Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Вирус гриппа 10
1.1.1 Структура вируса гриппа А и В 11
1.1.2 Генетическая изменчивость вируса гриппа. Феномен реассортации 13
1.1.3 Методы оценки состава генома вируса гриппа 16
1.2. Профилактика гриппа 20
1.2.1. Химиопрофилактика 20
1.2.2. Инактивированные гриппозные вакцины 21
1.2.3. Живые гриппозные вакцины 22
1.2.4. Достоинства и недостатки живых и инактивированных гриппозных вакцин
1.2.5. Другие виды вакцин 26
1.3. Фенотипические свойства вируса гриппа 31
1.3.1. Способность вируса гриппа к размножению за верхними и нижними пределами температурного оптимума
1.3.2. Чувствительность вируса гриппа к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови
1.4. Заключение к обзору литературы 35
Глава 2. Материалы и методы 3 6
Глава 3. Результаты исследований 41
3.1. Разработка метода микс-пцр для анализа состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины
3.1.1. Подбор программ и праймеров для скрининга реассортантных штаммов вируса гриппа типа А и В
3.1.2. Праймеры для идентификации генов, принадлежащих сезонным штаммам вируса гриппа A (H1N1) и A (H3N2)
3.1.3. Праймеры для идентификации генов, принадлежащих сезонным штаммам вируса гриппа В
3.1.4. Праймеры для идентификации генов, принадлежащих пандемическим или потенциально пандемическим штаммам вируса гриппа A (H1N1) и (H5N1)
3.1.5. Описание метода микс-ПЦР 49
3.1. 6. Заключение 53
3.2. Основные биологические свойства современных вирусов гриппа, влияющие на подготовку вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины
3.2.1. Анализ репродукции современных вирусов гриппа при различных температурах инкубации
3.2.2. Анализ чувствительности вирусов гриппа к неспецифическим ингибиторам нормальной сыворотки крови
3.2.3. Заключение 59
3.3. Сложности подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины на основе современных сезонных и потенциально пандемических вирусов гриппа
3.3.1. Сравнительный анализ наследования реассортантными штаммами генов от донора аттенуации или от вируса гриппа «дикого» типа разных лет выделения
3.3.2. Характер наследования реассортантами нейраминидазы от «диких» вирусов гриппа, обладающих са- или -фенотипом
3.3.3. Характер наследования реассортантами нейраминидазы от «диких» вирусов гриппа, обладающих ингибиторочувствительным фенотипом
3.3.4. Роль нейраминидазы в формировании ингибиторочувствительного фенотипа
3.3.5. Заключение 70
3.4. Особенности использования H5n1-Pr8-rg реассортантов в качестве источника поверхностных антигенов для подготовки потенциально пандемических штаммов живой гриппозной вакцины
3.4.1. Особенности использования H5N1-PR8-RG реассортантов в качестве «диких» вирусов для скрещивания с донорами аттенуации
3.4.2. Особенности использования PR8-RG реассортантов для сезонной инактивированной вакцины в качестве «диких» вирусов для скрещивания с донорами аттенуации
3.4.3. Особенности использования низкопатогенных вирусов гриппа птиц A(H5N2) в качестве «диких» вирусов для скрещивания с донорами аттенуации
3.4.4. Особенности использования низкопатогенных вирусов гриппа птиц A(H5N2) в качестве «диких» вирусов для скрещивания с вакцинным штаммом против гриппа A(HlNl)pdm
3.4.5. Заключение 83
Глава 4. Обсуждение результатов 85
Раздел 3. Заключение 95
Выводы 100
Список литературы 101
Список иллюстративного материала
- Методы оценки состава генома вируса гриппа
- Способность вируса гриппа к размножению за верхними и нижними пределами температурного оптимума
- Праймеры для идентификации генов, принадлежащих сезонным штаммам вируса гриппа A (H1N1) и A (H3N2)
- Особенности использования низкопатогенных вирусов гриппа птиц A(H5N2) в качестве «диких» вирусов для скрещивания с донорами аттенуации
Методы оценки состава генома вируса гриппа
Одним из важных признаков вируса гриппа, как вируса, обладающего сегментированным геномом, является его способность к реассортации. Реассортация в природе может привести к шифтовым изменениям антигенной структуры вируса гриппа с появлением нового антигенного варианта вируса вплоть до пандемического. Так в 2009 г. появился «тройной» реассортантный штамм A/California/07/09 (HlNl)pdm, вызвавший первую пандемию 21-го века, который считается «тройным», хотя в процессе реассортации унаследовал гены от четырех различных вирусов гриппа: гены РВ2 и РА - от североамериканской птичьего вируса A(H1N1), ген РВ1 - от человеческого вируса подтипа A(H3N2), гены НА, NP и NS - от классического свиного вируса А(Н1Ш), а гены NA и М - от Евразийской линии свиного вируса A(H1N1) [142, 143].
