Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 10
2.1. Молекулярная биология ВГВ 10
2.1.1. Структура и организация генома 10
2.1.2. Вирусные белки 14
2.1.3. Структура капсида 18
2.1.4. Жизненный цикл ВГВ 21
2.1.5. Репликация ВГВ 25
2.2. Молекулярные варианты ВГВ 27
2.2.1. Генотипы ВГВ 27
2.2.2. Сочетанное инфицирование различными генотипами ВГВ 31
2.2.3. Рекомбинация 32
2.2.4. Методы генотипирования ВГВ 33
3. Материалы и методы 35
4. Результаты собственных исследований 43
4.1. Филогенетический анализ полноразмерных нуклеотидных последовательностей ВГВ 43
4.2. Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В Санкт-Петербурге и Якутии 52
4.2.1 Разработка стратегии генотипирования ВГВ методом PCR- RFLP потрем участкам генома 52
4.2.2. Генотипирование вариантов ВГВ, циркулирующих в Санкт-Петербурге, методом PCR-RFLP по трем участкам генома 57
4.2.3. Генотипирование вариантов ВГВ, циркулирующих в Санкт-Петербурге, методом амплификации с типоспецифичными праймерами 61
4.2.4. Определение генотипа ВГВ у больных острым гепатитом В 63
4.2.5. Генотипирование вариантов ВГВ, циркулирующих в Якутии 63
4.3. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВГВ. Компьютерный анализ, полученных последовательностей 65
4.3.1. Секвенирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ВГВ 65
4.3.2. Анализ аминокислотных замен 70
4.4. Секвенирование и анализ рекомбинантного генома ВГВ из Санкт- Петербур га 79
4.4.1. Доказательства рекомбинантной природы изолята ВГВ. Картирование участков рекомбинации 79
4.2.2. Анализ аминокислотных замен 88
5. Обсуждение результатов 93
5.1. Генотипирование вариантов ВГВ у больных ХГВ в Санкт-Петербурге и Якутии 93
5.2. Гомологичная рекомбинация у ВГВ 97
Выводы 105
- Молекулярные варианты ВГВ
- Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В Санкт-Петербурге и Якутии
- Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВГВ. Компьютерный анализ, полученных последовательностей
- Гомологичная рекомбинация у ВГВ
Введение к работе
Вирусный гепатит В является важнейшей медико-социальной проблемой для здравоохранения как Российской Федерации, так и всего мира. Это связано с широким распространением инфекции, а также ее частыми неблагоприятными исходами, выражающимися в развитии хронического гепатита, цирроза печени и гепатокарциномы. По данным ВОЗ, ежегодно около 50 млн. человек в мире заболевают гепатитом В, а умирают до 2 млн. человек. В нашей стране в последние годы отмечен резкий рост заболеваемости: число больных ВГВ за последние 5 лет увеличилось более чем в 2 раза. Если в 1992 г. показатель заболеваемости составлял 18,1 на 100 тыс. населения и был близок к показателям в других развитых странах, то в последующем происходил систематический рост заболеваемости и в 1999-2000 гг. она достигла пика (43,8-42,5). В Санкт-Петербурге, Пермской, Омской, Саратовской областях, Приморском крае, республиках Алтай, Калмыкия, Тува, Саха (Якутия), Ханты-Мансийском автономном округе показатели заболеваемости в 1,9-3 раза превышали средний показатель по стране. Почти в половине регионов 60-85% общего числа больных приходится на долю лиц в возрасте 15-19 и 20-29 лет, а показатели заболеваемости в этих группах населения достигают 300-500 на 100 тыс. В связи с возможностью передачи вируса от матери новорожденному и интенсивным вовлечением в эпидемический процесс лиц основного репродуктивного возраста (20-29 лет) участились случаи заболевания детей до 1-го года жизни [Онищенко Г., 2001, 2002]. Все это свидетельствует о том, что заболеваемость ВГВ представляет собой реальную угрозу здоровью нации.
В последнее десятилетие возрос интерес к влиянию генетической вариабельности ВГВ на течение и исход болезни. Генетическая вариабельность проявляется как в возникновении мутаций в вирусном геноме "de novo" у каждого инфицированного субъекта, так и в существовании различных генотипов ВГВ, свойственных определенным популяциям носителей. Современная классификация включает восемь генетических групп ВГВ, обозначенных как генотипы А-Н. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что генотипы ВГВ могут влиять на скорость НВе-сероконверсии, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития гепатокарциномы [Mayerat С. et al., 1999; Ding X. et al., 2001; Lindh M. et al., 2000; Orito E. et al., 2001a; Tsubota A. et al., 2001; Thakur V. et al., 2002]. Генотипы ВГВ характеризуются различным географическим распределением, которое коррелирует со значительной вариабельностью в частоте ВГВ-носительства в различных областях мира. Вероятно, гетерогенность в проявлениях болезни и в ответе на антивирусную терапию среди пациентов с хроническим гепатитом в различных регионах может быть связана, по крайней мере частично, с различными генотипами [Norder Н. et al., 1993а; Chu C.-J. and Lok A., 2002].
