Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Общая характеристика. 8
1.1. Общая характеристика рода Flavivirus. 8
1.2. Процессинг вирусного полипротеина. 11
1.3. Структурные белки флавивирусов. 13
1.4. Неструктурные белки флавивирусов . 15
1.5. Репликация РНК. 19
2. Патогенетические характеристики ВКЭ. 23
2.1. Клиническая картина клещевого энцефалита. 23
2.2. Распространение вируса в организме. 26
2.3. Генотипы вируса клещевого энцефалита и их распространение. 27
2.4. Связь генотипов с вирулентностью. 28
2.5. Связь различных участков генома с вирулентностью . 29
3. Иммунный ответ при клещевом энцефалите. 33
3.1. Особенности формирования противовирусного иммунного ответа. 33
3.2. Иммунный ответ при клещевом энцефалите. 38
3.3. Факторы, определяющие течение заболевание при инфекции вирусом клещевого энцефалита. 42
3.4. Общие сведения об интерфероновой системе. 43
4. Связь гетерогенности вирусной популяции с патогенетическими характеристиками вируса. 57
4.1. Общие положения эволюции популяции РНК-вирусов. 57
4.2. Изменение вирусной популяции при смене хозяина. 61
4.3. Фенотипические и генетические изменения вируса клещевого энцефалита при адаптации к клещам и млекопитающим. 65
4.4. Характеристика ревертантов, полученных при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ с помощью клонирования. 67
Материалы и методы 70
1. Используемые вирусы. 70
2. Используемые культуры клеток млекопитающих. 70
3. Лабораторные животные. 71
4. Получение гипериммунной асцитной жидкости. 71
5. Олигонуклеотиды 71
6. Получение вируссодержащей суспензии мозга и селезенки мыши. 71
7. Титрование инфекционного вируса. 71
8. Титрование ВКЭ на мышах. 72
9. Клонирование вируса методом бляшек. 72
10. Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток. 72
11. Моделирование инфекции. 73
12. Определение концентрации -, -IFN и -IFN в сыворотках крови мышей. 73
13. Определение IFN-чувствительности ВКЭ методом титрования. 74
14. Иммуноферментный анализ. 74
15. Методы работы с белками. 74
15.1. Приготовление проб для изучения экспрессии вирусных белков. 74
15.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. 75
15.3. Вестерн-блот. 75
16. Методы работы с нуклеиновыми кислотами. 76
16.1. Выделение РНК. 76
16.2. Обратная транскрипция. 76
16.3. Полимеразная цепная реакция. 77
16.4. Полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени (RealTimePCR). 78
16.5. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле. 78
16.6. Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы. 79
16.7. Определение нуклеотидной последовательности. 79
16.8. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. 80
Результаты 81
1. Определение полных нуклеотидных последовательностей геномов ревертантов 58 и 57. 84
2. Оценка вирулентности исследуемых вирусных вариантов на мышах. 87
3. Детальная характеристика начальных этапов инфекции. 89
3.1. Динамика появления вируса в крови, селезенке и мозге инфицированных животных на ранних стадиях инфекции при заражении вариантами ВКЭ . 89
3.2. Динамика индукции интерферонов на ранних этапах инфекции. 94
4. Изучение динамики размножения вариантов вируса клещевого энцефалита в различных культурах клеток. 98
4.1. Характеристика репродукции выбранного набора вирусов в перевиваемых культурах клеток. 99
4.2. Изучение цикла репродукции вариантов ВКЭ в культуре клеток СПЭВ . 100
4.3. Детальное изучение цикла репродукции вариантов штамма ЭК-328 в культуре первичных фибробластов, а также в перевиваемой культуре клеток мышиных фибробластов L-929 и макрофагоподобных клеток Р388. 104
5. Пассирование штамма ЭК-328, варианта М и ревертанта 58 в перевиваемой культуре макрофагоподобных клеток и фибробластов мыши. 119
5.1. Характеристика вирусов, полученных при пассировании вариантов штамма ЭК-328 на клетках L-929. 120
5.2. Оценка вирулентности вирусных вариантов после 15-го пассажа на клетках L-929. 121
5.3. Сравнение полных нуклеотидных последовательностей вариантов ВКЭ, адаптированных к клеткам мышиных фибробластов L-929. 123
5.4. Характеристика вирусов, полученных при пассировании вариантов штамма ЭК-328 на клетках Р388. 125
Обсуждение 127
Выводы 141
Список литературы 143
- Неструктурные белки флавивирусов
- Связь различных участков генома с вирулентностью
- Динамика появления вируса в крови, селезенке и мозге инфицированных животных на ранних стадиях инфекции при заражении вариантами ВКЭ
- Изучение цикла репродукции вариантов ВКЭ в культуре клеток СПЭВ
Введение к работе
Актуальность исследований
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к группе флавивирусов млекопитающих, переносимых клещами. Очаги клещевого энцефалита в разных регионах Российской Федерации значительно различаются по числу и тяжести заболеваний. Географическая неоднородность заболеваемости клещевым энцефалитом определяется числом и видом клещей-переносчиков, количеством восприимчивого населения, наличием в клещах возбудителей сопутствующих инфекций и свойствами циркулирующего вируса. Популяционный подход при изучении вируса может дать новую информацию, позволяющую объяснить зависимость вирулентности ВКЭ и активности очагов от различных характеристик биоценоза.
