Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] Кондратьева Ярослава Юрьевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кондратьева Ярослава Юрьевна. Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] : Диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.06

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 8

1.1. Общие характеристики вируса клещевого энцефалита 8

1.1.1. Вирус клещевого энцефалита - систематическое положение 8

1.1.2. Структура генома вируса клещевого энцефалита 9

1.1.3. Строение и функции белков вируса клещевого энцефалита 11

1.2. Патогенез клещевого энцефалита ...17

1.2.1. Клинические варианты клещевого энцефалита 17

1.2.2. Патогенез клещевого энцефалита 27

1.2.3. Факторы, влияющие на патогенез инфекхщи, вызванной вирусом клещевого энцефалита 31

1.3. Генетические маркеры вирулентности флавивирусов 40

1.4. Иммунологические механизмы защиты организма от инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита 45

1.5. Протективный иммунитет при клещевом энцефалите 56

2. Материалы и методы 63

2.1.Вирусы 63

2.2.Плазмиды 64

2.3. Культура клеток 64

2.4. Титрование инфекционного вируса 64

2.4.1.Титрование вкэ в культуре клеток спэв 64

2.4.2. Титрование вкэ на мышах 65

2.5. Гистологическое исследование ..65

2.6. Моделирование инфекции 66

2.7. Определение протективной активности 66

2.8. Изучение связывания вирусов с эритроцитами мыши 67

2.9. Иммуноферментный анализ 67

2.10. Определение концентрации интерлейкинов (ИЛ) в сыворотках крови 68

2.11. Определение концентрации а/в ифн в сыворотках крови мышей 68

2.12. Иммунопреципитация (ИП) вирусспецифических белков 69

2.13. Анализ вирионоввкэ с помощью ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ)70

2.14. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, кодирующих белок е ВКЭ ... 71

2.15. Анализ мозговой суспензии мышей на отсутствие РНК ВКЭ 73

3. Результаты 75

3.1. Характеристика острой и инаппарантной инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита 75

3.2. Изучение уровня репродукции в культуре клеток спэв штамма абсеттаров, родительского штамма ЭК-328 и варианта 82

3.3. Сорбция штамма абсеттаров, родительского штамма ЭК-328 и варианта м на эритроцитах мыши 82

3.4. Характеристика гуморального иммунитета при острой и инаппарантной формах клещевого энцефалита 84

3.5. Синтез основных цитокинов при острой и инаппарантной формах КЭ 90

3.6. Изучение связи тяжести заболевания с концентрацией ИЛ-2 и ИЛ-6 и содержанием антител к белкам вкэ в сыворотках крови людей, больных клещевым энцефалитом 96

3.7. Иммунитет при инаппарантной форме клещевого энцефалита, вызванной вариантом 101

3.9. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 ВКЭ 103

3.9. Молекулярно-биологическая характеристика белка Е вариантов вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью 105

4. Обсуждение 111

Выводы 127

Список литературы 129

Факторы, влияющие на патогенез инфекхщи, вызванной вирусом клещевого энцефалита
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, кодирующих белок е ВКЭ
Характеристика гуморального иммунитета при острой и инаппарантной формах клещевого энцефалита
Молекулярно-биологическая характеристика белка Е вариантов вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью

Введение к работе

Клещевой энцефалит (КЭ) - природно-очаговре заболевание, широко распространенное на территории Европы, Западной и Восточной Сибири, а также на Дальнем Востоке. В эндемичных регионах ежегодно регистрируется от 5 до 100 случаев КЭ на 100000 населения. Наибольшее количество заболеваний приходится на лихорадочную и менингеальную формы (от 80 до 90 и более процентов). На долю очаговых форм приходится меньшая часть заболеваний (1-10%), но это наиболее тяжелая форма с летальностью от 10 до 12% и высокой степенью инвалидизации больных (до 30%).

Эффективным средством профилактики КЭ является вакцинация. Несмотря на многолетнее успешное применение инактивированных цельновирионных вакцин против КЭ, заболеваемость КЭ как в России, так и за рубежом продолжает нарастать. Наблюдается расширение ареала распространения вируса КЭ (ВКЭ), изменение пространственной структуры нозоареала КЭ, появление случаев атипичного течения заболевания с выраженным геморрагическим синдромом и увеличение числа тяжелых форм.

Тем не менее, одной из основных форм проявления инфекционного процесса при КЭ (до 95% в отдельных регионах) является инаппарантная. Клинически она не диагностируется. Факты изоляции штаммов ВКЭ от людей без клинических проявлений заболевания, но отмечавших присасывание клещей, являются прямым доказательством частой инфицированности лиц ВКЭ с проявлением довольно низкого индекса манифестности. У 45 % людей, отмечавших присасывание клеща и имеющих вирусный антиген (АГ) в крови, противовирусные антитела (AT) не выявляются.