Генотипирование ВГВ только начинает приобретать популярность среди исследователей гепатита В. В настоящий момент наиболее употребляемым методом для определения генотипов является анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции участков генома, амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции (PCR-RFLP) [Lindh М. et al., 1997; Lindh М. et al., 1998]. Также доступны метод, использующий технику обратной гибридизации на нитроцеллюлозной мембране - INNO-LiPA (Innogenetics) [Stuyver L. et al., 1996], и система с иммобилизованными моноклональными антителами к генотип-специфичным эпитопам [Usuda S. et al., 1999]. В случае необходимости эти методы могли бы быть легко внедрены в лаборатории клинической диагностики. Однако, прежде необходимо ответить на ключевой вопрос: каким образом знание генотипа ВГВ может помочь в лечении пациента?
Для этого необходимы дальнейшие исследования связи между генотипами ВГВ и вирусной нагрузкой, активностью инфекционного процесса, ответом на антивирусную терапию; необходимо определить превалирующие генотипы в каждом регионе и выявить их филогенетические связи с изолятами из других регионов.
Однако, в России исследования в этом направлении не проводились. Более того, даже сведения о генотипах циркулирующих на территории Российской Федерации до сих пор являются весьма отрывочными: лишь одна публикация посвящена анализу нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВГВ [Fiodgren Е. et al., 2000].
Цели исследования
Охарактеризовать варианты ВГВ, циркулирующие в Санкт-Петербурге и Якутии; определить особенности генотипического состава ВГВ в этих двух популяциях; оценить филогенетические взаимоотношения российских вариантов ВГВ с изолятами из других регионов мира.
Задачи исследования
1. Провести филогенетический анализ полноразмерных нуклеотидных последовательностей ВГВ, депонированных в GenBank/EMBL.
2. Разработать метод генотипирования вариантов ВГВ на основе анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции участков генома, амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции (PCR-RFLP).
3. Определить генотипический состав популяций ВГВ, циркулирующих в Санкт-Петербурге и Якутии.
4. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов генов S и С у изолятов ВГВ, относящихся к различным генотипам.
5. Охарактеризовать филогенетические взаимоотношения между изолятами ВГВ из Санкт-Петербурга и Якутии и изолятами из различных географических регионов, представленными в Международном генетическом банке GenBank/EMBL.
6. Установить возможность генетической рекомбинации между вариантами ВГВ, принадлежащими к разным генотипам.
Научная новизна
Впервые на основе сочетания методов амплификации с типоспецифичными праймерами и PCR-RFLP изучена генетическая структура популяций ВГВ, циркулирующих на территории Санкт-Петербурга и Якутии. Определена первичная нуклеотидная последовательность фрагментов генов S и С для изолятов, принадлежащих к разным генотипам. С помощью филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей определены генетические взаимоотношения между изолятами, распространенными в Санкт-Петербурге и Якутии и в других регионах мира.
Показано, что в Санкт-Петербурге и Якутии циркулируют три генотипа ВГВ - А, С и D. При этом популяция в Санкт-Петербурге представлена преимущественно D генотипом, тогда как в Якутии генотипы А, С и D циркулируют почти в равной пропорции, с небольшим доминированием генотипа D.
Выявлена возможность смешанной инфекции, обусловленной разными генотипами ВГВ.
В результате филогенетического анализа полноразмерных последовательностей генома ВГВ, представленных в GenBank/EMBL, получены данные, указывающие на высокую частоту рекомбинационных событий в эволюционной истории ВГВ. Для обнаруженных мозаичных геномов картированы предполагаемые точки рекомбинации.
В Санкт-Петербурге выявлен и секвенирован вариант ВГВ, образовавшийся в результате рекомбинации между двумя разными генотипами.
Практическое значение
Разработан метод определения генотипов ВГВ, основанный на сочетании амплификации с типоспецифичными праймерами и PCR-RFLP. В ходе исследования было изучено распространение генотипов ВГВ в Санкт-Петербурге и Якутии. Эти данные могут быть использованы при решении эпидемиологических задач.
Показано, что генотипирование с помощью RFLP-PCR по трем областям генома ВГВ может быть использовано для идентификации рекомбинантных штаммов.
Обнаружен дополнительный источник вариабельности ВГВ - межгеномная рекомбинация, который необходимо учитывать при филогенетических реконструкциях эволюционной истории ВГВ, проведении эпидемиологических исследований, а также при разработке новых вакцин.
Положения, выносимые на защиту 1. В настоящее время в Санкт-Петербурге циркулируют ВГВ трех генотипов: А, С и D. Среди больных ХГВ в Санкт-Петербурге ВГВ представлен преимущественно генотипом D; генотип А встречается значительно реже; генотип С был обнаружен только у выходцев из Юго-Восточной Азии.
2. В Якутии в популяции больных хроническим гепатитом В генотипы ВГВ D, А и С встречаются приблизительно с равной частотой, лишь с небольшим доминированием генотипа D; при этом с высокой частотой выявляется смешанная инфекция, обусловленная двумя генотипами ВГВ.
3. Рекомбинация между геномами ВГВ, принадлежащими к разным генотипам, является дополнительным источником вариабельности вируса.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции "Грипп - XXI век" (С.-Петербург, 1997), 2-ой Международной конференции, посвященной 75-летию С.-Петербургского института им. Пастера, "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (С.-Петербург, 1998), Всероссийской научной конференции "Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций" (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции "Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций" (Санкт-Петербург, 2002).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 17 таблиц и 31 рисунков, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и обсуждение в 5 главах и выводы. Список литературы включает 232 работы отечественных и зарубежных авторов.