Ранее были получены данные, позволяющие высказать предположение, что ВКЭ может существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, включающей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в переносчиках, либо в прокормителях (Romanova et al., 2007). Адаптация к размножению в новом хозяине происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов с более высокой приспособленностью к репродукции в новых условиях. Представляет особый интерес изучение патогенеза и формирования иммунного ответа при инфекции, вызванной вариантами вируса, которые имеют селективное преимущество при репродукции в клещах и млекопитающих и отбираются при смене хозяина.
В процессе инфекции в организме млекопитающего может происходить изменение состава вирусной популяции. Это явление достаточно детально изучено при таких хронических инфекциях, как гепатит С, СПИД и т.д., однако работы, посвященные поведению вирусной популяции при острой инфекции, только появляются. Изучение начальных этапов инфекции, а также особенностей репродукции в клетках разного типа может предоставить необходимую информацию для понимания, происходит ли изменение структуры популяции
ВКЭ на ранних стадиях инфекции, как при этом ведут себя отдельные ее
компоненты, а также какую роль играют клетки разного происхождения в этом процессе.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение начальных этапов инфекции, вызванной вариантами одного штамма ВКЭ, а также установление характера селективного воздействия на вирусную популяцию при репродукции в клетках разного типа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выбрать набор вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ, отличающихся
происхождением и свойствами, определить полную нуклеотидную
последовательность геномов отобранных вирусов и оценить их вирулентность для
мышей при разных способах введения.
2. Изучить начальные этапы инфекции при периферическом заражении
мышей линии BALB/c отобранными вариантами ВКЭ.
Изучить особенности репродукции вариантов штамма ЭК-328 в фибробластах и макрофагоподобных клетках мыши, поскольку эти типы клеток поддерживают репродукцию ВКЭ в организме млекопитающего в первые часы после заражения.
Провести пассажи вариантов ВКЭ в перевиваемой культуре фибробластов L-929 и макрофагоподобных клеток мыши Р388 и описать свойства вариантов ВКЭ, имеющих селективное преимущество при репродукции в разных типах клетках.
Научная новизна работы
Впервые показано, что в процессе адаптации ВКЭ к клещам и последующей переадаптации к клеткам млекопитающих образуется набор вариантов, у которых различия в аффинности связывания с гликозаминогликанами (ГАГ) клетки, нейровирулентности и нейроинвазивности для мышей сопровождаются отличиями в уровне индукции интерферонов (interferon, IFN) и IFN-
чувствительности. Достаточно всего двух аминокислотных замен в белке оболочки Е для кардинального изменения этих свойств.
Впервые для переносимых клещами флавивирусов показано, что вирионный белок Е и неструктурные белки NS2A и NS4A отвечают за взаимодействие с системой IFN клетки.
На наборе культур разных типов клеток впервые было установлено, что доля инфекционных вирусных частиц в культуральной жидкости (ЮК) в процессе инфекции меняется и на определенном этапе практически все вирусные частицы могут быть инфекционными.
В опытах по термоинактивации вируса впервые было показано, что при физиологических условиях происходит падение титров инфекционного вируса без видимого снижения количества вирусной РНК.
Впервые показано, что клетки разного типа оказывают разное селективное воздействие на популяцию ВКЭ, при этом репродукция в первичных и перевиваемых фибробластах мыши, в отличие от макрофагоподобных клеток, приводит к отбору вариантов вируса с ГАГ-связывающим фенотипом, а характер изменения свойств вируса зависит от исходной приспособленности вируса к репродукции в данной системе.
Научно-практическая ценность
В процессе данной работы было изучено взаимодействие ВКЭ с системой IFN клетки. Выявлены вирусные белки, взаимодействующие с различными звеньями IFN-зависимых сигнальных путей.
Получена новая важная информация, необходимая для понимания поведения популяции РНК-содержащих арбовирусов при смене хозяина. Показано, что наиболее важными факторами отбора новых вариантов вируса являются особенности взаимодействия с ГАГ клетки и системой IFN.