Социркуляция генетически различных вирусов гриппа является благоприятным фактором для их реассортации. При этом явление реассортации отмечено как среди вирусов гриппа человеческого происхождения, так и среди вирусов разнообразных групп млекопитающих и птиц. Одним из примеров может служить социркуляция в человеческой популяции вирусов гриппа А типов A(H1N1) и A(H3N2), которая привела к появлению реассортантных штаммов A(H1N2), унаследовавших гемагглютинин от вируса подтипа A/H1N1, а нейраминидазу - от A(H3N2). Первый случай заражения человека реассортантными штаммами A(H1N2), документально подтвержденный, датируется 1983 годом [146]. С 1988 по 1989 было выделено 19 вирусов подтипа A(H1N2) в 6 городах Китая [90, 123], но вирусы данного подтипа не распространились за пределы страны.
В январе 2002 года реассортантный штамм A/Wisconsin/12/2001 (H1N2) был типирован в Атланте (CDC). Данный вирус выделен в начале декабря 2001 от 6-ти месячного ребенка. Впоследствии, за эпидемический сезон 2001-2002 года из 890 выделенных в 41 стране вирусов подтипа А/Н1 51 вирус из Канады, Сингапура, Египта, Малайзии, Индии, Омана, Румынии, Соединного Королевства и США принадлежал подтипу A(H1N2) [212]. ВОЗ и Министерство здравоохранения Великобритании также сообщали о появлении вируса A(H1N2) в нескольких странах Европы и Азии [87, 205, 207].
В 2013 году в Китае была зарегистрирована вспышка, вызванная вирусом птичьего гриппа A(H7N9) у людей [80, 122], который в процессе реассортации унаследовал НА от вируса гриппа птиц подтипа A(H7N3), NA - от птичьего вируса гриппа A(H7N9), а внутренние гены - от вирусов гриппа птиц подтипа A(H9N2) [210].
Реассортантные вирусы появляются не только среди вирусов гриппа А, но и В. Так, в 1990-х в Хьюстоне, Мемфисе и Нэшвилле циркулировали реассортанты, унаследовавшие НА от вируса гриппа линии B/Yamagata/16/88, a NA - от вируса линии B/Victoria/2/87 [135], а в эпидемический сезон 2001-2002 в США и Гонконге было зафиксировано появление рессортантов, наследовавших НА от вируса гриппа линии B/Victoria/2/87, a NA от линии B/Yamagata/16/88 [177, 213].
