Введение к работе
Актуальность проблемы
Грипп является массовой инфекцией, ежегодно регистрируемой в различных частях земного шара и наносящей огромный экономический ущерб. Основная причина этого связана с полиэтиологичностью возбудителей, естественной изменчивостью их генома, приводящих к изменению структуры и свойств вирионных белков (Lin Y.P. et al., 2004). В случаях появления нового антигенного варианта вируса гриппа типа А человечество вовлекалось в пандемии гриппа, отличием которых являлось быстрое распространение, высокие показатели заболеваемости и летальности. Во время эпидемии заболевает не менее 20-30% детей и 5-Ю % взрослого населения, при пандемии - до 40-60%. При этом заболеваемость варьирует и зависит от возбудителя пандемии (Гендон Ю.З., 2007; Slepushkin A.N.et al., 2004; Potter C.W., 1998) По числу сезонной смертности в развитых странах грипп занимает первое место: ежегодно умирают от гриппа и его осложнений от 250 000 до 500 000 человек (Reichert Т.А., Sharma А., 2001; WER, 2005). Особенностью настоящего периода является распространение новых антигенных вариантов циркулирующих вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, их социркуляция, возникновение новых эволюционных линий и реассортантов (Литвинова О.М., Лузянина Т.Я., 2001; Литвинова О.М. и др., 2003; Иванова В.Т. и др., 2004; Соминина А.А. и др., 2005; Webster R. et al, 1994; Ellis J.S.et al., 2002; Goddard N.L. et al., 2002; Xu X. et al., 2002). Интродукция вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию может свидетельствовать о возникновении потенциальных кандидатов в новые пандемические штаммы (Львов Д.К. и др., 2004; MMWR, 2004; Ilyushina N.A. et al., 2004, Webster R. et al., 2006; WER, 2006).
В рамках подготовки мероприятий по борьбе с возможной пандемией, большое значение отводится надзору за распространением инфекции, своевременной этиологической диагностике заболевания, характеристике биологических особенностей возбудителя. Изучение циркуляции вирусов гриппа в таком огромном регионе земного шара, каким является Россия, имеет большое значение для медицинской науки и практики. Для характеристики возбудителя проводятся вирусологические исследования - выделение и титрование штаммов вирусов гриппа, изучение свойств вирионных белков, влияние различных факторов на них, установление степени взаимодействия между вирусами гриппа человека и клетками животных (Бурцева Е.И. и др., 2001; Marishita et al., 1996). Результаты серологических исследований различными современными методами, позволяют обеспечить определение не только этиологических агентов, вызвавших эпидемию, но и структуру постинфекционного и поствакцинального иммунитета как к поверхностным, так и к консервативным внутренним белкам, общим для вирусов гриппа человека и животных (WER, 2002). Это актуально при исследовании сывороток переболевших гриппозной инфекцией людей, находившихся в контакте с больными птицами или проживающих в эндемичном по птичьему гриппу районе, поскольку антитела, образующиеся при этом, являются вируснейтрализующими и не могут быть выявлены в РТГА (Wong S.S.Y., Yuen К.,
2006). Углубленное изучение молекулярно-биологических свойств эпидемических штаммов позволяет определять основные тенденции в изменчивости вирусов гриппа А и В, эволюционные связи между вирусами гриппа, циркулировавшими ранее и возникающими вновь в различных регионах земного шара (Webster R. et al., 1992; Hay A.J, 2001). Изучение динамики популяционного иммунитета в зависимости от периода эпидемического цикла позволяет определить степень защиты людей от актуальных эпидемических штаммов.
Огромную роль в проблеме борьбы с гриппом играет разработка новых методов диагностики, что побуждает обращаться к поиску методических решений для вирусологических исследований с привлечением современных достижений различных областей науки, в том числе материалов и методов для создания тест-систем. Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы как для расшифровки причин текущих и прогнозирования грядущих эпидемий, так и для проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, в том числе - разработки новых вакцинных и диагностических препаратов.
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования является характеристика биологических и иммуногенных свойств эпидемических штаммов, циркулировавших в России с 2002 по 2006 гг. и усовершенствование лабораторной диагностики гриппа.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
1. Оценить современную эпидемическую ситуацию в отношении гриппа в России в
период с 2003 г. по 2006 г.
2. Определить антигенные свойства возбудителей эпидемий гриппа в период 2003-2006
гг., их эволюционные связи с эталонными и эпидемическими штаммами, циркулировавшими
в России и в мире в разные годы.
3. Изучить чувствительность различных клеток человека, животных и птиц,
используемых для изоляции (клеток культуры тканей MDCK и куриных эмбрионов - КЭ) и
идентификации вирусов гриппа (эритроциты), к эпидемическим штаммам, изолированным в
период 2002-2006 гг.;
4. Определить влияние различных факторов (температурного воздействия,
протеолитической обработки различными ферментами) на активность вирионных белков
(НА, NA и М) эпидемических штаммов, изолированных в период с 2002 по 2006 гг., и
обладающих разными антигенными свойствами;
Исследовать методом иммуноблота иммунные сыворотки животных и людей, для характеристики постинфекционного и поствакцинального противогриппозного иммунитета;
Изучить состояние популяционного иммунитета населения к эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В в зависимости от периода эпидемического цикла;
7. Разработать новый методический подход для идентификации вирусов гриппа с
применением современных материалов и методов.
Научная новизна работы
На основании результатов вирусологических и серологических исследований определена этиологическая структура гриппа в России в период с 2003 г. по 2006 г., установлено преобладание в популядии A(H3N2) антигенных вариантов новых эталонных штаммов А/Фуцзянь/411/02 и А/Калифорния/7/04 в 2003-2005 гг. и 2005-2006 гг. соответственно.