Молекулярные варианты ВГВ
Генетическая изменчивость ВГВ определяется двумя существенными свойствами этого вируса: 1. Репликация ВГВ протекает через стадию РНК-интермедиата с использованием механизма обратной транскрипции 2. Геном ВГВ является очень компактным, не содержит некодирующих областей и на две трети состоит из альтернативно перекрывающихся рамок считывания. Этими свойствами обусловлены две противоположные тенденции в эволюции вируса гепатита В: использование обратной транскриптазы, у которой отсутствует З1— 5 -корректирующая функция, ведет к относительно высокой частоте мутаций, тогда как крайняя степень компактности в организации генома накладывает значительные ограничения на вариабельность ВГВ. 2.2.1. Генотипы ВГВ Филогенетический анализ полных нуклеотидных последовательностей, полученных из различных частей мира, позволил разделить ВГВ на восемь генетических групп, обозначенных как А-Н генотипы, с межгрупповой дивергенцией 8% или больше [Okamoto et al., 1988; Norder H. et al., 1992b; Norder H. et al., 1994; Stuyver L. et al., 2000, Arauz-Ruiz P. et al., 2002]. Большинство генотипов являются серотипически гетерогенными: генотип С содержит серотипы adr, ауг, adw2 и ayw3; как А так и В генотипы содержат серотипы adw2 и aywl; генотип D содержит серотипы ayw2, ayw3 и ayw4; генотип F включает adw4 и ayw4. Генотипы Е и G представлены серотипами ayw4 и adw2, соответственно. Распределение генотипов варьирует в зависимости от географических регионов мира, что, по-видимому, отражает их различное географическое происхождение, а также пути распространения в связи с человеческой миграцией. Генотип А широко распространен по всему миру, однако наиболее часто встречается в северо-восточной Европе, Северной Америке и Африке; генотип В найден в Индонезии, Вьетнаме и Китае; генотип С превалирует в Восточной Азии, Корее, Китае, Японии, Вьетнаме, Полинезии и Австралии; генотип D является пандемичным, но доминирует в Средиземноморской области, Средней Азии и Индии; генотип Е характерен для Африки; генотип F распространен среди аборигенов Америки и в Полинезии; недавно было обнаружено два новых генотипа: G - в США и Франции, Н - в Центральной Америке [Norder Н. et al., 1993b; Bowyer S. et al., 1997; Arauz-Ruiz P. et al., 1997; Stuyver L. et al., 2000; Sugauchi F. et al., 2001, Arauz-Ruiz P. et al., 2002]. В ряде работ была отмечена значительная корреляция между вариабельностью в частоте ВГВ-носительства, частотой хронизации ВГВ, путями передачи вируса и распределением генотипов в различных областях мира [Norder Н. et al., 1993а]. Так в Юго-Восточной Азии, где доминируют генотипы В и С, велико значение вертикального пути передачи: 30-50% хронических ВГВ у детей развивается в результате перинатального инфицирования.
В противоположность этому, в Средиземноморье, Африке и Среднем Востоке, где доминирующими являются генотипы А и D, ранний горизонтальный перенос является более важным фактором: только 10-20% хронического ВГВ у детей развивается в результате перинатального инфицирования [Mahoney F.J., 1999]. По-видимому, эти различия связаны с тем, что Юго-Восточной Азии HBs-позитивные женщины в репродукционном возрасте чаще оказываются НВе-позитивными из-за более поздней анти-НВе сероконверсии по сравнению с другими регионами. Поскольку вертикальный путь передачи инфекции связан с высокой частотой хронизации (70-90%), он служит важным механизмом для поддержания высокого уровня инфицированности в тех регионах, где ВГВ является эндемичным [Shiraki К., 2000]. Еще в двух ранних исследованиях, проведенных среди более чем 3000 носителей HBsAg в Японии, были выявлены субтип-зависимые клинические различия течения гепатита В: носители с субтипом adr (генотип С) имели более выраженные поражения печени и были чаще HBeAg-позитивными по сравнению с субтипом adw (в Японии обычно представлен генотипом В) [Shiina S. et al., 1991; Noguchi A. et al., 1994]. Эти данные были в дальнейшем подтверждены несколькими группами исследователей, изучавшими клинические различия между генотипами среди хронических носителей ВГВ в Юго-Восточной Азии. Оказалось, что генотип В связан с более быстрым протеканием иммуноактивной стадии и более быстрой НВе-сероконверсией по сравнению с генотипом С, тогда как последний характеризуется более выраженным поражением печени, низкой частотой прекор G— А мутантов в 1896 нуклеотиде и более высокой частотой 1762-1764 TGA мутантов [Lindh М. et al., 1999; Orito Е. et al., 2001a; Ding X., 2001; Kobayashi M, 2002; Chan H. et al., 2002]. В работе Kao с соавторами было изучено распределение генотипов в Тайване среди пациентов с хроническим гепатитом В и гепатокарциномой в сравнении с асимтоматическими носителями [Kao J. et al., 2000а]. Эти авторы обнаружили, что генотип С преобладал у пациентов с циррозом печени и у пациентов с гепатокарциномой, возраст которых превышал 50 лет. Тогда как генотип В значительно чаще встречался у пациентов с гепатокарциномой моложе 50 лет. Эти различия были еще существеннее для пациентов с гепатокарциномой в возрасте моложе 35 лет, среди которых генотип С вообще не был найден. Авторы приходят к выводу, что генотип С связан с более тяжелым течением болезни и, вероятно, ведет к развитию гепатокарциномы через стадию цирроза в более старшем возрасте, в то время как генотип В связан с развитием гепатокарциномы в раннем возрасте. Результаты исследования Као с соавторами находятся в частичном противоречии с результатами, полученными в континентальном Китае и в Японии. Так в исследовании Орито с соавторами, проведенном среди японцев было показано, что пациенты с гепатокарциномой, инфицированные ВГВ генотипа В были старше, чем инфицированные генотипом С [Orito Е. et al., 2001а, 2001b]. Еще в одной работе, выполненной в Японии [Fujie Н. et al., 2001] было показано, что среди пациентов с гепатокарциномой преимущественно встречается генотип С ВГВ, при этом все пациенты моложе 50 лет были инфицированы генотипом С, тогда как все пациенты с генотипом В были старше 60 лет. Кроме того, гепатокарцинома, ассоциированная с генотипом С, быстро прогрессирует и ведет к смерти в результате печеночной недостаточности, несмотря на терапию [Tsubota А. et al., 2001]. Было высказано предположение, что несоответствие данных, полученных в Японии и Тайване, связано с циркуляцией в этих районах разных субтипов генотипа В [Kao J. and Chen D., 2001]. Действительно, при филогенетическом анализе полных нуклеотидных последовательностей изолятов ВГВ генотипа В, полученных из различных областей Азии, истинный генотип В был обнаружен только среди японских изолятов; в остальных регионах, включая Китай, Гонконг, Индонезию, Тайвань, Таиланд и Вьетнам, штаммы ВГВ генотипа В содержали рекомбинантную с генотипом С ргеС/С область [Sugauchi F. et al., 2002].
