Введение к работе
Актуальность проблемы. Особенности структурной организации вирусов гриппа (наличие поверхностных белков - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), их подверженность к изменениям с формированием новых дрейф-вариантов; сегментированность генома, определяющая возможность реассортации и приводящая к возникновению новых штаммов с пандемическим потенциалом), способность к преодолению межвидового барьера и инфицированию людей некоторыми подтипами вируса гриппа А птиц и млекопитающих (A(H5N1), A(H7N7), A(H7N2), A(H7N3), A(H9N2) и др.) определяют актуальность исследований по поиску средств и методов, позволяющих снизить ущерб, наносимый этой инфекцией (Слепушкин А.Н., 2003; Каверин Н.В., 2003). Одним из таких направлений является разработка и внедрение химиопрепаратов, проявляющих активность в отношении определенной специфической мишени в цикле вирусной репродукции.
Спектр этиотропных противогриппозных препаратов наиболее широко представлен в России и включает в себя ремантадин, арбидол, ингавирин и рибавирин (Прокудина Е.Н., 2003; Галегоа ГЛ., 2009; Hay А., 1996; Leneva I. et al., 2009; McCoy D. et a!., 2010). Кроме того, основываясь на знаниях третичной структуры одного из поверхностных белков вируса гриппа - NA, были созданы препараты «нового поколения» - озельтамивир (Tamiflu) и занамивир (Relenza), действие которых основано на блокировании активного центра NA вирусов гриппа А и В, что препятствует высвобождению вновь сформированных вирионов и распространению вирусов от клетки к клетке (Colraan P. et al., 1983; Calfee D. & Hayden F., 1998). Первые официальные сообщения о препаратах с антинейраминидазной активностью были сделаны Von Itzstein М. et.al. в 1993 г. (занамивир) и Kim C.U. в 1997 г. (озельтамивир). Эти препараты эффективны против большинства подтипов NA, что является ключевым моментом в предупреждении развития эпидемий, вызванных новыми дрейф-вариантами вирусов гриппа, и обеспечении готовности к пандемии (Roberts N. & Govorkova Е., 2009). Их практическое применение было начато с 1999 г., при этом, озельтамивир был рекомендован не только для лечения и профилактики инфекции, вызванной сезонными вирусами гриппа и штаммами высокопатогенного вируса гриппа птиц A(H5N1), но и для создания государственных стоковых запасов на случай возникновения пандемии (Hayden F., 2002; Moscona А., 2005). С появлением с 2007 г. резистентных к озельтамивиру штаммов А(НШ1) в популяции вирусов гриппа эксперты ВОЗ включили занамивир в список рекомендаций Планов подготовки к пандемии (Roberts N. & Govorkova Е., 2009).
В связи с началом широкого практического применения антинейраминидазных
препаратов в 1999 г. была создана Международная Сеть по Надзору за чувствительностью к
ингибиторам NA (NISN) для информирования экспертов ВОЗ о частоте побочных эффектов,
терапевтической и профилактической эффективности, чувствительности циркулирующих
штаммов и факторов, определяющих риск формирования резистентных мутантов. До 2007 г.
многие исследователи отмечали редкие случаи детекции резистентных к
антинейраминидазным препаратам вирусов гриппа (менее 1%), причем чаще всего такие штаммы выделяли от пациентов, принимавших курс лечения или профилактики
озельтамивиром (WHO, 2008). В 2001 г. авторы ряда исследований выявляли около 1% таких мутантов у взрослых и 5% - у детей, а в 2004-2005 гг. в Японии - у 18% детей, инфицированных вирусами гриппа А и прошедших курс лечения озельтамивиром (McKimm-Breschkin J. et al., 2003; Krso M et al., 2004). В ноябре 2007 г. норвежскими учеными, а несколько позже и специалистами других стран мира было отмечено появление и широкое распространение штаммов вируса гриппа А(НШ1), несущих специфическую мутацию H274Y в белке NA, ответственную за резистентность к озельтамивиру (Moscona А., 2005; WHO, 2007).
В России озельтамивир разрешен с 2001 г.: для лечения гриппа у людей с 1 года и для профилактики - с 12 лет, а с 2005 г. расширены его показания по применению для лечения и профилактики гриппа с 1 года. Занамивир рекомендован для лечения и профилактики гриппозной инфекции с 5 лет (2007 г.). К началу выполнения настоящей работы, совместно с коллегами Отдела гриппа Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P), Атланта, США были проведены исследования чувствительности циркулировавших в РФ 75 эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В (1990-2007 гг.) к антинейраминидазным препаратам, результаты которых не выявили среди них резистентных мутантов, что отражало мировые тенденции в целом (Shevchenko Е. et al., 2009). Однако, учитывая вышесказанное, проведение расширенных исследований чувствительности штаммов к ингибиторам NA с включением результатов в надзор за циркуляцией вирусов гриппа на регулярной основе было затруднено отсутствием необходимого оборудования и субстанций препаратов для постановки классических вирусологических методов оценки подавления нейраминидазной активности - флуоресцентного и хемилюминесцентного, а также молекулярно-генетических методов (RT-PCR/RFLP, ОТ-ПЦР-РВ), детектирующих маркерные мутации, ответственные за устойчивость к препаратам (Mungall В. et al., 2003; Lizheng G. et al., 2009).
