Введение к работе
Актуальность исследования. Ферментативное метилирование ДНК, осуществляемое сайт-специфическими ДНК-метилтрансферазами (в дальнейшем ДНК-метилазами или просто метилазами), является наиболее распространённой формой модификации ДНК и вовлечено в широкий спектр важнейших биохимических процессов в живых организмах. Значительная часть метилаз микроорганизмов функционирует в составе бактериальных систем рестрикции-модификации (РМ-систем), которые, как правило, включают эндонуклеазу рестрикции (рестриктазу) и метилазу с одинаковой субстратной специфичностью, т.е., узнающих одну и ту же короткую последовательность ДНК, называемую сайтом узнавания. Рестриктаза расщепляет ДНК по сайтам узнавания, а метилаза модифицирует сайты узнавания, перенося метильную группу на цитозин или аденин узнаваемой последовательности. При этом модифицированный сайт узнавания не расщепляется собственной эндонуклеазой рестрикции, тогда как чужеродная немодифицированная ДНК будет гидролизоваться рестриктазой, что обеспечивает бактериальной клетке защиту от проникновения посторонней ДНК.
Существует несколько типов РМ-систем, но абсолютное большинство известных на сегодня метилаз и рестриктаз входят в состав РМ-систем типа II, являющегося наиболее простым. Для этого типа РМ-систем характерен палиндромный сайт узнавания, имеющий симметрию вращения второго порядка. К типу II относятся хорошо известные РМ-системы EcoRl (сайт узнавания 5'-GAATTC-3'), AluI (5'-AGCT-3'), PstI (5'-CTGCAG-3'), TaqI (5'- TCGA-3'), XbaI (5'-TCTAGA-3') и многие другие.
В последнее время интерес исследователей привлекают бактериальные РМ-системы, имеющие несимметричный сайт узнавания. Как правило, рестриктазы таких РМ-систем расщепляют ДНК в стороне от сайта узнавания, в связи с чем они были названы рестриктазами типа IIS (от слова «shift» - сдвиг). Рестриктазы и метилазы РМ-систем типа IIS были открыты существенно позднее и значительно менее изучены, касается ли это их структуры и механизма действия или организации оперонов таких систем.
Цель настоящей работы заключалась в изучении структуры оперонов бактериальных систем рестрикции-модификации типа IIS и отдельных генов метилаз, входящих в эти РМ-системы, сравнительном анализе аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз РМ-систем IIS типа, изучении свойств и субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз бактериальных РМ-систем типа IIS.
В задачи исследования входило:
1. Определение нуклеотидной последовательности и организации оперонов трех систем рестрикции-модификации IIS типа: BstF5I (сайт узнавания 5'-GGATG-3'), FauI (5'-CCCGC-3'), SfaNI (5'-GCATC-3').
-
Сравнительное изучение первичной структуры ДНК-метилаз РМ- систем типа IIS BstF5I, Faul, SfaNl и определение типа каждого фермента и метилируемого им основания.
-
Клонирование генов ДНК-метилтрансфераз М1.BstF5I, М2.BstF5I, М3.BstF5I, М4.BstF5I в составе экспрессирующего вектора и получение гомогенных препаратов данных ДНК-метилтрансфераз.
-
Установление субстратной специфичности клонированных ДНК- метилтрансфераз М^^, М2.BstF5I, М3.BstF5I, М4.BstF5I.
-
Определение оптимальных условий метилирования ДНК клонированными ферментами и установление кинетических параметров реакции метилирования олигонуклеотидных дуплексов и ДНК фага лямбда.
-
Сравнительный анализ кинетических параметров реакции метилирования природных субстратов ДНК-метилтрансферазами типа IIS и метилазами, модифицирующими палиндромные сайты узнавания.
Научная новизна
Впервые описана система рестрикции-модификации, содержащая четыре гена ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт. Проведено определение полной нуклеотидной последовательности оперона РМ-системы BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5, содержащего четыре однонаправленных и расположенных друг за другом генов ДНК- метилтрансфераз М^^, Ш^^, М3.BstF5I и М4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, направленный им навстречу.
Впервые описана система рестрикции-модификации, в которой ген рестриктазы расположен между генами метилаз. Установлена нуклеотидная последовательность РМ-системы FauI из Flavobacterium aquatile. Оперон РМ- системы FauI состоит из однонаправленных гена контрольного белка, гена первой ДНК-метилтрансферазы Ml .FauI, гена эндонуклеазы рестрикции и гена второй ДНК-метилазы M2.FauI
Впервые описана система рестрикции-модификаци SfaNI из Streptococcus faecalis ND547 и проведено клонирование всего оперона РМ-системы SfaNI, содержащего однонаправленные и расположенные последовательно ген метилазы и ген рестриктазы SfaNI.
Проведен сравнительный анализ аминокислотной последовательности клонированных ДНК-метилтрансфераз РМ-систем IIS типа между собой и с другими метилазами с известной структурой. Определен тип каждой метилазы РМ-систем BstF5I, FauI и SfaNI и изучена их субстратная специфичность.
Определены оптимальные условия реакции метилирования ДНК клонированными ферментами М1.BstF5I, М2.BstF5I, М3.BstF5I и М4.BstF5I.
Установлены кинетические параметры реакции метилирования природных ДНК и олигонуклеотидных дуплексов ферментами М1.BstF5I, М2.BstF5I, М3.BstF5I и М4.BstF5I.