В Западной Европе генотип А чаще встречается среди пациентов с хроническим гепатитом, чем генотип D, тогда как среди пациентов с острым гепатитом наблюдается противоположная ситуация [Mayerat С. et al., 1999]. Однако в Индии генотип D был связан с более тяжелым течением болезни, чем генотип А и преобладал у пациентов с гепатокарциномой моложе 40 лет [Thakur V. et al., 2002]. В исследовании, посвященном влиянию трех генотипов (А, С и D) на рецидив инфекции ВГВ после пересадки печени в связи с острой печеночной недостаточностью было обнаружено, что пациенты с генотипом А имели наименьший риск рецидива ВГВ, несмотря на более высокую претрансплатационную вирусную нагрузку, в то время как пациенты с генотипом D имели наибольший риск рецидива инфекции и высокую смертность [Devarbhavi Н. et al., 20002]. Линд с соавторами сравнивали вирусную нагрузку, мутации в прекор области и гистологическую активность у пациентов с хроническим ВГВ в зависимости от различных генотипов [Lindh М. et al., 2000]. Анализ НВе статуса у пациентов с хроническим ВГВ показал, что пропорция НВе-положительных носителей была значительно выше для генотипа С по сравнению с генотипами А, В и D. Генотип С также был связан с более высоким уровнем вирусной ДНК в крови (что отражает большую пропорцию НВе-положительных носителей) и, соответственно, с более сильным поражением печени, чем генотипы А, В и D. Однако, среди НВе-положительных носителей, пациенты, инфицированные генотипом D, имели уровень ДНК выше, чем те, кто были инфицированы генотипом А, В или С, что, возможно, связано с более высокой скоростью репликации и инфекционности у генотипа D. Ретроспективный анализ, проведенный Као с соавторами, показал, что пациенты с хроническим гепатитом В генотипа С хуже поддаются терапии интерфероном, чем пациенты с генотипом В [Као J. et al., 2000b]. Доля ответивших на интерфероновую терапию была выше для пациентов, инфицированных генотипом А по сравнению с пациентами, инфицированными генотипом D [Zhang X. et al., 1996].
Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В Санкт-Петербурге и Якутии
В последнее десятилетие ведутся интенсивные исследования генотипов и вариантов ВГВ циркулирующих в различных регионах мира. К настоящему времени накоплено значительное количество данных, указывающих на то, что вирусная гетерогенность является важным фактором, влияющим на течение заболевания и антивирусную терапию. Поэтому не вызывает сомнений актуальность развития простых в исполнении и недорогих методов генотипирования ВГВ. Хотя в последние годы анализу геномных последовательностей значительно способствовало появление и развитие автоматических секвенаторов, тем не менее, секвенирование до сих пор остается дорогостоящим, трудоемким и недоступным для многих исследовательских лабораторий. По этой причине неоднократно предпринимались попытки использовать различные методы, основанные на ПЦР, такие как использование типоспецифичных праймеров (Norder Н. et al., 1990; Repp R. et al., 1993) и RFLP (Shih J. et al., 1991; Lindh M. et al., 1997; Lindh M. et al., 1998), для генотипирования ВГВ. Однако, только в последних двух упомянутых работах были идентифицированы все известные генотипы, и корректность результатов была продемонстрирована на большом количестве образцов. 4.2.1. Разработка стратегии генотипирования ВГВ методом PCR-RFLP по трем участкам генома В предыдущей главе на основе анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей ВГВ полученных из GenBank/EMBL нами было сделано заключение об относительно высокой частоте встречаемости рекомбинантных генотипов. В данной части исследования была поставлена задача разработать стратегию поиска рекомбинантных генотипов ВГВ, и на ее основе изучить возможность рекомбинации между генетическим материалом вирусов, принадлежащих к различным генетическим группам в популяции больных ХГВ г. Санкт-Петербурга. Для скрининга генотипов ВГВ нами был использован относительно простой в исполнении метод анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифицированных участков генома (PCR-RFLP). Генотип ВГВ в каждом образце определялся методом PCR-RFLP в трех различных участках генома вируса. Генотипирование ВГВ по участку pre-S проводили по методу, предложенному Линдом (Lindh et al., 1998). Метод основан на амплификации сегмента, расположенного между 2823 и 80 нуклеотидами генома ВГВ с последующей инкубацией амплификата с рестриктазами Eco47I (Avail) и Mbol (DpnII). Размеры образующихся рестрикционных фрагментов представлены в таблице 6.