На модели ВКЭ было показано, что компоненты одной вирусной популяции могут значительно отличаться по вирулентности для млекопитающих, чувствительности к IFN и уровню индукции IFN. При репродукции вируса в разных системах происходит изменение соотношения компонентов популяции,
что, в свою очередь, приводит к изменению характеристик популяции в целом. Эта информация должна учитываться при разработке новых лекарственных препаратов.
В экспериментах на лабораторных мышах показано, что решающее значение в развитие и исходе заболевания играют начальные этапы инфекции ВКЭ и, в первую очередь, взаимодействие вируса и системы неспецифического врожденного иммунитета.
Публикации и апробация работы
Диссертационная работа апробирована и рекомендована к защите на заседании межлабораторного Ученого совета ИПВЭ им.М.П. Чумакова РАМН 13 октября 2010 года.
По материалам диссертации опубликовано 6 статей (их них в 3 журналах, рекомендованных ВАК) и 3 тезисных сообщения. Результаты работы доложены на 4-ом Конгрессе европейского сообщества по опасным инфекциям (Лиссабон, Португалия, 2007), на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), на симпозиуме «Биоинформатика и компьютерное конструирование лекарств» в рамках конгресса «Человек и Лекарство» (Москва, 2010), на Конференции молодых ученых в ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН (Москва, 2008, 2010).
Структура и объем диссертации
Неструктурные белки флавивирусов
На основании этих наблюдений делается предположение, что такие процессы жизненного цикла флавивирусов, как репликация РНК и процессинг полипротеина, строго компартментализованы и приурочены к специфическим мембранным образованиям (Chu & Westaway, 1992).
В составе флавивирусного генома выявлен ряд последовательностей, которые, по-видимому, играют важную роль в регуляции репликации РНК. Так, в 3 -НТО имеется участок длиной около 100 нт., который формирует весьма стабильную вторичную структуру типа «шпильки» (Thurner et al., 2004), взаимодействует с белками репликативного комплекса и является сайтом инициации синтеза (-)РНК (Hanh et al., 1987). 3 НТО вариабельна по длине (380-800 нт) и нуклеотидной последовательности, однако выявлено несколько элементов с консервативной вторичной структурой в этой области (Lindenbach and Rice, 2003; Markoff, 2003). Одной из самых консервативных структур является шпилька длиной 90-120 нуклеотидов прямо на конце 3 НТО (Proutski et al., 1997). Для вируса Денге-2 было показано, что эта структура важна для вирусной репликации и несет хозяин-специфичные детерминанты (Markoff, 2003). Было показано, что вирусные белки NS3 и NS5, входящие в состав репликативного комплекса, связываются с этой структурой in vitro (Lindenbach and Rice, 2003). Консервативные элементы вторичной структуры 3 НТО различаются у вирусов, переносимых комарами и клещами (Lindenbach and Rice, 2003). У комариных вирусов сразу после шпильки идет высококонсервативная последовательность длиной 25 нт (КП1). Эта последовательность комплементарна последовательности в 5 НТО и, как полагают, эти два участка обеспечивают циклизацию флавивирусного генома. Нуклеотидные основания во второй половине КП1 способны связываться с внутренней петлей в ножке 3 шпильки, образуя псевдоузел, функции которого еще не установлены, но предполагается, что такая вторичная структура необходима для репликации и трансляции вирусного генома (Lindenbach and Rice, 2003).
Для комариных вирусов показано наличие одной или двух копий консервативных последовательностей (КП2 и ПКП2) (Lindenbach and Rice, 2003). Для некоторых вирусов в этом регионе предсказано существование гантелеобразной вторичной структуры, которая образует псевдоузел с соседними последовательностями. Были отмечены повторяющиеся элементы, консервативные среди комариных вирусов. Функциональная роль всех перечисленных структур не установлена. Вирусы, переносимые клещами, имеют уникальную организацию 3 НТО, которая включает консервативный регион на 3 -конце длиной 350 нуклеотидов и следующий за ним вариабельный регион. На 3 конце имеется шпилька, похожая на шпильку 3 -НТО комариных вирусов, хотя их первичные последовательности значительно различаются. Консервативный регион содержит консервативные элементы (Р3 и ПР), при этом ПР, по-видимому, участвует в циклизации генома. Иногда выявляют повторение консервативного региона Р3. В вариабельном регионе 3 -НТО у некоторых штаммов ВКЭ была выявлена poly(A) последовательность (Rice, 1996). Делеционный анализ показал, что консервативный регион необходим для жизнеспособности вируса, а вариабельный регион связан с вирусной репликацией ( Lindenbach and Rice, 2003).