У вирусов гриппа млекопитающих также наблюдается феномен реассортации. Наиболее четко этот феномен можно проследить на примере свиной популяции, поскольку свиньи являются одним из основных природных резервуаров вируса гриппа А. Так, например, с началом циркуляции в 2009 году пандемического вируса A(HlNl)pdm стали появляться сведения о реассортации в свиньях эндемических свиных вирусов с A(HlNl)pdm. Первый подобный реассортант был выделен в Гонконге в 2009 году. Он содержал NA от A(HlNl)pdm, НА - от евразийской линии свиного вируса, а внутренние гены - от тройного реассортанта A(H1N2), циркулировавшего в популяции свиней с 2005 года [193]. Позже в Германии был выделен реассортантный штамм A(H1N1), содержащий НА и внутренние гены от вируса A(HlNl)pdm, NA - от эндемического свиного вируса [184]. Затем появление такого рода реассортантов было зафиксировано в Таиланде [109]. Сравнительно недавно от свиней в Италии и Великобритании были изолированы два реассортанта A(H1N2), один из которых содержал шесть внутренних генов от пандемического A(HlNl)pdm, у другого НА и внутренние гены были унаследованы от A(HlNl)pdm, а остальные гены принадлежали эндемическому свиному вирусу гриппа [99, 136].
Также с зимы 2010 по весну 2011 в США была зафиксирована вспышка гриппа среди свиней, вызванная семью реассортантными штаммами A(H3N2). Анализ генома этих штаммов показал, что шесть из них содержали NP, М и NS от A(HlNl)pdm, а один изолят содержал РВ2, PA, NP, М и NS от A(HlNl)pdm, остальные же гены принадлежали эндемическому вирусу A(H3N2) [126].
Еще одним примером реассортации у млекопитающих может служить появление нового реассортантного вируса А(НЗШ) в 2010 году у собак. Данный рессортант появился в результате социркуляции штамма A/canine/Korea/GCVPO 1/2007 (H3N2) и A(HlNl)pdm, у которого НА принадлежал вирусу A(H3N2), а остальные гены были от пандемического A(HlNl)pdm [183].
Таким образом, приведенные выше примеры убедительно доказывают, что реассортация вирусов гриппа в природе происходит непрерывно.
Использование феномена реассортации в практической медицине. Реассортантные гриппозные вакцины. В лабораторных условиях способность вирусов гриппа реассортировать используется при подготовке вакцинных штаммов для инактивированной и живой гриппозной вакцин. В основе принципа подготовки реассортантных вакцинных штаммов лежит скрещивание актуального «дикого» вируса с так называемым донором (вирусом устаревшей ангигенной структуры, передающим вакцинному штамму комплекс необходимых свойств) с последующим отбором реассортантов, унаследовавших от «дикого» родителя гены, кодирующие НА и NA, а внутренние гены - от донора. В качестве донора внутренних генов для инактивированных вакцин используют вирус A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), а для живой гриппозной вакцины в России используют два донора аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Лен/17) и В/СССР/60/69 (В/60). В США для производства ЖГВ используют доноры A/Ann Arbor/6/бОш (H2N2) и В/Апп Arbor/1/ббш.
Сегментированная природа генома вируса гриппа позволяет различным его штаммам в процессе одномоментного заражения чувствительной клетки обмениваться сегментами геномной РНК, т.е. реассортировать. Данное свойство вируса гриппа лежит в основе метода подготовки современных штаммов живой реассортантной гриппозной вакцины. Эти штаммы получают путем скрещивания актуального эпидемического вируса гриппа, рекомендованного ВОЗ для включения в состав гриппозных вакцин на предстоящий эпидемический сезон, с так называемыми донорами аттенуации. Для того, чтобы реассортантный вакцинный штамм обладал такой же степенью безвредности для человека, то есть аттенуации, как и донор, он должен унаследовать от него шесть внутренних генов, а гемагглютинин и нейраминидазу, ответственные за антигенную специфичность вируса - от эпидемического родителя (формула генома 6:2).
При скрещивании двух штаммов вируса гриппа теоретически возможно формирование 256 (2 ) различных комбинаций генов. Использование двух селектирующих факторов (антисыворотки к донору аттенуации и пониженной температуры инкубации) приводит к существенному снижению нежелательных комбинаций (теоретически - в два раза), однако их число продолжает оставаться достаточно большим. В связи с этим возникает необходимость быстрого определения состава генома полученных реассортантов.