Таким образом, вирусологические и клинические наблюдения показывают, что инфицирование человека ВКЭ может иметь разные последствия - от инаппарантной формы инфекции до очаговых форм с летальным исходом. Исход и тяжесть заболевания определяются, по-видимому, как свойствами вируса, так и свойствами макроорганизма.

Основной биологической характеристикой ВКЭ, определяющей течение и исход болезни, является способность вируса преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему (ЦНС) - т.е. нейроинвазивность. Свойства вируса, определяющие его активность при периферическом попадании в организм млекопитающих, изучены недостаточно.

Достижения современной науки позволяют по-новому взглянуть на патогенез вирусных инфекций, в котором одно из ведущих мест занимают иммунологические процессы, представляющие собой сложный каскад взаимодействий вируса с различными иммунокомпетентными клетками. Механизмы развития инфекционного процесса в совокупности с данными о формировании иммунного ответа при КЭ до сих пор не исследованы. Поэтому одной из важных задач современной вирусологии является изучение особенностей взаимодействия штаммов ВКЭ с разным уровнем патогенности с иммунной системой макроорганизма.

Актуальность, своевременность и практическая значимость исследуемой проблемы связана с необходимостью получения новых знаний о развитии инфекционного процесса при заражении ВКЭ и о том, какие характеристики вируса влияют на тяжесть течения заболевания. Полученные данные могут дать новые возможности для прогнозирования течения и исхода заболевания, будут важны при разработке профилактических и лекарственных средств, в том числе - иммуномодуляторов, а также для оценки эпидемической ситуации в очагах.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение основных характеристик острой и инаппарантной инфекции, вызванной вариантами вируса КЭ с высокой и низкой нейроинвазивностыо при периферическом заражении мышей линии BALB/c.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить патогенез острой формы КЭ, вызванной адаптированными к мышам штаммами Абсеттаров и ЭК-328 при периферическом заражении мышей линии BALB/c.

2. Изучить патогенез инаппарантной формы КЭ, вызванной адаптированным к клещам вариантом М при периферическом заражении мышей линии BALB/c.

3. Изучить динамику накопления специфических AT и основных цитокинов в крови мышей при острой и инаппарантной формах КЭ.

4. Оценить возможность использования информации, полученной в экспериментах на мышах, для прогнозирования течения КЭ у людей.

5. Изучить протективный иммунитет, формирующийся при инаппарнтной инфекции, вызванной вариантом М ВКЭ.

6. Изучить молекулярно-биологические характеристики белка Е вариантов ВКЭ, вызывающих острую и инаппарантную формы инфекции.

7. Изучить протективные свойства бактериальной плазмиды pMV45 с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.

Научная новизна. В результате проделанной работы впервые получена подробная характеристика инаппарантной формы инфекции КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью, характеризующаяся отсутствием вирусемии и инфекционного вируса в ЦНС, синтезом AT к неструктурному белку NS1 при отсутствии синтеза AT к белку Е и формированием длительного протективного иммунитета.

Впервые показано, что отсутствие вирусемии при инаппарантной инфекции, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ, связано с быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови.

Впервые изучены особенности формирования иммунного ответа при инаппарантной форме инфекции КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ.

Впервые показана возможность формирования длительного протективного иммунитета при иммунизации мышей адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью без участия AT к поверхностному гликопротеину Е.

Впервые изучены молекулярные механизмы, лежащие в основе низкой нейроинвазивности варианта ВКЭ, полученного при адаптации к клещам. Показано, что при адаптации к клещам ВКЭ происходит селекция вариантов вируса с мутациями в геноме, приводящими к изменению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах (ГАГ).

Научно-практическая ценность. В процессе данной работы было показано, что экспериментальная инфекция у мышей является хорошей моделью не только для изучения патогенеза, но и для изучения механизмов формирования иммунного ответа и протективного иммунитета при КЭ у людей.

Получены предварительные данные, указывающие на то, что повышение концентрации сыворотчного ИЛ-6 при КЭ является признаком повреждения клеток ЦНС вирусом и свидетельствует о тяжелом течении инфекционного процесса.

На мышиной модели показано, что для иммунизации неструктурным белком NS1 перспективной биологической системой синтеза и доставки АГ является бактериальная плазмида, с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.