Последовательность 5 -НТО, как и 3 -НТО, образует стабильную «шпильку» (Thurner et al., 2004), наличие которой необходимо для успешной репликации (Brinton & Dispoto, 1988; Cahour et al., 1995). Соответствующая структура имеется и в 3 НТО (-) цепи, выполняя роль сайта инициации синтеза (+)РНК (Shi et al., 1996a). Последовательность 5 НТО, длиной 89-132 нт. не является консервативной для различных флавивирусов, хотя найдены общие элементы (Lindenbach and Rice, 2003; Casati et al., 2006). С 100-го нуклеотида 5 НТО начинается консервативная последовательность, участвующая в циклизации генома (Khromykch et al., 2001a), она не является гомологичной у вирусов, переносимых комарами и клещами (Kofler et al., 2006). У вирусов, переносимых комарами, эта последовательность внутри ОРС, а у вирусов, переносимых клещами, сразу перед ОРС (Markoff, 2003). Непосредственно на 5 -конце 5 -НТО располагается шпилька, описанная для всех флавивирусов, хотя форма и ее размеры у разных представителей различаются (Thurner et al., 2004). Для вируса Денге показано, что эта шпилька определяет эффективность трансляции вирусных белков в бесклеточной системе (Cahour et al., 1995), хотя нельзя исключить ее участие и в репликации.
Репликативный комплекс кроме РНК содержит также ряд неструктурных вирусных белков: РНК-полимераза NS5, РНК-хеликаза NS3, белок NS1, а также гидрофобные белки NS2A и NS4A (Chen et al., 1997; Mackenzie et al., 1996, 1998). В состав репликативного комплекса входят и некоторые клеточные белки: eF-1 (фактор элонгации трансляции), Mov34, TIA-1, TIAR, которые взаимодействуют с определенными участками в 3 -концевом шпилечном домене вирусной РНК (Blackwell & Brinton, 1995; 1997; Shi et al., 1996b; Li et al., 2002; Ta & Vrati, 2000).
Формирование репликативного комплекса начинается до окончания трансляции вирусного полипротеина. NS3 и, возможно, NS2A взаимодействуют с определенной консервативной последовательностью в N-концевой части NS5. Эти белки имеют также сродство к вышеупомянутому шпилечному домену в 3 -НТО молекулы (+)РНК. Комплекс, присоединенный к РНК, затем фиксируется на мембране за счет взаимодействия белка NS2A с димером белка NS4A, который, в свою очередь, связан с димером белка NS1, расположенным во внутреннем пространстве ЭПР (Khromykh et al., 2000). На следующем этапе происходит циркуляризация (+)РНК, и регуляторные последовательности, находящиеся на 5 -конце РНК, оказываются доступны для взаимодействия с репликативным комплексом (Hanh et al., 1987). После того как синтезируется (-)цепь, образуется двуцепочечная репликативная форма и начинается продуктивный синтез геномных молекул РНК. Вирусные белки NS3 и NS5 обладают трифосфатазной (Wengler & Wengler, 1993), гуанил- и метилтрансферазной активностями (Egloff et al., 2002) и, по-видимому, осуществляют кэпирование 5 -конца новообразованных цепей (+)РНК.
Циркуляция вируса клещевого энцефалита поддерживается в организме клеща или позвоночного хозяина. Распространение вируса в популяции клещей может происходить горизонтально: 1) трансмиссивным путем, т.е. через кровь инфицированного прокормителя, 2) при совместном питании на теплокровном животном, 3) половым путем; а также вертикально: 1) трансовариальным и 2) трансфазовым путем. Заражение человека происходит через укус зараженного клеща или в результате употребления молока инфицированных животных.
Связь различных участков генома с вирулентностью
Инициация инфекционного заболевания во многом зависит от ряда особенностей, связанных с самим возбудителем, а именно от тех свойств, которые определяют его инфекционность. К ним относится: доза возбудителя, способ его проникновения и распространения в организме хозяина. Развитие противоинфекционных реакций складывается из трех основных этапов защиты, которые вместе представляют собой развитие иммунного ответа: естественной резистентности, раннего индукционного ответа и адаптивного, или приобретенного иммунного ответа. На месте проникновения патогена в организм хозяина включаются системы естественной резистентности, которые заключаются в тромбировании раны, реакции клеток покровных тканей, реакции лейкоцитов крови общевоспалительного назначения. В локальный участок проникновения вируса направляются моноциты/макрофаги и нейтрофилы. Макрофаги выступают в качестве одного из факторов неспецифической защиты от вирусов, осуществляя фиксацию и частичную нейтрализацию патогена на ранних этапах, тем самым обеспечивая организму возможность мобилизации противовирусной защиты. Они участвуют в индукции секреции различных цитокинов, что приводит к привлечению в зону проникновения патогена дополнительных клеток и гуморальных веществ. Альтернативный путь активации системы комплемента и поглощение вируса макрофагами представляют собой наиболее раннюю реакцию врожденного иммунитета, которая встречается в первые часы после заражения (Хаитов и Пинегин, 2000).