Способность вируса гриппа к размножению за верхними и нижними пределами температурного оптимума
Активность репродукции вирусов гриппа А и В при разных температурах оценивали по результатам титрования в РКЭ, инкубированных при пермиссивной (32С), повышенной (для вирусов гриппа В 36С, 37С и 38С, а для вирусов гриппа А 38С, 39С и 40С, -фенотип) и пониженной (25С, ш-фенотип) температуре инкубации и выражали в RCT (reproductive capacity at different temperatures). RCT25 = (lg ЭИД50/0,2 мл при 32C -lg ЭИД50/0,2 мл при 25С); RCT36 (з?, зв) = (lg ЭИД50/0,2 мл при 32С - lg ЭИД50/0,2 мл при 36(37, 38)С); RCT38(39,40) = (lg ЭИД50/0,2 мл при 32С - lg ЭИД50/0,2 мл при 38(39, 40)С). РКЭ, зараженные вирусом гриппа А, инкубировали в течение 48 часов при 32С и 38(39, 40)С, а вирусы гриппа В в течение 72 часов при 32С и 36 (37, 38)С; при 25С - как А, так и В вирусы - в течение пяти суток. Вирусы считали температурочувствительными, т.е. имеющими to-фенотип, если RCT36-40 составляло не менее 5,0 lg ЭИД5о/0,2 мл, и температурорезистентными, т.е. обладающими иои-ґз-фенотипом, если этот показатель не превышал 3,0 lg ЭИД5о/0,2 мл. Г -фенотип вирусов, RCT36-40 которых находилась в пределах 3,0-5,0 lg ЭИД5о/0,2 мл, оценивали, как «±». Холодоадаптированными считают штаммы, для которых RCT25 не превышает 3,5 lg ЭИД50 /0,2мл (ш-фенотип) (табл.3) [21].
Титры используемых в данной работе сывороток определяли согласно стандартной методике реакции торможения гемагглютинации (РТГА), регламентированной для испытания антигенной активности гриппозных вакцин [34] с использованием 4 агглютинирующих единиц антигена и 1,0% взвеси эритроцитов кур или человека 0(1) Rh группы. Для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации сыворотки обрабатывали препаратом RDE (receptor-destroying enzyme производства Denka-Seiken, Tokyo, Japan) согласно протоколу производителя.
Оценку чувствительности вирусов гриппа к неспецифическим ингибиторам нормальной сыворотки крови проводили в стандартной реакции торможения гемагглютинации с 1%-ми эритроцитами человека группы 0(1) Rh , используя в качестве источников ингибиторов нормальную сыворотку морской свинки, полученную из крови морских свинок (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»), и нормальную сыворотку лошади («БиолоТ», Санкт-Петербург). Сыворотки разводили буферно-солевым раствором 1:10 и прогревали при 80С в течение 10 минут. Вирусы считали ингибитороустойчивыми (ИУ) при титре сывороток в РТГА 1:40 и ингибиторочувствительными (ИЧ) при титре 1:80.
В работе использовали белых беспородных крыс, половозрелых самцов с массой тела 200-300 граммов, и морских свинок, самок-альбиносов с массой тела 300-350 граммов, полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» [41] и была одобрена Локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ». Животных содержали в стандартных крысиных клетках при температуре 22С и относительной влажности 22-25%. Регистрацию климатических условий содержания животных проводили ежедневно при помощи беспроводной погодной станции Oregon Scientific, мoдeльBAR388HG.
Получение нормальных (неиммунных) сывороток морских свинок Забор крови у морских свинок осуществляли путем прямой пункции сердца. У каждого животного забирали 5-6 мл крови. Получение гипериммунных крысиных сывороток Для получения иммунных сывороток к используемых в работе вирусам гриппа А и В крыс иммунизировали внутрибрюшинно по 5 мл вируссодержащего материала в течение 2-х недель (5 иммунизации), 2-ая иммунизация так же сопровождалась подкожным введением вируса с адъювантом в холку по 1 мл. Через неделю после последней иммунизации производился забор крови из подключичной вены для получения гипериммунной сыворотки.