Полученная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в организме клеща может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза AT к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей. Сведения о распространении подобных вариантов в природе могут дать новую информацию о микроэволюции ВКЭ и о связи свойств циркулирующих в очаге штаммов ВКЭ с частотой и тяжестью заболевания.

Факторы, влияющие на патогенез инфекхщи, вызванной вирусом клещевого энцефалита

Характер заболевания определяется рядом факторов - реактивностью макроорганизма, внешними воздействиями (переохлаждение, травмы, стрессовые состояния) и свойствами возбудителя болезни (Шаповал, 1980).

Среди свойств организма-хозяина, влияющих на патогенез инфекции, наибольшее значение имеют возраст, пол, генетическая предрасположенность и иммуннологический статус. Например, в Приморском Крае за период с 1990 по 2000 годы заболеванию КЭ в большей степени были подвержены лица мужского пола (78,5%) (Павленко и др., 2002). Обычно это явление связывают с более интенсивным посещением леса мужчинами. Однако, В.Г.Борисевич и Г.Н.Леоновой было показано, что при "укусе" клеща частота выявления антигенемии одинакова как у лиц мужского, так и женского пола, но среди лиц, предъявляющих жалобы, на долю мужчин пришлось 29,8%, а на долю женщин - 17,5%. (Борисевич и Леонова, 2002). Авторы полагают, что для проникновения вируса в организм человека пол не имеет значения, но он играет роль в развитии инфекционного процесса.

Л.О.Черницыной (Черницына и др., 1991) была выявлена определенная подверженность заболеванию КЭ и, наоборот, резистентность к нему в зависимости от пола, возраста, групп крови и антигенов HLA и их сочетаний. Среди заболевших наиболее часто встречаются мужчины детского возраста с 0(1) группой крови. Среди лиц, устойчивых к заболеванию КЭ, преобладают женщины старше 50 лет с АВ (IY) группой крови. Авторами выявлены HLA-маркеры, ассоциированные с той или иной формой заболевания:КЭ,.Было также показано, что уровень противовирусных AT классов IgM и IgG и темп их накопления в сыворотке крови больных КЭ тесно ассоциированы с некоторыми аллелями генов HLA-комплекса класса I. Некоторые из этих аллелей ассоциированы, кроме того, с преимущественной и более интенсивной продукцией определенных изотипов имунноглобулинов и задержкой переключения синтеза IgM-AT на синтез IgG-AT в процессе заболевания (Черницына и др., 1994).

О генетически-обусловленной предрасположенности к КЭ говорит и разная чувствительность к КЭ разных линий мышей (Ларина и Левкович, 1983; Канн и др., 1986). Показано, что резистентность мышей к ВКЭ обусловлена доминантной аллелью аутосомного гена, обозначенной как Flavivirus Resistance Locus (Flv) (Sangster et al., 1993).

Большое влияние на возникновение и развитие заболевания; оказывают переохлаждение, прием алкоголя, чрезмерный труд, особенно физический, неполноценное питание, истощение, травмы, стрессовые состояния и другие факторы, снижающие резистентность организма (Шаповал, 1980).