Если же вирус все-таки ускользает от факторов немедленной защиты, то мобилизуются клеточные и гуморальные механизмы, которые характеризуют собой ранний индукционный ответ. К механизмам клеточной защиты относятся натуральные киллеры (НК) и активированные фагоциты – макрофаги, нейтрофилы. Гуморальные факторы представляют собой белки острой фазы, систему комплемента, интерфероны и другие цитокины. Макрофаги продуцируют провоспалительные цитокины, основными из которых являются интерлейкины-1, -6, -8, -12 (ИЛ-1, -6, -8, -12), фактор некроза опухолей (ФНО-) и гранулоцит-моноцит-колониестимулирующий фактор (ГМ -КСФ). Эти цитокины обладают местным и системным эффектами. Ведущим является ФНО-, функция которого состоит в формировании очага воспаления – отека, покраснение, боли, повышения температуры, что является следствием увеличения диаметра и усиления проницаемости сосудов. Активация сосудистого эндотелия и повышенная проницаемость сосудов обеспечивает поступление IgG, комплемента и других функционально значимых белков в зону проникновения патогена. Секреция ИЛ-1 приводит к активации сосудистого эндотелия, лимфоцитов, усилению прохождения эффекторных клеток через эндотелий и локального разрушения тканей, что проявляется в повышении температуры, пирогенном эффекте и инициации продукции ИЛ-6. ИЛ-6 в свою очередь активирует лимфоциты и также приводит к повышению температуры. ИЛ-1 и ИЛ-6 стимулируют продукцию белков острой фазы. Хемотаксическим фактором для лейкоцитов является ИЛ-8, который способствует усилению прохождения эффекторных клеток через эндотелий. Миграция нейтрофилов и моноцитов в очаг воспаления опосредуется -хемокинами и -хемокинами, а также ГМ-КСМ, являющимися мощными индукторами движения фагоцитов. ИЛ-12 увеличивает продукцию антител и белков острой фазы. Таким образом, макрофаги, столкнувшись с вирусом, инициируют целую цепь событий, направленную на подавления развития инфекции.
При инфицировании клеток вирусом индуцируется продукция интерферонов. Интерфероны первого типа - интерферон- (IFN-) и интерферон- (IFN-), действуют на ранних этапах развития антивирусного ответа. Под влиянием ИФН-/, синтезируемого лейкоцитами, макрофагами, фибробластами и другими клетками организма, происходит активация цитотоксической функции НК в отношении клеток, инфицированных вирусами. Противовирусная активность IFN-/ состоит в подавлении белкового синтеза и репликации ДНК в вирусинфицированных клетках, активации цитотоксической функции НК, усилении экспрессии молекул I класса MHC. Секреция ФНО-, ИЛ-6 и ИЛ-12 индуцирует синтез -ИФН, который в свою очередь ативирует нейтрофилы, моноциты/макрофаги и новые НК, а также участвуют в дифференцировке Т-лимфоцитов. В это же время синтезируется и ИЛ-10, который играет важную роль в регуляции иммунологических реакций, ингибируя синтез провоспалительных цитокинов на стадии раннего индуцибельного ответа. Ко второму типу интерферонов относится интерферон- (IFN-), иммунный, который продуцируется эффекторными Т-клетками после индукции адаптивного иммунного ответа.
Первый этап в развитии специфического иммунного ответа связан с активацией Т-клеток в ближайшем к месту проникновения вируса лимфатическом узле. Здесь вирус захватывается специализированными антигенпрезентирующими клетками (АПК), с тем, чтобы представить фрагменты антигена на поверхности этих клеток. Макрофаги, дендритные клетки и В-лимфоциты являются профессинальными АПК. При первичном иммунном ответе основными эффекторными АПК являются дендритные клетки. Они мигрируют из покровов с антигеном в региональные лимфоидные органы, процессируют антиген, экспрессируют на поверхность комплексы MHC-I и MHC-II (главный комплекс гистосовместимости I и II классов, major histocompatibility complex class I and II, MHC-I and MHC-II) и необходимые корецепторные молекулы, с помощью которых дендритные клетки смогут вступить во взаимодействие с наивными Т-лимфоцитами в Т-зависимых зонах периферических лимфоидных органов, активировать их, что в свою очередь приведет к инициации иммунного ответа (Whitton and Oldstone, 2001).