Получение реассортантов осуществляли в РКЭ по стандартной методике [2, 197], которая включала в себя 6 селективных пассажей, из них 3 при пониженной до 25-26С температуре инкубации. Получение и отбор реассортантов проводились в присутствии антисыворотки к донору аттенуации, обработанной RDE. Клонирование предельными разведениями выполнялось в ходе 3-4 заключительных пассажей, и реассортанты, унаследовавшие антигенные свойства эпидемического родителя, использовали для определения состава их генома, которое проводили по разработанному нами методу микс-ПЦР, подробно описанному в главе 3.
В качестве варианта метода классической реассортации использован дополнительный этап, предварительная инактивация «дикого» вируса ультрафиолетовым облучением (УФО) под бактерицидной лампой GE 15 Вт на расстоянии 20 см, снижая инфекционный титр вируса до 1-2 lg ЭИД5о/0,2 мл [85, 173]. Остаточный инфекционный титр определяли путем титрования в развивающихся куриных эмбрионах.
Выделение РНК из вируссодержащей аллантоисной жидкости осуществляли с помощью набора QIAamp Viral RNA Minikit в соответствии с протоколом производителя (Qiagen GmbH, Германия).
Синтез кДНК осуществляли с помощью Quantitect Reverse Transcription Kit в соответствии с протоколом производителя (Qiagen GmbH, Германия). Использовали универсальные праймеры, позволяющие в одной реакции синтезировать кДНК для определенного фрагмента генома всех вирусов гриппа. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Анализ состав генома реассортантных вирусов проводили по разработанному нами методу микс-ПЦР, подробно описанному в разделе 3.1. Секвенирование проводили по методу Сэнгера [176].
Обратную транскрипцию с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) фрагментов генома вирусов гриппа осуществляли с помощью OneStep PT-PCR Kit (Qiagen GmbH, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Реакцию секвенирования осуществляли с использованием набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя в амплификаторе Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler. Определение нуклеотидной последовательности заданных участков ДНК осуществлялось с использованием автоматического капиллярного ДНК-секвенатора 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя.
Сравнение аминокислотных последовательностей изучаемых вирусов гриппа А и В проводилось с использованием программного пакета «Lasergene 7.1» (DNAstar). Статистическая обработка данных Статистическую обработку полученных результатов проводили стандартными методами с помощью ґ-критерия Стьюдента и критерия % . Обработку данных производили с использованием программ «MS Office Excel», «Statistica 6.0» и «SPSS». Величина критического уровня значимости была принята р 0,005.
Праймеры для идентификации генов, принадлежащих сезонным штаммам вируса гриппа A (H1N1) и A (H3N2)
В связи с высокой степенью антигенной изменчивости циркулирующих штаммов вируса гриппа состав гриппозных вакцин обновляется ежегодно [208]. Поскольку время, отводимое на получение и характеристику вакцинных штаммов на новый эпидемический сезон, ограничено, эффективность подготовки реассортантов во многом определяется наличием адекватного экспресс-метода оценки состава их генома. Конечным этапом отбора вакцинного штамма современной ЖГВ является полное секвенирование его генома, но на промежуточных этапах, когда нужно быстро проанализировать значительное число реассортантов, необходимо иметь в наличии доступный, быстрый и недорогой метод первичного скрининга.
Для определения принадлежности генов реассортантов-кандидатов в вакцинные штаммы существуют разные методы, такие как электрофорез вирусных РНК в полиакриламидном геле [148, 149, 153, 182], метод мультиплексного ПЦР-анализа [92, 97, 120], рестрикционный анализ [55, 66, 111, 150, 174, 194]. Однако, все эти методы имеют те или иные недостатки, в частности, трудоемкость и часто не позволяют гарантированно судить о чистоте исследуемого препарата.