Влияние температурных и эмоциональных стресс-факторов на течение экспериментальных флавивирусных инфекций у мышей было изучено С.В.Ожерелковым с соавторами. Ими было показано, что физический и эмоциональный: стресс приводят к возникновению временных Т- и В-клеточных дефектов иммунитета, которые сопровождаются активацией бессимптомной инфекции, вызываемой вирусом Лангат, и сокращением средней продолжительности жизни животных при острой инфекции, вызванной ВКЭ. Активация бессимптомной инфекции сопровождается значительным повышением титра вируса в головном мозге животных и повышением летальности (Ожерелков и др., 1986). Одним из механизмов возникновения временного стресс-индуцированного иммунодефицита является снижение продукции лимфоцитами у-интерферона (у-ИФН). Снижение продукции у-ИФН в условиях стресса опосредовано угнетением выработки Т-лимфоцитами интерлейкина-2 (ИЛ-2), который является одним из основных медиаторов иммунных реакций, выполняя пусковую функцию при пролиферации и дифференцировке лимфоцитов, инициируя синтез у-ИФН (Готовцева и др., 1990). Одним из факторов, определяющих патогенез инфекции, тяжесть течения заболевания и его исход, по-видимому, являются свойства возбудителя болезни. Различия в тяжести течения КЭ в разных регионах позволили предположить, что ВКЭ I генотипа (соответствует восточному подтипу) вызывает более тяжелые формы заболевания, а наименее вирулентным является вирус II генотипа (соответствует западному подтипу). ВКЭ III генотипа (сибирский подтип) имеет промежуточную характеристику. Однако такое генетическое распределение штаммов ВКЭ является условным, так как на разных территориях одновременно циркулируют варианты вируса с разной степенью патогенности, способные вызывать заболевания различной тяжести, а также относящиеся к разным генотипам (Лезина, 1978; Баннова и др., 1982; Погодина, 2003; Погодина и др, 2004а, Погодина 20046). При детальном изучении популяции ВКЭ, циркулирующего на территории Дальнего Востока, были найдены и культивированы штаммы вируса, вызывающие инаппарантную и очаговые формы инфекции. Методом гибридизационного анализа вирусной РНК штаммы разделили на две основные группы. В одну вошли штаммы, выделенные из мозга умерших от энцефалита людей и больных лихорадочной формой инфекции, а в другую - штаммы выделенные от людей с инаппарантной формой инфекции. Первая группа штаммов по данным гибридизации приближалась к штамму Софьин, являющемуся прототипным для первого генотипа. Вторая группа штаммов существенно отличалась от штамма Софьин и по данным гибридизации была ближе к штаммам третьего генотипа ВКЭ (Леонова и др., 2001). По данным В.И. Злобина (Злобин и др., 2001), соотношение генотипов I и III в дальневосточном регионе равняется приблизительно 2:1. С помощью метода молекулярной гибридизации с генотипспецифическими дезоксиолигонуклеотидными зондами В.И.Злобиным с соавторами было установлено, что на территории Восточной Сибири циркулируют 5 генотипов ВКЭ, три из которых являются основными. Исследования показали, что из 60 проанализированных штаммов 13 относились к генотипу I, что составило 21,6%, 4 штамма - к западному генотипу II (6,6%), 41 штамм - к генотипу III (68,3%) и по одному штамму к генотипам 4 и 5. Т.о., доминирующим генотипом на территории Восточной Сибири является генотип III. Авторы предположили, что различия в клиническом течении заболевания в Воточной Сибири и на Дальнем Востоке связаны с циркулирующим генотипом вируса. Вероятно, что тяжелые формы КЭ вызываются преимущественно генотипом I ВКЭ, а наиболее доброкачественные, каких большинство в Восточной Сибири - генотипом III.

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, кодирующих белок е ВКЭ

При определении нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, кодирующих белок Е родительского штамма ЭК-328 и варианта М, для получения вирусной РНК использовали 10 % вируссодержащую мышиную мозговую суспензию.

РНК выделяли методом фенольной экстракции. Для этого к мозговой суспензии добавляли 1/10 объема 10% додецилсульфата натрия (SDS) и равный объем перегнанного фенола, насыщенного раствором ацетата аммония (рН 5,5). Смесь осторожно встряхивали в течение 10-15 мин, центрифугировали 10 мин при 12 000 об/мин. Водную фазу экстрагировали еще дважды равным объёмом насыщенного фенола без добавления SDS, а затем один раз равным объемом смеси насыщенного фенола и хлороформа (1:1). К водной фазе добавляли 5 М ацетат аммония до конечной концентрации 2 М и 1,5 объема изопропилового спирта, тщательно перемешивали и оставляли на ночь при минус 20С.

РНК осаждали из-под спирта центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 15 мин при 4С, промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом и растворяли в 16 мкл трижды перегнанной Н2О. Затем добавляли 2 мкл праймера Kgg21 (12 мкг/мл) (табл. 2.2) и 2 мкл 10х буфера для отжига. Перед началом обратной транскрипции проводили плавление матрицы и отжиг праймера. Для этого полученную смесь нагревали до 75С и охлаждали на водяной бане до 30С в течение 30-40 мин. Затем к смеси добавляли 6 мкл 5х ревертазного буфера (поставляемого фирмой Promega в комплекте с ферментом), 3 мкл смеси dNTP 2,5 mM каждого и 1 мкл (200 ед) РНК-зависимой-ДНК-полимеразы M-MLV (Promega, США). Инкубацию проводили при 42С в течение часа.

После обратной транскрипции проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием Taq-ДНКполимеразы (Promega, США) и олигонуклеотидов («Syntol», Россия) на безмасляном амплификаторе Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer). Для аналитических целей реакцию вели в 25ц1. К 2,5 мкл смеси, полученной после ОТ, добавляли по 2,5 мкл праймеров (обратного и прямого) (табл. 2.2.), добавляли 17 мкл смеси,

