Введение к работе
Актуальность работы
Вирусные гепатиты представляют собой серьезную проблему для здравоохранения ввиду их повсеместного распространения. Наибольшего внимания требуют гепатиты В и С [Соринсон С.Н., 1998, . et al, 2005, WHO Fact Sheet, 2000]. По последним данным в России на смену резкому подъему заболеваемости острыми формами вирусных гепатитов, наблюдавшемуся в 1995-1999 гг., [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И. с соавт., 1999] пришла эпидемия хронических вирусных гепатитов [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Для выявления этиологических агентов вирусных гепатитов все большее значение приобретает лабораторная диагностика, она позволяет выявлять возбудителя на ранних стадиях инфицирования и оценивать эффективность проводимой противовирусной терапии. Одним из перспективных методов в этом отношении является метод на основе амплификации нуклеиновых кислот, в частности, полимеразная цепная реакция [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003, Михайлов М.И., 2001, Момыналиев K.T., Говорун В.М., 2000].
Активная разработка наборов реагентов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) как для качественного, так и количественного определения ДНК и РНК возбудителей инфекционных заболеваний и организация их производства требует стандартизации проведения их испытаний и оценки качества. При оценке качества наборов для выявления культивируемых микроорганизмов используют чистые культуры. С этой точки зрения стандартизация наборов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С затруднена.
В настоящее время в Российской Федерации проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание [ГОСТ Р ИСО 17511-2007, ГОСТ Р ИСО15193-2007, ГОСТ Р ИСО 15194-2007]. Порядок проведения испытаний наборов реагентов изложен в ГОСТ Р 51352-99. Однако раздел, относящийся к наборам реагентов для «микроанализа нуклеотидных последовательностей», предусматривает оценку качества наборов только по положительному и отрицательному контрольным образцам [ГОСТ Р 51352-99 п.4.2.2], что недостаточно для объективной оценки наборов.
Таким образом, разработка системы проведения испытаний наборов реагентов на основе ПЦР с целью обеспечения единства требований к ним на модели вирусов гепатитов В и С является актуальной задачей.
Цель исследования
Разработка системы испытаний наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С методом ПЦР.
Задачи исследования
1. Разработать на основе принципов валидации аналитических методик систему лабораторных испытаний наборов реагентов для выявления и количественного определения ДНК/РНК вирусов гепатита В/С методом ПЦР, а именно:
для неколичественного выявления нуклеиновых кислот оценку:
- специфичности;
- предела обнаружения (аналитической чувствительности);
для количественного определения нуклеиновых кислот оценку
- специфичности;
- линейного диапазона определяемых величин;
- прецизионности;
- правильности.
2. Разработать отраслевой стандартный образец содержания РНК HCV для определения аналитической чувствительности, специфичности, воспроизводимости соответствующих наборов реагентов методом ПЦР.
3. Провести оценку диагностической эффективности изученных наборов реагентов на клинических образцах.
Научная новизна
Впервые разработана система лабораторных испытаний ПЦР наборов реагентов, позволяющая по единому плану оценивать ПЦР наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности, правильности и воспроизводимости.
Впервые с целью стандартизации наборов реагентов на основе ПЦР введен принцип оценки аналитической чувствительности по минимальной концентрации, выявляемой со 100 % воспроизводимостью при десятикратной постановке анализа.
Впервые разработан отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК HСV ОСО 42-28-366-06П), с помощью которого стандартизован контроль наборов реагентов для выявления РНК HCV.
Практическая значимость
Методика определения аналитической чувствительности внесена в стандарты качества ФСП (с 2007 г - в ТУ) на наборы реагентов:
для выявления ДНК вируса гепатита В:
- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс HBV-240/ВКО-770» (ТУ 9398-040-01897593-2009 ФСР 2007/00813 от 14.08. 2009);
«Биоком-HBVСКРИН-nsПЦР-тест» (ФСП 42-0114-0276-00); «ДиаГен-НBV» (ФСП 42-0040-0053-00) и «Авиценна-HBV-ПЦР» (ФСП 42-0116-0279-00);
- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенс HBV-FRT»( ТУ 9398-030-01897593-2007.ФСР 2007/00585 от 09.08. 2007) и «АмплиСенс HBV-FEP»( ТУ 9398-032-01897593-2007.ФСР 2007/00586 от 09.08. 2007);
для выявления РНК вируса гепатита С:
- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс HCV-240-/ВКО-440» (ФСП 42-0155-1135-01);
- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенсHСV-FRT» (№ ФС 01032006/5667-06 от 26 декабря 2006 г) и «АмплиСенс HСV-FEP»(№ ФС 01032006/5670-06 от 27 декабря 2006 г);
для количественного определения РНК вируса гепатита С:
- с гибридизационно-ферментной детекцией: «АмплиСенс HCV-Монитор»
(ФСП 42-0115-6363-05; № ЛС-000918 от 18.11.2005 г.) ;
- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией:
«АмплиСенс HCV-Монитор- FRT (№ ФСР 2007/00577 от 9 октября 2007 г).
Наборы реагентов зарегистрированы в РФ и разрешены к применению в диагностической практике.
Материалы диссертации были использованы при подготовке Методических указаний 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М. 2004
Разработанный и аттестованный Отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК HCV) 42-42-366-06П внесен в реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.
Совокупность новых научных результатов и положений,
выносимых на защиту
1. На основе принципов валидации аналитических методов разработана система лабораторных испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С в отношении специфичности, аналитической чуствительности, линейного диапазона, прецизионности и правильности.
2. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С позволяет оценивать качество наборов реагентов для выявления РНК HCV в отношении аналитической чувствительности, воспроизводимости, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности и правильности
Апробация работы
Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого совета ФГБУ
«ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России «31» марта 2011г. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийскиx научно-практическиx конференцияx «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2004; 2006; 2007, 2008, 2009 и 2010 гг.; Всероссийскиx конференцияx по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2006, 2008, 2010 гг.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 статей в научных журналах, из них 3 в реферативных изданиях, 6 публикаций в материалах конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 49 таблиц, 9 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 30 отечественных и 130 зарубежных источников.