Метод позволяет идентифицировать все известные генотипы. Для генотипирования ВГВ по участку гена S использовали метод аналогичный методу Линда (Lindh et al., 1997), однако, отличающийся от него в некоторых деталях. ПЦР проводили с праймерами S1 и S2, которые используются нами для рутинной диагностики ВГВ. Для предсказания продуктов рестрикции, образующихся при обработке рестриктазами TasI и Hinfl сегмента, расположенного в области между 362 и 715 нуклеотидами, было проанализировано 53 нуклеотидных последовательности ВГВ, полученных из GenBank/EMBL. Все известные генотипы A-G были включены в анализ. Результаты представлены в таблице 7. Для рестриктаз TasI и Hinfl было предсказана возможность образования семи и четырех рестрикционных вариантов, соответственно. Комбинация этих вариантов позволяет выделить 11 RFLP-групп и идентифицировать все известные генотипы, исключая генотип Е, который входит в одну RFLP-группу вместе с D2. Методика генотипирования ВГВ по области гена С, расположенной между 1863 и 2318 нуклеотидами, была разработана в нашей лаборатории. Стратегия генотипирования, также как и для области S, была определена посредством компьютерного анализа 53 нуклеотидных последовательностей, полученных из GenBank/EMBL. В таблице представлены результаты предсказания размеров рестрикционных фрагментов, образующихся при действии на данный участок генома ВГВ рестриктаз Alul и Mbol. Комбинация 16 и 8 рестрикционных вариантов, образующихся при обработке ПЦР-фрагмента эндонуклеазами Alul и Mbol, соответственно, позволяет выделить 20 RFLP-групп и идентифицировать все известные генотипы за исключением генотипа Е, который на основании RFLP-анализа входит в одну группу с D1 (таблица 8). Следует отметить, что рекомбинантные последовательности ВГВ, выявленные с помощью филогенетического анализа в предшествующей части нашего исследования, также могут быть распознаны при совместном анализе по трем участкам генома с помощью PCR-RFLP. было проанализировано 64 образца сыворотки крови, полученных от пациентов Городской Инфекционной Больницы №10, г. Санкт-Петербург, с диагнозом хронический вирусный гепатит В, и показавших в предварительном скрининге с помощью ПЦР присутствие ДНК ВГВ. ДНК, полученная из каждого образца, аликвотировалась на три части для амплификации S, preS и С областей генома ВГВ с последующим проведением RFLP-анализа. Таким образом, в общей сложности было проведено 192 PCR-RFLP-анализа. Электрофореграммы RFLP-групп, обнаруженных в нашем исследовании, представлены на рисунках 12, 13, 14. При генотипировании по области гена S RFLP-группы распределились следующим образом: D1 - 33 образца, D2 - 22, А - 5, С1 - 2 и два образца не могли быть отнесены ни к одному из предсказанных вариантов. При RFLP-анализе амплификатов по preS-области были получены следующие результаты: наибольшее число образцов - 46 - относилось к группе D2, 5 к D1, 1 к D-del, 5 к А1, 2 к СІ, один образец не относился ни к одному из предсказанных вариантов и в четырех случаях не удалось получить амплификат. При RFLP-анализе амплификатов по области С были получены следующие результаты: наибольшее число образцов - 53 - относилось к группе D2, 3 к D4, 4 к А, в двух образцах были одновременно представлены две RFLP-группы - С1 и С6, один образец не относился ни к одному из предсказанных вариантов и в одном случае не удалось получить амплификат (таблица 9). Таким образом, для 59 образцов сыворотки крови RFLP-анализ был проведен по трем областям генома ВГВ, и 5 образцов были проанализированы только по двум областям генома, в связи с невозможностью амплифицировать соответствующую область. В 63 образцах результаты определения генотипа методом PCR-RFLP по трем разным участкам генома ВГВ полностью совпали и свидетельствовали о явном доминировании ВГВ генотипа D в популяции больных ХГВ в Санкт-Петербурге (57 образцов - 89%). Значительно в меньшей степени в Санкт-Петербурге были представлены генотипы А (4 - 6,3%) и С (2 - 3,1%).
Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВГВ. Компьютерный анализ, полученных последовательностей
С целью подтверждения результатов генотипирования, полученных с помощью PCR-RFLP, выборочные образцы были клонированы в плазмиду pUC19, и нуклеотидная последовательность вставки была определена (см. Материалы и методы). Для избежания ошибок секвенирования каждый клон был прочитан с двух концов. Нуклеотидные последовательности изолятов ВГВ из Санкт-Петербурга и Якутии были выровнены с последовательностями, полученными из GenBank/EMBL. В выравнивание были включены представители всех известных генотипов ВГВ. Результаты филогенетического анализа по участкам генов S и С представлены на рисунках 17 и 18. Попарным сравнением нуклеотидных последовательностей было подсчитан средний процент дивергенции между изолятами из Санкт-Петербурга и Якутии, и 49 последовательностями, принадлежащими к генотипам A-G, из различных регионов мира (таблицы 10 и 11). Филогенетический анализ подтвердил результаты, полученные с помощью PCR-RFLP. Следует особо отметить, что также подтвердилось предположение о возможном присутствии рекомбинантного генома в образце 1664: клонированный участок гена S принадлежал к генотипу А, тогда как участок гена С кластеризовался с генотипом D. Для изолятов, полученных в данной работе, с помощью программы BLAST (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) были выявлены наиболее сходные последовательности, депонированные в GenBank/EMBL, из различных регионов мира (таблица 12). Одной из наиболее эффективных стратегий, используемой вирусом для того, чтобы избежать элиминирующего воздействия иммунной системы хозяина и поддержать персистенцию, является высокая аминокислотная изменчивость вирусных белков. Различные аминокислотные замены возникают у ВГВ в результате иммунного отбора в ходе естественного течения инфекции, в связи с иммуномоделирующей и медикаментозной терапией, а также в ответ на вакцинацию [Ngui S. et al., 1999]. Поэтому анализ биологической и патогенетической роли различных мутаций крайне важен для прогнозирования течения и исходов болезни, а также для разработки методов специфической терапии и профилактики. Для того чтобы проанализировать аминокислотные замены, нуклеотидные последовательности, полученные в данном исследовании, были транслированы в белковые и выровнены с последовательностями, полученными из GenBank/EMBL, с помощью программы GeneRunner (рисунки 19 и 20). S-область Предсказание серотипа.
Серологическая гетерогенность ВГВ определяется несколькими аминокислотными заменами в белке S. Замена Lys на Arg в позициях 122 и 160 определяет антигенные детерминанты d/y и w/r, соответственно. Остатки127 и 134 определяют различия между детерминантами w. Детерминанты wl и w2 характеризуются наличием в 127 позиции Pro, w3 - Thr, w4 - Leu; w2 отличается от wl аминокислотной заменой Phe—»Tyr в позиции 134, кроме того, wl-специфичность также зависит от присутствия Arg (Norder Н. et al., 1992а). Для девяти клонов, содержащих участок гена S, на основе аминокислотного анализа был предсказан серотип (таблица 13). Три штамма sAlYak, sA2Yak и sA3Yak содержали Lys122, Lys160 и Pro127, и, таким образом, должны быть отнесены к серотипу adw2. Штамм sClYak содержал Arg и Lys и, следовательно, принадлежал серотипу adr. У четырех штаммов была определена ау-специфичность (Arg122), причем один из них - sDlYak - имел в позиции 127 Thr, который определяет детерминанту w3; тогда как три штамма - sD2Yak, sD3Yak sD4Yak -имели Pro127 и Туг134, что характерно для детерминанты w2. Все предыдущие изоляты, относящиеся к генотипу D и описанные в литературе, принадлежали к субтипу ayw (ayw2, ayw3 и, редко, ayw4). В связи с этим интересно отметить, что штамм sD5SPt имел необычные для генотипа D аминокислотные замены Lys122 и Arg160, что в соответствии со схемой Нор дер [Norder Н. et al., 1992а] характеризует его как субтип adr. Однако, все описанные до сих пор варианты ВГВ, принадлежащие к субтипу adr в позиции 134 несли Phe, тогда как у sD5SPt в этой позиции находится Туг. Кроме того, дополнительные аминокислотные замены расположены в позициях ПО, 113 и 126. Профиль гидрофобности аминокислотной последовательности sD5SPt в области главной гидрофильной петли (MHL) аналогичен профилю дикого субтипа ayw2 и значительно отличается от профиля субтипа adr (рисунок 22). Очевидно, молекулярный подход, основывающийся на предсказании субтипа HBs по нескольким критическим остаткам, предложенный Нор дер [Norder Н. et al., 1992а], в определенных случаях может не согласовываться с серологическим типированием оригинальной антисывороткой. Анализ аминокислотных замен. Предсказание структурного и биохимического эффекта аминокислотных замен всегда представляет определенную сложность, особенно если трехмерная структура белка неизвестна. Тем не менее, учитывая свойства и позицию соответствующего остатка, мы попытались оценить значение некоторых замен. В девяти последовательностях было обнаружено 16 аминокислотных замен, при этом 9 замен (6 из них уникальные) были расположены в узкой области, перекрывающейся с В-клеточным эпитопом, между 115 и 138 аминокислотами белка S (рисунок 20). Все три якутских изолята, принадлежащих к генотипу А, несли замену 115 Thr— А1а; эта мутация была обнаружена у HBs-негативных пациентов, хотя всегда сопровождалась дополнительными аминокислотными заменами в MHL (Hou J. et al., 2001). Изолят sDlYak нес замены 118 Thr— Val и 128 Ala— Val, встречающиеся у пациентов, получавших интерфероновую терапию [Gunther S. et al., 1998] и у HBs-негативных пациентов с ХГВ [Banerjee К. et al., 1999]. Эти мутации вызывали изменение реактивности связывания моноклональных антител [Swenson P. et al., 2001]. Изолят sD3Yak нес замену 138 Cys— Arg. Как показано в экспериментах по направленному мутагенезу, замена Cys-138 не влияет на сборку и секрецию субвирусных частиц, однако значительно изменяет структуру субтиповой детерминанты д [Mangold С. et al., 1995]. Изолят sClYak нес замену 126 Thr—»Asn. Эта мутация была обнаружена у детей, получавших иммунопрофилактику для предотвращения переноса ВГВ от матери [Miyake Y. et al., 1996]; у взрослых, инфицированных ВГВ несмотря на вакцинацию [Не С. et al., 2001]; а также среди aHTH-HBs-положительных носителей ВГВ [Yamamoto К. et al., 1994]. Профиль гидрофобности, построенный для изолятов, полученных в нашем исследовании на основании предсказанных аминокислотных последовательностей, имеет существенные отличия в области MHL по сравнению с профилем, построенным на основании аминокислотных последовательностей дикого типа (рисунок 22).