Субстратная специфичность NA вирусов гриппа остается практически не изученной областью, что объясняется как несовершенством и трудоемкостью существующих методов, так и недоступностью субстратов для вирусной NA - сиалированных олигосахаридов, входящих в состав клеточных рецепторов для вирусов гриппа (Штыря Ю.А., 2009; Mochalova L. et al., 2005). Нейраминидаза, являясь ферментом на поверхности вируса гриппа, выполняет рецептор-разрушаюшие функции, то есть отщепляет ос2-3 или ос2-6 связанные сиаловые кислоты от сиалилолигосахаридов, выстилающих поверхность клетки-хозяина (Matrosovich М. et al., 2004). Именно поэтому вторым направлением исследований стало изучение субстратной специфичности NA. Без таких знаний невозможно определить роль отдельных участков полипептидной цепи в функционировании NA, отследить возникновение и распространение новых штаммов вирусов гриппа, в частности вирусов, резистентных к ингибиторам NA, а также понять механизмы устойчивости вирусов гриппа к лекарственным средствам.
Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований, представленных в настоящей работе.
Цель и задачи исследования Цель настоящей работы заключалась в определении специфичности нейраминидаз штаммов вирусов гриппа А и В к аналогам природных субстратов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Применить классический флуоресцентный метод для определения значений минимальной ингибирующей концентрации (ICso) озельтамивира карбоксилата и занамивира в отношении штаммов вирусов гриппа А и В, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в РФ.
-
Оценить специфичность клеточного иммуноферментного анализа (ИФА) и возможность его применения в мониторинге противовирусной активности ингибиторов NA.
-
Провести сравнительный анализ различных молекулярно-генетических методов для возможного их применения в целях изучения чувствительности вирусов гриппа к антинеираминидазным химиопрепаратам на территории РФ.
-
Изучить чувствительность циркулировавших в РФ в период 2006-2010 гг. штаммов вирусов гриппа А и В к озельтамивиру и занамивиру.
-
Оценить риск формирования резистентных к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа на фоне приема препарата пациентами в период заболевания.
-
Исследовать и сравнить олигосахаридную специфичность NA эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1), чувствительных и устойчивых к озельтамивиру, а также пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v, изолированных от инфицированных людей с различным исходом заболевания.
Научная новизна исследования
-
Впервые в России были отработаны и применены различные вирусологические (флуоресцентный метод, клеточный ИФА) и молекулярно-генетические (RT-PCR/RFLP, ОТ-ПЦР-РВ) методы для изучения чувствительности вирусов гриппа к антинеираминидазным препаратам.
-
Установлен факт появления в РФ в конце 2007 г. резистентных к озельтамивиру штаммов в популяции вируса гриппа А(НШ1) и последующий рост их числа, достигший 92,0% в сезоне 2008-2009 гг. Циркуляция резистентных мутантов не была связана с приемом этого препарата.
-
Показано, что популяция циркулирующих штаммов вирусов гриппа гетерогенна по чувствительности к антинеираминидазным препаратам: эпидемические штаммы вируса гриппа А(НШ1) - резистентны к озельтамивиру и чувствительны к занамивиру; штаммы вирусов гриппа A(H3N2), В и A(HlNl)v - чувствительны к обоим препаратам.
-
Впервые в России проведено изучение риска формирования резистентных к озельтамивиру штаммов вирусов гриппа А и В при его приеме пациентами в период заболевания. В клинических наблюдениях 2007-2008 гг. и 2009-2010 гг. выявлено формирование устойчивых к озельтамивиру штаммов сезонного вируса гриппа А(НШ1) - на 3-ий день лечения и пандемического вируса гриппа A(HlNl)v - на 5-ый день лечения препаратом.
-
Показано, что профиль олигосахаридной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. В тоже время профиль субстратной специфичности NA вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl характерен для вирусов, выделенных от свиней.
-
Установлено, что профиль субстратной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует двойственную аффинность к сс2-3 и а2-6 сиалозидам. Способность NA этого вируса расщеплять фукозилированные (SLex) и линейные (3'SLN) структуры субстратов с одинаковой эффективностью характерна для высокопатогенных вирусов гриппа А.
Научно-практическая значимость исследования. Вирусы гриппа А и В могут проявлять разные уровни чувствительности к антинейраминидазным препаратам в клетках культуры ткани MDCK, и этот факт зависит от различной эффективности связывания вируса с клеточными сиаловыми рецепторами. Вышесказанное определяет необходимость комплексного подхода для подтверждения случаев резистентности к химиопрепаратам, что также будет способствовать оптимизации методов для изучения чувствительности вирусов гриппа к ингибиторам NA в РФ.