Целью настоящего раздела работы явилась разработка варианта ПЦР-метода, позволяющего в кратчайшие сроки оценить состав генома реассортантных вирусов, подготовленных на основе доноров аттенуации и любых циркулирующих штаммов вируса гриппа типа А и В.
Материалы, представленные в разделе З.1., опубликованы в соавторстве в работе Киселева И.В., Voeten J.T.M., Teley L.C.P., Ларионова Н.В., Дубровина И.А., Бердыгулова Ж.А., Баженова Е.А., van den Bosch Н., Heldens J.G.M., Руденко Л.Г. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. №4. С.29-36.
Подбор программ и праймеров для скрининга реассортантных штаммов вируса гриппа типа А и В ПНР-программы и вирус-специфические праймеры разрабатывали таким образом, чтобы с конкретной парой праймеров можно было получить ПНР-продукт только для гена «дикого» вируса (праймеры, специфичные для «дикого» вируса), либо для донора аттенуации (праймеры, специфичные для донора аттенуации). Более того, праймеры конструировались таким образом, чтобы ПЦР-продукты соответствующих генов родительских вирусов отличались по размеру. Двенадцать ПЦР-программ, использованных нами для генотипирования реассортантных вирусов для отбора 6:2 вакцинных штаммов, представлены в табл. 4. Выравнивание нуклеотидных последовательностей эпидемических вирусов гриппа типа А и В с последовательностями соответствующих доноров аттенуации проводили с помощью программы «Clone Manager 9». Нуклеотидные последовательности эпидемических («диких») вирусов гриппа были получены из Баз данных (http: //www. flu. lanl. go у и http: //www .ncbi .nlm .nih. gov/genome s/FLU/Database/select. cgi).
Амплификацию проводили в ДНК-амплификаторе Eppendorf MasterCycler gradient. Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 1,7% агарозном геле, окрашенном этидиумом бромидом (0,5 мкг/мл). Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе ЕСХ (Vilber Lourmat) при длине волны УФ 330 нм. Необходимые реагенты получали в компании «СибЭнзим» (Новосибирск).
Для каждого фрагмента генома сезонных штаммов вируса гриппа сероподтипа А (H1N1) и A (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) были подобраны пары праймеров, специфичных соответственно только для донора аттенуации или только для вируса «дикого» типа (табл. 5 и 6). Кроме того, амплифицируемые фрагменты отличаются между собой по размеру. Таким образом, результаты, регистрируемые в электрофорезе ПЦР-продуктов, позволяют четко установить принадлежность исследуемого гена и оценить степень чистоты вакцинного препарата.
В качестве примера на рис. 1 представлены результаты изучения состава генома реассортантного вакцинного штамма, полученного при скрещивании донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с эпидемическим вирусом A/Brisbane/10/2007 (H3N2), вошедшего в состав живой гриппозной вакцины в эпидемический сезон 2009-2010 гг. Сравнение соответствующих ПЦР-продуктов показало, что гены, кодирующие НА и NA анализируемого реассортанта, принадлежат «дикому» родительскому вирусу (рис. 1 -г и 1 -е), а внутренние гены РВ2 (рис. 1 -а), РВ1 (рис. 1 -б), РА (рис. 1 -в), NP (рис. 1 -д), М (рис. 1 -ж) и NS (рис. 1 -з) унаследованы от донора аттенуации. Таблица 4. Программы, используемые для ПЦР-анализа состава генома реассортантов, полученных при скрещивании доноров аттенуации и «диких» вирусов
Были определены участки нуклеотидных последовательностей генов современных штаммов вирусов гриппа В, отличающиеся от аналогичных участков донора аттенуации В/СССР/60/69. Это позволило, по аналогии с вирусами гриппа типа А, сконструировать набор пар праймеров, позволяющих определить принадлежность изучаемого гена реассортантного вируса донору или современному «дикому» вирусу (табл. 7).