Это указывает на различия в экспонировании аминокислотных остатков на поверхности HBs-антигена в мутантных и диких изолятах, что может повлечь за собой изменение антигенных свойств. Таким образом, большая часть аминокислотных замен в белке S, обнаруженных в нашем исследовании, была расположена внутри или в непосредственной близости от В-клеточного эпитопа, что в той или иной степени может влиять на экспрессию группоспецифичных детерминант и, возможно, позволяет вирусу ускользать от иммунного ответа. pre-C-стоп-кодон мутация В трех изолятах cC3Yak, cC4Yak и DlYak была обнаружена мутация G1896A, ведущая к образованию стоп-кодона вместо Тгр28 в pre-C-области. Эта мутация предотвращает синтез пре-кор белка и, следовательно, ведет к НВе(-)-фенотипу. С-область В острой фазе инфекции изменения в геноме ВГВ наблюдаются редко. Сильный и мультинаправленный CTL-ответ в течение острого ГВ предотвращает появление CTL-эскейп-мутантов [Bertoni R. et al., 1997]. Хотя в редких случаях такие мутанты могут появляться у пациентов с сильным, но узконаправленным CTL-ответом [Bertoletti A. et al., 1994]. Данные, указывающие на то, что во время острой фазы происходят какие-либо изменения в В- и Th-клеточных эпитопах отсутствуют [Ngui S. et al., 1999]. Наблюдения за больными с прогрессирующим ХГВ в течение длительного периода показали, что накопление мутаций в гене С связано с клиническим обострением. Хотя не удалось определить универсальный набор мутаций, который коррелировал бы с развитием обострения, в этих исследованиях было показано, что несинонимичные замены концентрируются в областях, кодирующих Т-хелперный и В-клеточный эпитопы [Carman W.F, et al., 1995; Asahina Y. et al., 1996; Bozkaya H. et al., 1996; Alexopoulou A. et al., 1997]. Рандомизированный мета-анализ нескольких работ показал, что аминокислотные изменения обычно представлены в большей части вирусной популяции и неслучайным образом распределены внутри НВс/е-последовательности. Около 75% всех аминокислотных изменений кластеризуются в 36 "горячих" точках, которые составляют только 20% НВс/е-последовательности [Gunther S. et al., 1999].
Гомологичная рекомбинация у ВГВ
Особый интерес представляют результаты нашего исследования, указывающие на высокую частоту рекомбинации между различными генотипами ВГВ. Рекомбинантные генотипы были обнаружены как при анализе нуклеотидных последовательностей, представленных в GenBank/EMBL, так и при скрининге популяции ВГВ в Санкт-Петербурге. Генетическая гетерогенность является одной из наиболее эффективных стратегий, используемых вирусом для того, чтобы избежать элиминирующего воздействия иммунной системы хозяина и поддержать персистенцию. ВГВ обладает высокой изменчивостью и, фактически, существует как квазивид -популяция родственных, но дивергировавших вирусов, представленных в индивидууме. Вирусная популяция состоит, по крайней мере, из одного доминантного варианта и множества минорных вариантов. Изменения в окружающей среде могут приводить к элиминации доминантного варианта и селекции минорного, который в результате сам становится доминантным. Таким образом, за счет вариабельности генетического пула обеспечивается пластичность вирусного ответа на давление иммунной системы хозяина. Скорость мутационной изменчивости ВГВ оценивается разными авторами в пределах 10"5 — 10"4 нуклеотидных замен/нуклеотид/год [Okamoto et al., 1987; Georgi-Geisberger P. et al., 1992] Эта скорость мутирования на несколько порядков больше, чем у других ДНК-вирусов и приближается к значению, характерному для РНК-вирусов. Высокая скорость изменчивости ВГВ связана со специфическим механизмом репликации этого вируса, которая протекает через стадию обратной транскрипции прегеномной РНК с помощью обратной транскриптазы. У этого фермента отсутствует 3 — 5 -корректирующая функция, что ведет к высокой скорости нуклеотидных замен, делеций и инсерций. Кроме того, данные, накопленные за последние годы, включая наше исследование, указывают на то, что рекомбинация может играть значительную роль в генерации генетического многообразия ВГВ. Так было показано, что В/С мозаичный генотип распространен по всей Юго-Восточной Азии, а различные варианты A/D мозаичных генотипов были найдены среди ВГВ изолятов из Италии, Греции и Южной Африки [Bowyer S. and Sim J., 2000; Morozov V. et al., 2000; Owiredu W. et al., 2001; Sugauchi F. et al., 2002]. А/С рекомбинантный генотип был обнаружен при анализе ВГВ во Вьетнаме [Hannoun С. et al., 2000]. Рекомбинантные штаммы были также найдены у двух пациентов коинфицированных ВГВ генотипов G и A [Kato Н. et al., 2002]. Исследование, проведенное недавно в Тибете, показало, что в этой области доминирует C/D мозаичный генотип ВГВ [Cui С. et al., 2002].