Т-лимфоциты играют центральную роль при развитии клеточного иммунитета. Они отличаются от В-клеток и натуральных киллеров, так как несут на своей поверхности специфические рецепторы, называемые Т-клеточные рецепторы (TCR, T cell receptors), состоящие из двух цепей - и . Выделяют несколько групп Т-клеток, отличающихся по своим функциям:
Хелперные Т-лимфоциты участвуют в созревании В-клеток в плазматические клетки, а также в активации цитотоксических Т-лимфоцитов и макрофагов. Хелперные Т-клетки экспрессируют на своей поверхности белок CD4, поэтому их также называют CD4+ Т-клетками. Активация Т-хелперных лимфоцитов происходит после взаимодействия наивных Т-клеток с антигеном, представленным MHC-II на поверхности АПК. Сразу после активации они дифференцируются в один из Т-клеточных субтипов, включающих Th1, Th2, Th3, Th17 или фолликулярные Т-хелперные клетки и начинают экстрессировать различные цитокины, которые, в свою очередь, усиливают различные типы иммунного ответа (Gutcher and Becher, 2007).
Динамика появления вируса в крови, селезенке и мозге инфицированных животных на ранних стадиях инфекции при заражении вариантами ВКЭ
Для более точного понимая событий, происходящих в ранние часы после проникновения вируса в организм млекопитающего, мы исследовали поведение вирусных вариантов на начальных этапах инфекции. Для этого мы провели интраперитонеальное заражение мышей линии BALB/c исследуемыми вирусами в двух инфицирующих дозах - 1000 и 1000000 БОЕ. В разные временные интервалы (5, 10 и 28 часов) проводили сбор образцов крови, селезенки и мозга у 3-5 мышей для каждой точки и для каждого исследуемого вируса. Определение количества вирусной РНК в 10% суспензии мозга и селезенки проводили методом ПЦР с детекцией в реальном времени. Гомогенат сгустков крови, а также несколько выборочных суспензий мы исследовали на содержание инфекционного вируса методом бляшек в культуре клеток СПЭВ.
Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют о различие между исследуемыми вариантами в характере появления инфекционного вируса в крови мышей. При низкой дозе заражения (1000 БОЕ) в крови инфицированных животных, взятой через 5 часов, мы выявили инфекционный вирус только у животных, зараженных штаммом ЭК-328 и ревертантом 57. В обоих случаях титры определяемого вируса были на 1-2 порядка ниже по отношению к титрам введенного вируса. Полученные результаты свидетельствуют о быстром попадании штамма ЭК-328 и ревертанта 57 в кровь, однако в значительно меньших количествах, чем было введено. В течение последующих 5 часов происходила инактивация вируса и через 10 часов после заражения не для одного из исследуемых вариантов инфекционный вирус в крови выявить не удалось. Единичный цикл репродукции вируса клещевого энцефалита составляет более 14 часов, то есть заметный прирост титра вируса, мы можем наблюдать только после этого времени. Как и ожидалось, через 28 часов после введения вируса в крови инфицированных мышей мы обнаружили увеличение титров инфекционного вируса, однако, только для штамма ЭК-328 и для ревертанта 58. М вариант характеризовался отсутствием виремии при периферическом введении в дозе 1000 БОЕ на протяжении всего времени наблюдения.
При повышении дозы (1000000 БОЕ) заражения инфекционный вирус удалось выявить у всех животных, зараженных штаммом ЭК-328 и ревертантом 58, через 5 часов после введения вируса. При этом титры выявляемого вируса были достаточно высоки. Далее мы наблюдали инактивацию вируса с падением вирусных титров через 10 часов после и/п заражения и последующий прирост инфекционного вируса через 28 часов. При инфекции высокой дозой варианта М нам удалось выявить инфекционный вирус в крови только одной из пяти мышей через 28 часов после заражения и в значительно более низких титрах, чем для штамма ЭК-328 и ревертанта 58. Кроме того, вирус, обнаруженный при титровании сгустков крови мышей, зараженных вариантом М, характеризовался не свойственным варианту М крупнобляшечным фенотипом.
Наши результаты соответствовали ранее полученным данным, в которых при и/п введении большой дозы варианта М некоторые животные заболевали с развитием поражений ЦНС (Romanova et al., 2007). На последних стадиях болезни вирус был выявлен в крови, лимфатических узлах и мозге. Вирус, выделяемый из крови, был гетерогенен по размеру бляшек, имел мелкие бляшки и бляшки диаметром около 7 мм в соотношении 1:3. Анализ нуклеотидной последовательности гена белка Е крупнобляшечных вариантов показал, что они ревертировали к родительскому варианту ЭК-328. Также было показано, что эти варианты восстановили свойства, характерные для штамма ЭК-328. На основании этих данных авторы предположили, что именно этот вирус позволяет вызывать заболевание у мышей при заражении высокой дозой варианта М.