Апробация четырех новых тест-систем на основе ОТ-ПЦР позволила усилить надзор и определить их как наиболее эффективные для мониторинга чувствительности штаммов вирусов гриппа к ингибиторам NA. Три отечественные ОТ-ПЦР-РВ тест-системы для детекции маркерных мутаций устойчивости к озельтамивиру (His274Tyr и His275Tyr) в белке NA вирусов гриппа A(H1N1) и A(HlNl)v соответственно были разработаны совместно с сотрудниками лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и ЗАО «НПФ ДНК-Технология». В настоящее время данные тест-системы находятся на стадии сертификации и лицензирования и используются в работе Центра экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ) при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.
В связи с увеличением числа озельтамивир-резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А(НШ1), а также с появлением устойчивых к озельтамивиру пандемических штаммов A(HlNl)v существует необходимость в усилении надзора за чувствительностью вирусов гриппа А и В к обоим антинейраминидазным препаратам и разработке рекомендаций по целесообразности их применения для лечения и профилактики гриппа в РФ. Следует отметить, что все исследованные вирусы гриппа А и В, включая пандемические штаммы A(HlNl)v, оставались чувствительными к занамивиру.
В рамках проведенных исследований по изучению профилей субстратной специфичности NA вирусов гриппа было выявлено, что замена His274Tyr в активном центре NA сезонного вируса гриппа A(H1N1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не приводит к изменению профиля кинетической субстратной специфичности NA, и поэтому «обоснование» этой мутации, вероятно, следует искать не в изменении «субстрат-узнающих» свойств мутантных вирусов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Детекцию специфических маркеров устойчивости к ингибиторам NA можно осуществлять с помощью методов на основе ОТ-ПЦР, которые должны быть внедрены в надзор за чувствительностью циркулирующих вирусов гриппа к этим препаратам в РФ на регулярной основе.
-
Популяция современных штаммов вирусов гриппа А и В в РФ гетерогенна по чувствительности к ингибиторам NA: эпидемические штаммы вируса гриппа A(H1N1) в подавляющем большинстве резистентны к озельтамивиру, но чувствительны к занамивиру; штаммы вирусов гриппа A(H3N2), В и A(HlNl)v чувствительны к обоим антинейраминидазным препаратам.
-
Штаммы вирусов гриппа А(НШ1) и A(HlNl)v наиболее высоко подвержены риску формирования резистентности к озельтамивиру. Одним из факторов риска является курс лечения этим препаратом в период заболевания.
-
Мутация His274Tyr в активном центре NA сезонного вируса гриппа A(H1N1), обеспечивающая устойчивость к озельтамивиру, не приводит к изменению профиля кинетической субстратной специфичности NA.
-
Профиль олигосахаридной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа АЛ1У-Мозсо\/01/09 (HlNl)swl имеет особенности, свойственные для вирусов, выделенных от свиней, птиц и человека. Профиль субстратной специфичности NA вируса гриппа A/IIV-Moscow/03/09 (HlNl)swl характерен для вирусов, выделенных от свиней.
-
Профиль субстратной специфичности NA пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Orenburg/93/09 (HlNl)swl, изолированного от пациента с летальным исходом, демонстрирует одинаковое сродство к сс2-3 и а2-6 сиалозидам.
Апробация результатов исследования. Результаты работы были представлены на международных симпозиумах, съездах, конгрессах и конференциях: IX Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-27 апреля 2007; VII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 3-5 декабря 2008; I Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, апрель 2008; XVI Интернациональная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 14-18 апреля 2009; II Ежегодная Конференция молодых ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 23 апреля 2009; BIT's 7th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology 2009 (IDDST-2009) «Milestones of Innovative Therapeutics», Shanghai, China, 22-25 October 2009; Всероссийская Научная Конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 19-20 ноября 2009; VIII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 2009; XVII Международная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Москва, 12-15 апреля 2010; III Ежегодная Конференция молодых
ученых, Москва, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 20 апреля 2010; International Conference «Options for the control influenza VII», Hong Kong SAR, China, 3-7 September 2010.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе б - в реферируемых журналах, материалах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, съездах, симпозиумах, конференциях и проблемных комиссиях, а также 3 удостоверения (депонента) в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского на два сезонных штамма вируса гриппа А(НШ1) и один пандемический штамм вируса гриппа A(HlNl)v с различной чувствительностью к озельтамивиру.
Помимо вышеперечисленного является соавтором депонирования в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 81 штамма пандемического вируса гриппа A(HlNl)v.
По материалам диссертации подана заявка на изобретение №2009129374/10 «Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl для разработки средств и методов биологической защиты», дата подачи 30.07.2009 г. Решение о выдаче патента РФ на изобретение получено 15.09.2010 г.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 37 работ отечественных и 191 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и включает 17 таблиц, 2 схемы и 34 рисунка.
![Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс]](/i/i/4453/177401.png "Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс] Шевченко Елена Сергеевна")