Кроме генерации новых вариантов ВГВ рекомбинация может служить эффективным механизмом для поддержания жизнеспособности вирусной популяции. Наличие пула генетических вариантов в хозяине, кроме определенных преимуществ, несет в себе и значительный риск для существования вируса. Быстрое накопление мутаций может поставить вирус на край самоуничтожения, поскольку многие из них оказываются вредоносными. Более того, когда вирусная популяция в процессе трансмиссии испытывает на себе эффект "горлышка бутылки" - только ограниченная и случайная часть популяции переносится в нового хозяина - приспособленность субпопуляции еще больше редуцируется. Модель "храповика Мюллера" (Muller s ratchet) предсказывает постепенное накопление вредоносных аллелей в ограниченной, асексуальной популяции в отсутствии рекомбинации. В результате популяция шаг за шагом теряет свою первоначальную приспособленность [Muller Н., 1964]. Действительно, такая потеря приспособленности быстро эволюционирующей вирусной популяции была подтверждена в экспериментах с РНК-вирусами [Chao L., 1990]. Генетическая рекомбинация может служить эффективным механизмом для удаления из популяции вредоносных аллелей за счет комбинирования свободных от мутаций частей различных геномов [Chao L. et al., 1997; Wooley et al., 1997]. Пока не ясно на какой стадии жизненного цикла ВГВ могут происходить рекомбинационные события. Репликация ВГВ протекает через механизм смены матрицы, который является причиной частой гомологичной рекомбинации у ретровирусов [Goodrich D. and Duesberg P., 1990]. Однако, репликация ВГВ протекает внутри нуклеокапсида, и в отличие от ретровирусов, которые содержат две геномные копии РНК в каждом вирионе, ВГВ содержит только одну копию прегеномной РНК [Ganem D., 1991]. В связи с этим кажется маловероятным, что механизм смены матрицы может приводить к появлению рекомбинантных геномов у ВГВ. Представляется более вероятным, что рекомбинация происходит в клеточном ядре в результате взаимодействия между молекулами кзкДНК. Если сравнить наши данные и данные об интеграции ВГВ в клеточную ДНК, представленные в литературе, можно обнаружить общую закономерность в распределении сайтов рекомбинации. Так 8 из 9 обнаруженных нами мозаичных геномов из GenBank/EMBL и вариант ВГВ, обнаруженный в Санкт-Петербурге, имели точку разрыва, расположенную между прямыми повторами DR1 и DR2. Высокое предпочтение этой области для интеграции в клеточную ДНК было обнаружено у большинства изолятов ВГВ, выделенных из гепатокарциномы.
Так по данным Pineau [Pineau P. et al., 1998] в области 1600-2000, которая захватывает оба прямых повтора DR1 и DR2, частота рекомбинационных событий почти в пять раз выше, чем в остальной части генома. Кроме того, было показано, что в этом районе расположен участок ДНК ВГВ (1855-1915), который усиливает рекомбинацию в эксперименте in vitro [Hino О. et al., 1991]. Вторая "горячая точка" рекомбинации расположена возле З -конца гена С. Она была обнаружена у всех В/С мозаичных геномов, а также у изолятов Х68292 и 1664REC (Санкт-Петербург), представляющих A/D рекомбинантные генотипы. Также было обнаружено несколько вариантов ВГВ с расположением точки рекомбинационного разрыва возле начала области pre-Sl [Hannoun С. et al., 2000; Owiredu W. et al., 2001] и в области S [Morozov V. et al., 2000; Cui С et al., 2002]. Кластеризация точек рекомбинации возле ограниченного числа сайтов генома ВГВ дает основания для выдвижения гипотезы о существовании специфичных механизмов, которые обуславливают такое предпочтение. Можно предположить, что как межмолекулярная рекомбинация между геномами ВГВ, так и интеграция вирусного генома в клеточную ДНК протекают по сходному механизму и через общие интермедиаты. Одним из таких механизмов может служить процесс иллегитимной репликации. В этом случае репликация вирусной ДНК проходит через стадию линейного интермедиата, который может эффективно участвовать как в интра-, так и в интермолекулярной негомологичной рекомбинации. Результатом такой рекомбинации может быть как образование мономерной кзкДНК, так и олигомерных форм, в которых мономеры соединяются концами в случайной ориентации [Yang W. and Summers J., 1995; Yang W. and Summers J., 1998]. Вероятно, в случае инфицирования сразу двумя различными генотипами могли бы образовываться мозаичные олигомерные формы. В дальнейшем при мономеризации таких олигомеров, с большой вероятностью должны были бы формироваться мозаичные геномы, сходные с обнаруженными нами. С другой стороны, существование "горячих точек" рекомбинации может быть результатом естественного отбора только определенных вариантов ВГВ из пула вирусов со случайно распределенными рекомбинационными стыками. Хотя генетический обмен, как указывалось выше, предоставляет преимущества в определенных обстоятельствах, случайная рекомбинация, без сомнения, чаще приводит к нежизнеспособным вариантам вируса. Вновь возникшему варианту с рекомбинантным геномом необходимо преодолеть давление иммунной системы хозяина и конкуренцию остальных вариантов вирусного пула, и, прежде всего не быть элиминированным в самом начале своего существования в результате генетического дрейфа. Очевидно, что рекомбинация может влиять на биологически важные свойства ВГВ, включая трансмиссивность, вирулентность и репликацию вируса.
![Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс]](/i/i/4440/193595.png "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] Кондратьева Ярослава Юрьевна")