в которой на 1 мл приходилось 120 мкл 2,5мМ раствора dNTP, 144 мкл Юхбуфера для Taq-полимеразы и 736 мкл трижды перегнанной НгО, 0,5д.1 Taq-ДНКполимеразы. Пробы прогревали 2 мин при 95С, затем проводили 40 реакционных циклов. Циклы состояли из следующих этапов: 15 сек при 95 (денатурация), 30 сек при 50 (отжиг праймеров), 1 мин при 72 (синтез ДНК). Последний цикл завершался 7 мин при 72. Для получения больших количеств продукта ПЦР общий объем реакционной смеси увеличивали до ЮОц.1. Для аналитического электрофореза нуклеиновых кислот использовали 1% горизонтальный агарозный гель. К расчитанному количеству порошка агарозы (Sigma type I) добавляли 5 мл буфера ТВЕ (0,9 М Tris; 0,9 М Н3ВО3; 200 тМ ЭДТА) и доводили объем водой до 50 мл. Агарозу расплавляли на кипящей водяной бане и добавляли 3 мкл насыщенного раствора бромистого этидия. Гель заливали в горизонтальную плашку и оставляли застывать при комнатной температуре, вставив гребенку для образования лунок для нанесения образцов. Пробу ДНК перед нанесением на гель смешивали с Ул объема краски. Электрофорез проводили в ІхТВЕ при напряжении 5-7,5 в/см.

Препаративный электрофорез проводили в 0,8% геле из легкоплавкой агарозы («Sigma», США) с добавлением бромистого этидия (5 мкл на 50 мл). После окончания электрофореза полосу геля, содержащую нужный фрагмент, вырезали, помещали в пробирку, добавляли 800 мкл трижды перегнанной НгО и расплавляли в водяной бане при 65С в течение 40 мин, встряхивая каждые 10 минут. Затем ДНК трижды экстрагировали 1 мл насыщенного фенола, один раз смесью фенол/хлоформ 1:1. Водную фазу концентрировали бутанолом-2 до 100u.l. ДНК осаждали при минус 20С в течение ночи равным объемом 5 М ацетата аммония и 4 объемами этанола.

Секвенирование проводили с помощью набора для секвенирования ДНК «DNA Cycle Sequencing System» (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. Для кинирования праймеров использовался [32Р]-уАТР («Изотоп», Россия). Электрофорез продуктов реакции проводился в 8 % полиакриламидном геле с мочевиной на приборе фирмы «Macrophor». Также для определения нуклеотидной последовательности использовался автоматический секвенатор ABI PRISM Model 310, Version 3.0.

Для приготовления секвенирующего геля смешивали 10 мл раствора акриламида/бис-акриламида 38:2, 5 мл ЮхТВЕ, 35 мл раствора мочевины (240 г на 350 мл НгО) дегазировали под вакуумом в течение 10 мин, добавляли 400 мкл 10% раствора персульфата аммония и 18 мкл TEMED. Аккуратно заливали гель между двумя стеклами длиной 50 см, «намазывая» его верхним стеклом (предварительно обработано 28 мкл Silane А174, суспендированного в 10 мл Н20 с доведенным уксусной кислотой рН до 3,5) на нижнее, и оставляли полимеризоваться на 1,5 часа. Стекла с гелем устанавливали в прибор для вертикального электрофореза ("Macrophor", Pharmacia, США), заполняли электродные резервуары 0,5хТВЕ, подсоединяли водяной термостат (27С) и проводили префорез в течение 20 мин. После нанесения проб температуру поднимали до 50С и проводили электрофорез при постоянном токе 17 мА. После окончания электрофореза гель, ковалентно пришитый к верхнему стеклу, отмывали от мочевины 10% уксусной кислотой и сушили при 120 С. На высушенный гель накладывали рентгеновскую пленку и экспонировали нужное время.

Участки ДНК, где были обнаружены замены, секвенировали не менее двух раз. Анализ полученных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы "Gene Runner". Использованные в работе олигонуклеотиды были синтезированы фирмой «Syntol», (Россия) и приведены в таблице 2.2. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, кодирующих белок Е ВКЭ, было выполнено совместно с сотрудниками лаборатории молекулярно-биологических методов контроля ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова Бахмутовым Д.В. и Романовой Л.Ю. Для контроля выделения РНК и получения кДНК использовали внутренний положительный контроль. Для этого к каждой пробе МС, которую анализировали на содержание РНК ВКЭ, добавляли 1/10 объема полиовируса типа 3 (штамм Сэйбина, 7,5 Ig БОЕ/мл). Выделение РНК проводили методом фенольной экстракции (см. п. 2.14). Синтез кДНК ВКЭ и полиовируса проводили в одной пробирке. Для ОТ использовали специфические праймеры («Syntol», Россия) для ВКЭ (Kggl9, см. табл. 2.2) и полиовируса типа 3 (UC22: 4152 5 ca-gta-aattctc-aac-ca-3 4133) по 2 мкл на пробу в концентрации 12 мкг/мл. ОТ проводили, как описано в п. 2.14.

