодирующая фитаспазу табака. Исследование структуры и свойств белка, кодируемого этой кДНК, могло дать принципиально новую информацию об апоптотической протеазе растений, необходимую для понимания механизмов программированной смерти растительных клеток.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось проведение структурно-функциональной характеристики фитаспазы табака. Задачи:
Доказать, что белок, кодируемый найденной кДНК, соответствует фитаспазе табака, то есть, продуцировать рекомбинантный фермент и показать, что он обладает протеолитической активностью фитаспазы.
Определить, к какому классу протеолитических ферментов относится фитаспаза.
Идентифицировать функционально значимые домены в структуре фитаспазы.
Выяснить особенности процессинга фитаспазы.
Исследовать локализацию фитаспазы в нормальных и погибающих при ИКС клетках растений.
Решение поставленных задач должно было позволить охарактеризовать апоптотическую протеазу растений и провести ее сравнение с апоптотическими протеазами животных (каспазами).
Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенной работы путем продукции рекомбинантного белка и изучения его субстратной специфичности доказано, что имеющаяся в нашем распоряжении кДНК кодирует фитаспазу табака. Это позволило определить полную аминокислотную последовательность белка-предшественника фитаспазы и выявить важные особенности его структуры и функционирования.
Показано, что фитаспаза является субтилизин-подобной протеазой, то есть сериновой протеазой растений. Таким образом, апоптотические протеазы растений структурно разительно отличаются от апоптотических протеаз животных.
Предсказаны каталитические остатки фермента и показано, что мутация с заменой Ser537 на остаток аланина (но не замена другого близлежащего остатка) инактивирует фитаспазу.
Выявлены функционально важные участки в молекуле белка-предшественника фитаспазы - N-концевой сигнальный пептид, продомен и протеазный домен - и экспериментально установлены их границы.
Продемонстрировано, что отщепление продомена фитаспазы при образовании протеолитически активного фермента происходит автокаталитически и в соответствии с уникальной субстратной специфичностью фитаспазы.
Исследование мутантов фитаспазы показало, что отщепление продомена необходимо для образования протеолитически активного фермента и для секреции белка во внеклеточное пространство (апопласт).
Выявлено, что в здоровых тканях фитаспаза локализуется в апопласте.
Доказано, что за секрецию фитаспазы в апопласт отвечает N-концевой сигнальный пептид белка-предшественника фитаспазы. В отсутствие сигнального пептида в последовательности белка-предшественника фитаспаза накапливается внутри клетки растения. Во внеклеточной жидкости фитаспаза присутствует в протеолитически активном состоянии.
Установлено, что при индукции ПКС, вызванной абиотическими и биотическими факторами стресса, происходит возвращение фитаспазы из апопласта в цитозоль умирающей клетки. Релокализация фитаспазы в процессе ПКС продемонстрирована с использованием флуоресцентного белка-таймера.
Использование биоинформатического подхода позволило предложить модель пространственной структуры фитаспазы табака, объясняющую аспартатную специфичность фермента. Все перечисленные результаты получены впервые.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в международных научных журналах и глава в книге. Материалы работы были представлены на научных конференциях: IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной школе по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), Международной конференции «1st International Plant Protease Conference» (Hemavan, Швеция, 2011)
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 36 рисунками. Библиографический указатель включает 190 цитируемых работ.