Показано, что коэффициент специфичности (kcat/Km i^hk) большинства ДНК-метилтрансфераз, узнающих палиндромные сайты узнавания, более чем в 100 раз превышает значение этого параметра у ферментов IIS типа.
Теоретическая и практическая значимость. В результате работы исследованы новые системы рестрикции-модификации IIS типа из штаммов Bacillus stearothermophilus F5, Flavobacterium aquatile и Streptococcus faecalis ND547.
Проведенное детальное изучение свойств ДНК-метилтрансфераз, входящих в состав РМ-систем IIS типа со множеством метилаз, вносит новый вклад во всестороннее исследование процессов метилирования ДНК и роли ДНК-метилтрансфераз в бактериальной клетке, способствует более глубокому пониманию феномена рестрикции-модификации в частности и эволюционных аспектов развития микроорганизмов в целом.
Получение штаммов-продуцентов четырех ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I, двух ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации FauI, ДНК-метилтрансферазы M. SfaNI расширяет генно-инженерный и аналитический инструментарий при изучении геномных ДНК и исследовании их взаимодействия с белками и ферментами нуклеинового обмена. В частности, ДНК-метилтрансфераза M3.BstF5I входит в список продуктов, реализуемых компанией «СибЭнзим» [], и была использована при исследовании процессивности взаимодействия ферментов с ДНК [Zinoviev V.V., 2003, 2007].
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Оперон РМ-системы BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5 содержит четыре однонаправленных и расположенных друг за другом гена ДНК- метилтрансфераз М1^1Р5!, М2.BstF5I, М3.BstF5I и М4.BstF5I и ген эндонуклеазы рестрикции R.BstF5I, ориентированный навстречу. РМ-система с четырьмя генами ДНК-метилтрансфераз, узнающих один и тот же сайт, описана впервые.
-
Оперон РМ-системы FauI из Flavobacterium aquatile состоит из однонаправленных генов контрольного белка, первой ДНК- метилтрансферазы M1.FauI, эндонуклеазы рестрикции и второй ДНК- метилазы M2.FauI. Такое необычное строение оперона с наличием гена контрольного белка перед геном метилазы и расположением гена рестриктазы между генами метилаз обнаружено впервые.
-
Система рестрикции-модификации SfaNI из Streptococcus faecalis ND547 состоит из однонаправленных генов ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции.
-
ДНК-метилтрансферазы М^^, М2.BstF5I, М3.BstF5I и М4.BstF5I являются ^-аденин-ДНК-метилтрансферазами, при этом М2.BstF5I и М3.BstF5I относятся к альфа типу, М1.BstF5I принадлежит бета типу, а М4.BstF5I имеет первичную структуру дельта типа.
-
Субстратная специфичность клонированных M1.BstF5I, M2.BstF5I, M3.BstF5I, М4.BstF5I имеет следующие отличия:
-
М1.BstF5I и М3.BstF5I узнают и модифицируют верхнюю цепь сайта 5'-GGATG-3', тогда как М2.BstF5I и М4.BstF5I метилируют нижнюю цепь этого сайта;
-
М1.BstF5I, М2.BstF5I, М4.BstF5I метилируют только установленный сайт узнавания, тогда как М3.BstF5I модифицирует также сайт 5'-GGATC-3' с kcat в 20 раз меньше.
-
Ферменты М1.BstF5I и М4.BstF5I предпочтительно модифицируют полуметилированный дуплекс и, вероятно, участвуют в пострепликативном метилировании вновь образованной ДНК.
-
Коэффициент специфичности (kcat/Km ^k) большинства ДНК- метилтрансфераз, узнающих палиндромные сайты, более чем в 100 раз превышает значение этого параметра у ферментов IIS типа.
Апробация материалов диссертации. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 1996; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 1997; 4 New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Innsbruck, 1997; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 1999; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 2000; FASEB Summer Research Conferences, Vermont, USA, 2001; 3-й съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002; 4-й съезд биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.
Реализация результатов исследования. Материалы диссертации изложены в 15 статьях, все статьи опубликованы в научных журналах, входящих в список ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из шести разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 189 страницах машинописного текста и включает 41 рисунок, 22 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 270 ссылок.
Вклад автора в диссертационную работу. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все основные эксперименты, проведенные в работе, выполнены лично автором, а также руководимыми им сотрудниками и аспирантами. Существенный вклад в исследование был сделан Л.Н.Голиковой, у которой автор являлся руководителем диссертационной работы. На разных этапах в работе принимали участие Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Гончар Д.А., Кузнецов В.В., Евдокимов А.А.
Автор благодарит всех участников за плодотворное сотрудничество. Автор выражает особую признательность профессору С.Х. Дегтяреву и профессору Э.Г. Малыгину, чьи приоритетные исследования были положены в основу настоящей работы.
Работа выполнялась в ФГУН ГНЦВБ Вектор Роспотребнадзора в рамках научных тем организации 1996-2002 гг., по грантам РФФИ 98-0449514, РФФИ 00-04-49153 и МНТЦ 3312, в которых автор являлся руководителем; в рамках гранта РФФИ 02-04-48909 и US Public Health Service grant from the Fogarty International Center (No. TW00529), в которых автор являлся исполнителем.