Характеристика гуморального иммунитета при острой и инаппарантной формах клещевого энцефалита

На следующем этапе работы мы попытались оценить характер иммунного ответа при острой и инаппарантной формах КЭ по уровню синтеза основных цитокинов, так как именно цитокины обеспечивают кооперацию иммунокомпетентных клеток, направляют развитие иммунного ответа по ТЫ - или Th2 типу и являются маркерами иммунологических процессов.

Для изучения синтеза цитокинов при острой и инаппарантной формах инфекции мы использовали и/п заражение мышей. Данный способ введения инфекционного материала был выбран потому, что цитокины синтезируются в месте проникновения возбудителя и при первичном иммунном ответе практически не поступают в кровоток. Только при патологии содержание цитокинов в крови повышается (Ярилин, 1997). Данное свойство цитокинов затрудняет определение их концентрации при подкожном или внутрикожном введении АГ. При и/п введении инфекционного материала происходит быстрая генерализация инфекции, что приводит к накоплению цитокинов в крови зараженных животных и облегчает решение нашей задачи. а/р-ИФН является фактором неспецифической резистентности при вирусных инфекциях (Ройт и др., 2000; Biron & Sen, 2001). Он вырабатывается клетками макрофагально-моноцитарного ряда и фибробластами сразу после проникновения возбудителя во внутреннюю среду организма. Поэтому данный цитокин был выбран нами в качестве маркера активации неспецифического иммунного ответа.

Концентрацию а/р-ИФН в сыворотке крови животных, инфицированных и/п 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М, измеряли по противовирусной активности против 100 ТЦД50 вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в культуре клеток L41 (Рисунок 3.10) через 5, 10 и 24 часа после заражения. За титр а/р-ИФН принимали максимальное разведение сыворотки, подавляющее цитопатогенное действие 100 ТЦД50 вируса ЕМС. В качестве контроля использовали сыворотку крови от трех мышей, которым вместо вируса вводили мозговую суспензию от здоровых мышей в соответствующем разведении.

В сыворотке крови контрольных мышей через 5 часов после введения мозговой суспензии от здоровых мышей мы обнаружили ИФН в титрах 1:8, который отсутствовал в следующей пробе, взятой после этого через 5 часов.

При развитии острой инфекции КЭ, вызванной штаммом Абсеттаров, а/р-ИФН отсутствовал в сыворотке крови мышей через 5 часов, выявлялся через 10 часов и сохранялся в невысоких титрах через сутки после начала инфекции. Штамм ЭК-328 оказался менее интерфероногенным. а/р-ИФН удалось выявить в крови в низких титрах только через 10 часов после начала инфекции. При развитии же инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, максимальная концентрация а/р-ИФН была выявлена в сыворотке крови животных уже через 5 часов после заражения в более высоком, по сравнению с данными для штаммов Абсеттаров и ЭК-328, титрами. Далее а/р-ИФН быстро элиминировался из крови животных.

Уровень остальных ключевых цитокинов в сыворотках крови животных, зараженных и/п 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М в виде КЖ инфицированных клеток СПЭВ, устанавливали с помощью коммерческих наборов для определения соответствующих цитокинов методом ИФА. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.4. Уровень цитокинов в сыворотках крови инфицированных мышей сравнивали с уровнем цитокинов в контрольных сыворотках, полученных от животных, которым и/п была введена питательная среда 199 на растворе Эрла в объеме 0,3 мл.

В первые часы после заражения животных изучаемыми штаммами ВКЭ мы наблюдали повышение в крови уровня ФНО-а и ИЛ-10. ФНО-а является провоспалительным цитокином. Его появление в крови свидетельствует об активации макрофагов и нейтрофилов. Ранее было показано, что ФНО-а индуцирует синтез ИЛ-10, a ИЛ-10 в свою очередь, подавляет синтез ФНО-а (van der Pool et al., 1994). В нашем эксперименте ИЛ-10 появлялся одновременно с ФНО-а, после чего концентрация ФНО-а в крови животных понижалась до уровня контроля.

Известно, что ИЛ-10, являясь регулятором иммунных реакций, подавляет продукцию таких основных провоспалительных цитокинов, как ИЛ-б, ФНО-а, экспрессию на клеточной мембране МНС-П и антигенпредставляющую способность моноцитов/макрофагов, а также продукцию цитокинов (у-ИФН, ИЛ-2) ТЫ лимфоцитами, продукцию цитокинов НК, пролиферацию Т-лимфоцитов (Кашкин, 1998), вызывая, т.о. состояние иммунодепрессии у инфицированных животных.