Полученные нами данные позволили нам выявить следующие закономерности: 1. Титры инфекционного вируса в крови мышей, инфицированных ревертантом 58, были выше на все сроки наблюдения, чем при заражении штаммом ЭК-328. 2. В крови мышей, зараженных вариантом М, нам не удалось выявить инфекционный вирус на ранних этапах инфекции в течение всего срока наблюдения. Это согласуется с ранее полученными данными (Кондратьева и др., 2005; Romanova et al., 2007) и может быть объяснено повышенной сорбцией вирионов варианта М на эритроцитах крови, что приводит к его быстрому удалению из кровяного русла. 3. При заражении мышей ревертантом 57 мы наблюдали появление вируса в крови животных только через 5 часов наблюдения, через 10 и 28 часов прироста инфекционного вируса не происходило. В опыте по сорбции на эритроцитах крови ревертант 57 не обладал повышенным связыванием с эритроцитами и поэтому остается не выясненным с чем может быть связано отсутствие виремии у ревертанта 57 (Романова, 2007). Для оценки попадания вируса в ЦНС и селезенку зараженных животных мы определяли количество копий вирусной РНК в 10% суспензии мозга и селезенки методом ПЦР с детекцией в реальном времени (Табл. 5). В отдельном опыте мы установили чувствительность метода по выявлению вирусной РНК в гомогенатах мозга и селезенки. Полученное значение колебалось от опыта к опыту и в среднем составляло 1000 и 3000 копий/мл для 10% суспензии мозга и селезенки, соответственно. После инфицирования низкой дозой всех исследуемых вирусных вариантов нам не удалось обнаружить вирусную РНК на начальных этапах инфекции в гомогенатах селезенки, вероятно, это было связано с ограниченной чувствительностью нашего метода. Однако после введения высокой дозы заражения вирусная РНК была выявлена на все сроки наблюдения для всех вариантов штамма ЭК-328 (Табл. 5). Наибольший уровень вирусной РНК в селезенках зараженных животных, взятых через 5 часов после введения вируса, был характерен для ревертанта 58 и составил 5,3 lg копий РНК/мл. Далее через 10 и 28 часов мы выявили незначительное увеличение титров вирусной РНК в селезенках мышей, инфицированных ревертантом 58, штаммом ЭК-328 и вариантом М. Вариант М характеризовался более низким титром вирусной РНК в селезенках, исследованных на 5 часов, значение которого составило 4,4 lg копий РНК/мл.
Изучение цикла репродукции вариантов ВКЭ в культуре клеток СПЭВ
Следующий этап данной работы включал изучение поведения популяции вариантов вируса клещевого энцефалита при репродукции в клетках разных типов. Сначала мы подробно изучили репродукцию вирусов в культуре клеток СПЭВ. Ранее при заражении с множественностью около 1 БОЕ/клетку было показано, что у варианта М, по сравнению с родительским штаммом ЭК-328 наблюдается замедленное появление вируса в КЖ и количество свободного вируса на всех этапах репродукции превышает количество вируса внутри клеток (Romanova et al., 2007). Вирионы варианта М обладают повышенной аффинностью связывания с ГАГ клетки. Это позволило нам предположить, что наблюдаемые нами особенности этого вируса связаны с меньшим количеством вируса, проникающим в клетки, т.е. при равных количествах вируса в инокуляте в случае варианта М множественность заражения ниже, чем у штамма ЭК-328. Для проверки этого предположения мы изучили циклы репродукции штамма ЭК-328, варианта М и ревертанта 58 при заражении клеток СПЭВ с разной множественностью заражения. Репродукцию вируса оценивали по накоплению инфекционного вируса в КЖ и внутри клеток методом бляшек и накоплению копий вирусной РНК методом ПЦР с детекцией в реальном времени.
При инфицировании клеток СПЭВ штаммом ЭК-328 использовали множественность заражения 10, 1, 0,2 и 0,0002 БОЕ/клетку. Как оказалось, множественность заражения практически не влияла на уровень накопления штамма ЭК-328 в культуральной жидкости, а соотношение свободного и связанного с клетками вируса зависело от количества вируса в инокуляте. При очень низкой множественности 0,0002 БОЕ/клетку количества инфекционного вируса в КЖ и в клетках практически совпадали. При оценке динамики накопления копий вирусной РНК внутри клеток было видно, что синтез РНК при любой множественности заражения начинается с первых часов инфекции. В культуральной жидкости прирост количества копий вирусной РНК начинается после 14 часов при низкой множественности заражения и практически сразу при высокой множественности.