Праймеры для идентификации генов, принадлежащих пандемическим или потенциально пандемическим штаммам вируса гриппа A (H1N1) и A(H5N1) В начале 2009 г. весь мир охватила весть о начале новой пандемии - первой пандемии XXI в., вызванной вирусом гриппа A/California/07/09 (HlNl)pdm. Поскольку данный штамм относится в сероподтипу A(H1N1), но сильно отличается от представителей данного сероподтипа, циркулировавших ранее, при подготовке пандемической вакцины возникла острая необходимость конструирования новых праймеров (табл. 8).
Сегодня потенциальную угрозу представляют не только продолжающие циркулировать штаммы A(HlNl)pdm калифорнийского («свиного») гриппа, но и несущие пандемический потенциал высоко патогенные вирусы гриппа птиц A(H5N1). При подготовке резервных вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины сероподтипа A(H5N1) в качестве источника поверхностных антигенов НА и NA были использованы штаммы для инактивированной вакцины, подготовленные на основе вирусов гриппа птиц A(H5N1) с помощью методов обратной генетики - так называемые H5N1-PR8 реассортанты. К ним также были подобраны специфические праймеры, позволяющие дифференцировать внутренние гены вируса A/PR8/8/34 (H1N1) от внутренних генов донора аттенуации, а НА и NA птичьего происхождения - от НА и NA донорского штамма (табл. 9).
Особенности использования низкопатогенных вирусов гриппа птиц A(H5N2) в качестве «диких» вирусов для скрещивания с донорами аттенуации
На сегодняшний день наряду с уже циркулирующим калифорнийским штаммом вируса гриппа A(HlNl)pdm потенциальную угрозу представляют высокопатогенные вирусы гриппа птиц A(H5N1), имеющие пандемический потенциал. Поскольку данные вирусы высокопатогенны, то проведение вирусологической работы осложняется необходимостью соблюдения особых условий безопасности. Поэтому при подготовке резервных потенциально пандемических вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины сероподтипа A(H5N1) в качестве источника поверхностных антигенов НА и NA нами были использованы не сами высокопатогенные вирусы гриппа птиц A(H5N1), а реассортантные штаммы для инактивированной гриппозной вакцины, подготовленные на их основе с помощью методов обратной генетики (организации-производители штаммов - NIBSC, Великобритания и CDC, США) - так называемые H5N1-PR8-RG реассортанты.
Материалы представленные в разделе 3.4. опубликованы в соавторстве в работах: Kiseleva I., Larionova N., Bazhenova E., Dubrovina I., Rudenko L. Study of transmissibility of wild type and cold-adapted influenza viruses in guinea pigs. Influenza and other respiratory viruses (ISIRV). - 2011. Vol.5. Suppl.l. P. 304-307. Larionova N., Kiseleva I., Dubrovina I., Bazhenova E., Rudenko L. Peculiarities of reassortment of cold-adapted influenza A master donor virus with viruses possessed avian origin HA and NA H5N1. Influenza and other respiratory viruses (ISIRV). - 2011. Vol.5. Suppl. 1. P.346-349. Дубровина И.А., Баженова E.A., Киселева И.В., Бердыгулова Ж.А., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. Живая грипозная вакцина для детей и взрослых: трансмисивность в экспериментах in vivo. Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2011. №6. С.14-18. Kiseleva I., Dubrovina I., Bazhenova E., Fedorova E., Larionova N., Rudenko L. Possible outcomes of reassortment in vivo between wild type and live attenuated influenza vaccine strains. Vaccine. -2012. Vol. 30. № 51. P.7395-7399. Киселева И.В., Баженова E.A., Ларионова H.B., Федорова Е.А., Дубровина И.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины. Вопросы вирусологии. - 2013. №5. С.26-31. Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Федорова Е.А., Дубровина И.А., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Проблемы подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины на основе потенциально пандемических вирусов гриппа. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2012. №6. С. 16-20. Дубровина И.А., Баженова Е.А., Федорова Е.А., Иванова Е. В., Ларионова Н.В., Киселева И.В. Изучение возможности реассортации эпидемических и вакцинных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo. Медицинский академический журнал. - 2012. №4. Т. 12. С.45-47 и др.