При развитии острой формы КЭ, индуцированной штаммом Абсеттаров, мы наблюдали резкое увеличение концентрации этого цитокина через 10 часов после заражения животных. Затем происходило постепенное снижение концентрации ИЛ-10 ко 2-м суткам, и по 6-е сутки этот ИЛ в сыворотке животных не определялся. Только на 7-е сутки у больных животных мы наблюдали вторичное повышение уровня ИЛ-10 в крови. При инфекции мышей штаммом ЭК-328 мы наблюдали кратковременное повышение ИЛ-10 через 18 часов после начала инфекции. Далее ИЛ-10 появился только в крови заболевших на 7 сутки мышей. У мышей без признаков заболевания данный ИЛ на 7 сутки в крови не выявлялся. Резкое повышение в первые часы и последующее понижение ко 2-м суткам концентрации ИЛ-10 мы наблюдали и у мышей с инаппарантной формой инфекции, вызванной вариантом М. Таким образом, можно предположить, что ВКЭ, попадая в организм мыши, индуцирует состояние иммунодепрессии у инфицированных животных в первые часы после заражения, при этом штаммы ВКЭ могут различаться по выраженности и длительности вызываемой ими иммунодепрессии. На 4-е сутки у животных, зараженных штаммом Абсеттаров, в сыворотках крови появляются ИЛ-6 и незначительное количество у-ИФН. У животных, зараженных штаммом ЭК-328, у-ИФН и ИЛ-6 появились раньше - на 3 сутки после заражения.

Молекулярно-биологическая характеристика белка Е вариантов вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью

В патогенезе вирусных инфекций важную роль играют иммунологические механизмы, представляющие собой сложный каскад взаимодействия иммунокомпетентных клеток с возбудителем заболевания. Поэтому мы попытались рассмотреть развитие инфекции КЭ в совокупности с данными о характере формирования иммунного ответа. Для этого мы оценивали динамику распределения вируса в органах мышей одновременно с содержанием в крови инфицированных животных противовирусных AT и ключевых цитокинов, направляющих развитие иммунного ответа и являющихся основными маркерами иммунологических процессов.

Модель острого КЭ была получена нами при периферическом заражении мышей штаммами Абсеттаров и ЭК-328, обладающими одинаково высокой нейровирулентностью и мало различающимися по нейроинвазивности. После и/п введения мышам 1000 БОЕ данных штаммов мы наблюдали двухволновую вирусемию с пиками на 2-3 и 5-6 сутки и отсутствие вируса в крови на 4-е сутки, размножение вируса в лимфатических узлах, селезенке и головном мозге животных, появление противовирусных AT. При заражении мышей штаммом Абсеттаров мы наблюдали более высокий 2-й пик вирусемии, а при инфекции штаммом ЭК-328 1-й пик вирусемии был значительно выше, чем 2-й, что сопровождалось более ранним, чем при инфекции штаммом Абсеттаров, появлением вируса в мозге зараженных животных и более поздней их гибелью.

При проведении морфологического исследования головного мозга мышей, умерших от острой инфекции после и/п введения штаммов Абсеттаров и ЭК-328, мы наблюдали картину тяжелого менингоэнцефалита.

Наши данные согласуются с данными других авторов, изучавших патогенез острого КЭ на мышах (Авакян и др., 1960; Albrecht, 1962; Хань-Ши-Цзе и Погодина, 1964; Левкович и др., 1967).

Модель инаппарантной инфекции КЭ мы получили при периферическом заражении мышей адаптированным к клещам И. marginatum marginatum вариантом М, обладающим низкой нейроинвазивностью для мышей при сохранении высокой нейровирулентности. Инаппарантная инфекция, вызванная вариантом М, характеризуется отсутствием клинических симптомов заболевания, отсутствием вирусемии, отсутствием инфекционного вируса в головном мозге зараженных животных, отсутствием морфологического повреждения ЦНС, отсутствием развития персистентной инфекции. При этом нами было выявлено размножение вируса в органах иммунной системы - региональных лимфатических узлах и селезенке.

Еще одной особенностью инфекции вариантом М было отсутствие противовирусных AT в сыворотках крови зараженных животных и формирование длительного протективного иммунитета к последующему заражению высоковирулентным штаммом ВКЭ.