Близкую к вышеописанной картину наблюдали при заражении клеток СПЭВ ревертантом 58 с низкой множественностью 0,06 БОЕ/клетку и очень низкой множественностью 0,0006 БОЕ/клетку, однако в этом случае на всех этапах инфекции количество инфекционного вируса в КЖ превышало количество вируса внутри клеток. Кривые накопления вирусной РНК внутри клеток и в КЖ для ревертанта 58 были похожи на кривые для штамма ЭК-328.
При изучении варианта М мы наблюдали некоторые отличия. Для исследования была выбрана множественность заражения 10, 1 и 0,002 БОЕ/клетку. При всех использованных условиях количество инфекционного вируса внутри клеток превышало количество связанного с клетками вируса, однако при высокой множественности заражения количество свободного и связанного вируса практически совпадало. Внутри клеток накопление вирусной РНК варианта М, как и в случае штамма ЭК-328 и ревертанта 58, начинается практически сразу после заражения и к концу инфекции приближается к 11 lg копий. При этих условиях динамика накопления РНК в клетках и в КЖ варианта М совпадала с таковой для штамма ЭК-328. В то же время при низкой множественности заражения 0,002 БОЕ/клетку эта кривая отличалась тем, что после первого цикла репродукции (24 часа) не отмечалось, как у других вирусов, увеличения количества вирусной РНК в КЖ. Это можно объяснить тем, что М вариант обладает ГАГ-связывающим фенотипом. Повышенная сорбция вирионов на ГАГ клетки может приводить к тому, что большая часть вирионов у этого вируса, по сравнению со штаммом ЭК-328 и ревертантом 58, связана с клетками, причем это может не означать, что большая часть вирионов проникает в клетку и вызывает продуктивную инфекцию. Вирионы варианта М, выходящие из клетки после первого цикла репродукции, из-за высокой аффинности связывания с ГАГ сразу же сорбируются на близлежащих клетках.
Таким образом, мы получили подтверждение нашему предположению, что соотношение свободного и связанного с клетками вируса зависит от множественности заражения. Важной характеристикой инфекции является оценка количества инфекционных частиц к общему числу вирионов. Для оценки выбранных нами вирусов с этой точки зрения мы посмотрели динамику изменения отношения БОЕ к количеству копий вирусной РНК в процессе инфекции с разной множественностью заражения. При репродукции штамма ЭК-328 и ревертанта 58 в начале инфекции до выхода свежесинтезированных вирионов соотношение инфекционных частиц и копий РНК колебалось от 1:30 до 1:300. К 14 часам наблюдалось резкое увеличение доли инфекционных вирионов, после чего отмечали постепенное накопление неинфекционной вирусной РНК в КЖ. Максимальная доля инфекционного вируса в популяции и время наступления этого пика связано с множественностью заражения. Чем ниже множественность, тем больше доля инфекционного вируса в популяции. Резкое увеличение доли инфекционного вируса на 14 часов связано со снижением количество копий РНК в КЖ. По-видимому, к этому времени вирус, внесенный в инокуляте, либо проникает в клетки, либо разрушается, а вновь синтезированный вирус практически не содержит дефектных частиц. Накопление неинфекционной РНК в КЖ инфицированных клеток в процессе инфекции может происходить по разным причинам, в том числе в связи с выходом внутриклеточного материала в результате разрушения клеток из-за ЦПД вируса, нарушения процессов транскрипции вирусной РНК на поздних этапах инфекции из-за высокой концентрации вируса внутри клеток, выхода частиц, неинфекционных из-за неправильной сборки вирионов, для высвобождения которых требуется длительное время, и т.п.
Таким образом, для данных вирусов показано, что доля инфекционных частиц в популяции вируса значительно изменяется в процессе инфекции и при низкой множественности заражения на определенном этапе инфекции все вирусные частицы могут быть инфекционны.
При высокой множественности заражения данные для варианта М практически совпали с таковыми для штамма ЭК-328. Однако, при низкой множественности заражения (0,002 БОК/клетку) вместо увеличения доли инфекционных частиц в КЖ наблюдалось ее уменьшение. Это связано с тем, что у данного вируса не наблюдается снижения количества копий вирусной РНК в КЖ на начальных этапах инфекции, как это происходит у вышеописанных вирусов. Это может быть связано с двумя факторами:
![Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс]](/i/i/4440/193595.png "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] Кондратьева Ярослава Юрьевна")