На первом этапе подготовки резервных вакцинных штаммов на основе H5N1-PR8-RG реассортантов была произведена попытка получения реассортантов между NffiRG-23 и донором аттенуации с использованием метода классической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах нативных родительских вирусов, взятых в соотношении 1:1 и 1:10. В результате клонирования получили 20 клонов, каждый из которых был идентичен вирусу NffiRG-23, т.е. при классическом скрещивании вирус NffiRG-23 в реассортацию с донором аттенуации не вступал (табл. 25).
Известно, что эффективность процесса реассортации можно повысить путем инактивации «дикого» родителя [85, 125, 173]. Поэтому на следующем этапе нашей работы мы использовали предварительную инактивацию A(H5N1) вирусов ультрафиолетовым облучением (УФО) под GE 15 Вт бактерицидной лампой на расстоянии 20 см. Инфекционный титр вируса снижали на 6 lg ЭИД,5о/0,2 мл. Были использованы три H5N1-PR8-RG реассортанта: NffiRG-23, INDO/05 и VN1203. Такая модификация также не привела к формированию 6:2 или 5:3 реассортантов. Тем не менее, реассортация наступала. Так, при скрещивании вируса VN1203 (H5N1) с донором аттенуации было получено 42 клона, унаследовавших НА А/Н5 (табл. 24), 28 из которых одновременно приобрели NA и РВ2 от донора аттенуации, а 14 унаследовали эти гены от вируса VN1203 (H5N1) (табл. 25). При этом 23 клона имели формулу генома 7:1.
Такая же картина наблюдалась и при скрещивании донора аттенуации с двумя другими предварительно инактивированными УФО вирусами - INDO/05 (H5N1) и NffiRG-23 (H5N1). В результате скрещивания NffiRG-23 (H5N1) с донором аттенуации было получено 17 реассортантов, унаследовавших НА от вируса NffiRG-23 (H5N1), a NA и РВ2 гены - от донора аттенуации (табл. 24). Из них 14 приобрели от донора все гены, за исключением НА, то есть обладали формулой генома 7:1 (табл. 25). При скрещивании вируса INDO/05 (H5N1) с донором аттенуации было получено 11 реассортантов (табл. 24), все они обладали формулой генома 7:1 (табл. 25).
Таким образом, из 70 реассортантов, полученных при скрещивании донора аттенуации с инактивированными H5N1-PR8-RG вирусами, 48 (68,6%) унаследовали все внутренние гены от донора аттенуации, что является необходимым условием для вакцинного штамма живой гриппозной вакцины. К сожалению, попытка разорвать прочную связку двух генов донора аттенуации (NA-PB2), что, как правило, удается при скрещивании донора аттенуации с сезонными вирусами гриппа человеческого происхождения, не увенчалась успехом.
Также нами была произведена попытка получения реассортантов между NIBRG-23 и донором аттенуации путем скрещивания нативных родительских вирусов в системе in vivo (в морской свинке). В результате клонирования в РКЭ методом предельных разведений назальных смывов, взятых от морских свинок на 3 сутки после заражения, было получено 9 клонов, каждый из которых унаследовал НА от вируса NIBRG-23 (H5N1), a NA и РВ2 гены -от донора аттенуации. Такая постановка опыта не привела к формированию 6:2 или 7:1 реассортантов. Тем не менее, родительские вирусы легко вступали в реассортацию (табл. 26).
Таким образом, было продемонстрировано, что, хотя замена системы культивирования in ovo на in vivo (куриных эмбрионов на морскую свинку) и не привела к разрыву связки между генами NA-PB2 донора аттенуации, тем не менее, реассортация двух нативных родительских вирусов в системе in vivo, в отличие от развивающихся куриных эмбрионов, наступала.
![Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс]](/i/i/4453/177401.png "Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс] Шевченко Елена Сергеевна")