Предполагают несколько путей проникновения флавивирусов в ЦНС при периферическом введении инфекционного материала: инфекция незащищенных гематоэнцефалическим барьером нейронов обонятельного тракта (McMinn et al., 1996); инфекция эндотелиальных клеток капилляров мозга, последующий трансцитоз и высвобождение вируса в паренхиму мозга (Liou and Hsu, 1998); диффузия вируса между эндотелиальными клетками капилляров в паренхиму мозга (Kobiler et al., 1989). Основным условием для проникновения вируса в головной мозг животных является высокий уровень вирусемии (McMinn, 1997). Тем не менее, нельзя исключить, что существует способ проникновения флавивирусов в ЦНС и при низкой концентрации вируса в крови инфицированных животных.

Как было сказано выше, некоторые исследователи при изучении патогенеза инаппарнтной инфекции, вызванной периферическим введением аттенуированных штаммов ВКЭ, на фоне нерегулярной и невысокого уровня вирусемии в низких титрах выявляли инфекционный вирус (Майер, 1964; Погодина и Хань Ши-цзе, 1964; Усебаева и др., 1970) или вирусный АГ в головном мозге мышей (Усебаева и др., 1970). В литературе также описана инаппарантная форма инфекции, вызванная пероральным ведением аттенуированного штамма И-40 Д вируса ШЭО, при которой ни вирус, ни АГ не были обнаружены в головном мозге или крови животных. Однако при подкожном введении данного штамма инфекционный вирус выделялся из крови, а вирусный АГ был обнаружен в мозге зараженных животных (Степанова и др., 1970).

В наших экспериментах мы получили модель инаппарантной инфекции, при которой вирус при и/п введении не выявлялся в крови и не попадал в ЦНС, о чем свидетельствует отсутствие инфекционного вируса на протяжении всего периода наблюдения и отсутствие вирусной РНК, показанное с помощью ОТ-ПЦР, в мозге зараженных мышей. Мы предположили, что низкая нейроинвазивность варианта М определяется отсутствием вирусемии. Можно предложить несколько механизмов, объясняющих отсутствие вируса в крови зараженных животных: 1) При низкой скорости репродукции вируса происходит уничтожение возбудителя за счет синтеза AT. Однако при инфекции вариантом М мы не выявили AT в сыворотке крови зараженных животных с помощью метода ИФА. 2) Отсутствие размножения вируса во внутренних органах. Однако нами была показана репродукция варианта М в лимфатических узлах и селезенке. 3) Быстрая элиминация вируса из кровотока клетками ретикулоэндотелиальной системы, к которым относятся ретикулярные соединительнотканные клетки в костном мозге, в лимфатических узлах и селезенке, ретикулоэндотелиальные клетки в лимфатических синусах и узлах, в венозных синусах селезенки, в капиллярах долек печени и костного мозга, гистиоциты - подвижные клетки соединительной ткани. Изучив динамику накопления штаммов Абсеттаров и ЭК-328, вызывающих острую форму КЭ, при репродукции в культуре клеток СПЭВ мы показали, что на протяжении всего периода репродукции этих штаммов титры внеклеточного вируса преобладают над титрами связанного с клетками вируса. Напротив, у варианта М, вызывающего инаппарантную форму КЭ, титры вируса, связанного с клетками, преобладают над титрами вируса, высвобождающегося в КЖ. Преобладание связанного с клетками вируса над внеклеточным может быть вызвано как нарушением выхода вирионов из клетки, так и связью вирусных частиц с рецепторами на поверхности клеточных мембран. Замедленное высвобождение вирионов варианта М из инфицированных клеток в межклеточное пространство может обеспечивать сниженный уровень вирусемии. При изучении динамики связывания с эритроцитами вирионов варианта М, вызывающего инаппарантную инфекцию у мышей, и штаммов ЭК-328 и Абсеттаров, вызывающих острую инфекцию, оказалось, что сорбция вирионов на эритроцитах варианта М в 50-100 раз выше, чем этот показатель для штаммов ЭК-328 и Абсеттаров. Следовательно, эритроциты могут обеспечивать удаление этого вируса из кровяного русла.

Связанный с эритроцитами вариант М не терял инфекционности. Адсорбция вирусов на красных клетках крови без потери инфекционности была показана ранее C.A.Mims (1964) для вирусов гриппа и вируса лимфоцитарного хориоменингита. Однако в этих экспериментах повышенное сродство к эритроцитам приводило к установлению вирусемии, а также к дессиминации вирусов в другие органы и ткани, что способствовало развитию инфекции.

По-видимому, отсутствие вирусемии при инаппарантной инфекции КЭ у мышей, вызванной вариантом М, может являється следствием быстрой элиминации вируса из кровотока за счет доставки сорбированного на эритроцитах вируса к клеткам ретикулоэндотелиальной системы, где происходит его уничтожение.