Выявлено чередование циркуляции представителей двух эволюционных линий вирусов гриппа В в период с 2004 г. по 2006 г., при этом впервые в России в эпидемическом сезоне 2005-2006 гг. выявлены новые антигенные варианты подобные В/Малайзия/2506/04 линии В/Виктория/2/87.
Установлено, что эпидемические штаммы вирусов гриппа A(H3N2), родственные новым эталонам А/Фуцзянь/411/02 и А/Калифорния/7/04, в отличие от вирусов гриппа А(НШ1) наименее чувствительны к системе изоляции КЭ, что говорит о том, что клетки культуры тканей MDCK продолжают оставаться приоритетной системой для изоляции вирусов гриппа A(H3N2) из носоглоточных смывов.
Установлены различия в чувствительности эритроцитов человека разных групп крови, морской свинки и кур к современным штаммам вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, изолированным в период с 2002 по 2006 гг.: наименьшей чувствительностью обладали эритроциты кур при взаимодействии с вирусами гриппа типа А.
Впервые установлены отличия хроматографических профилей триптических гидролизатов консервативных белков Ml вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, свидетельствующие о различиях в структуре этих белков.
Впервые метод иммуноблота был применен для определения спектра вирусспецифических антител в сыворотках переболевших гриппозной инфекцией и установлено наличие в них антител к внутренним белкам Ml и NP.
Впервые иммуноблот был использован для определения спектра вирусспецифических антител в сыворотках лиц, вакцинированных гриппозными вакцинами - полимер-субъединичной вакциной Гриппол и расщепленной вакциной Ваксигрип, и выявлено наличие антител к гемагглютинину вакцинных штаммов.
Впервые установлена возможность использования в вирусологии метода поляризационной микроскопии для анализа комплексов антигенов вирусов гриппа и антител к ним, с применением современных материалов полианилина и жидких кристаллов.
Практическая значимость работы
Полученные данные по идентификации и изучению особенностей вирусов гриппа, циркулировавших на территории России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции вирионных белков этих вирусов учитывались при прогнозировании эпидемий и отборе кандидатов в вакцинные штаммы. Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств циркулировавших штаммов вирусов гриппа включались в информационные материалы, посылавшиеся в ВОЗ, в департамент Госсанэпиднадзора Минздравсоцразвития РФ, в базовые областные и городские центры Госсанэпиднадзора.
В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб-квартиру ВОЗ в Женеве (Швейцария) и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высьыились ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входили в состав коллекций вирусов этих центров. В Государственную коллекцию вирусов депонировано 2 оригинальных штамма: А/Москва/34/03 (ГКВ № 2369) и В/Москва/3/03 (ГКВ № 2370), которые определили новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа А и В. Коллекция вирусов Научно-практического центра экологии и эпидемиологии гриппа пополнена изученными штаммами (98), наиболее характерными для вирусных популяций ежегодных эпидемий гриппа (в течение 3 лет). Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.
Обосновано применение клеток культуры ткани MDCK для изоляции современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В и использование эритроцитов 0(1) группы крови человека при их индикации и идентификации.
Выявление методом иммуноблота (ИБ) в сыворотках переболевших гриппом и ОРВИ антител как к наружным, так и к внутренним белкам позволяет использовать этот метод для дифференциальной диагностики гршшоподобных заболеваний. В рамках подготовки к пандемии гриппа, ИБ возможно применять для анализа вирусспецифических антител в сыворотках больных, зараженных гриппом птиц или новыми пандемическими штаммами, которые невозможно выявить в РТГА.
Исследование методом иммуноблота спектра антител у вакцинированных позволяет рекомендовать этот метод для оценки иммуногенности разных вакцин в отношении разных белков современных вакцинных штаммов и определения специфичности и длительности поствакцинального иммунитета.
Имеется Патент РФ № 2290444 2006 г. на предложенный метод определения комплексов антиген-антитело для диагностики гриппа и других вирусных инфекциях.
Апробация работы
Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: VI Международном симпозиуме по вирусным респираторным инфекциям (Форт-Майерс, США, 2004); I Международной конференции по гриппозным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004); Международной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» (г.Санкт-Петербург, 2004); V Конференции по инфекционным заболеваниям поев. Луису Пастеру (Париж, Франция, 2004); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (г. Санкт-Петербург, 2004); Ш Конференции по исследованию Ортомиксовирусов (Кембридж, Великобритания, 2005); Европейский конгресс по полимерам 2005 (г. Москва, 2005); VI конгресс детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (г. Москва, 2005); Международной конференции по зооантропонозам (Ульяновск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология-2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики,
диагностики и лечения инфекционных болезней» (г. Москва, 2006); V Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (г. Москва, 2006); Европейской конференции «Инфекционные болезни и болезни пищеварительного тракта» (Париж, Франция, 2006).
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела экологии вирусов с Центром по экологии и эпидемиологии гриппа и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 1 марта 2007 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых российских научных журналах, 1 патент и тезисы докладов в сборниках российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных
материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список
литературы включает отечественных и зарубежных источников. Диссертация
изложена на /У^' страницах машинописного текста, включая 22 таблицы и 30 рисунков.
Ключевые слова: эпидемические штаммы, вирусы гриппа А и В, иммунные сыворотки, популяционный иммунитет, куриные эмбрионы, клетки культуры ткани MDCK, хроматографический анализ, иммуноблот, жидкие кристаллы, поляризационная микроскопия.
![Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс]](/i/i/4453/177401.png "Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс] Шевченко Елена Сергеевна")