Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 11
2.1. Описание заболевания 11
2.2. Общая характеристика вируса гриппа 13
2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1 19
Передача вируса 19
Клинические проявления. 20
Патогенез. 23
2.4. Способы диагностики вируса гриппа 27
2.4.3. Иммуноферментный анализ 30
2.4.4. Молекулярные методы 32
2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция 32
2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 38
3. Материалы и методы 44
3.1. Материалы 44
3.2. Методы 50
4. Результаты 60
4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1 методом ПЦР . 60
4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР. 60
4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы. 62
4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы 66
4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы 68
4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени. 72
4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР. 72
4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 75
4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени. 78
4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 81
4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 82
4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики. 86
4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality
Assessment Programm (EQAP) 88
4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 89
4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1. 94
4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа. 94
4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1. 99
5. Обсуждение результатов. 102
6. Выводы 112
7. Библиография 114
8. Приложения 130
- Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1
- Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1 методом ПЦР
- Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
- Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1.
Введение к работе
Актуальность темы
Вирус гриппа А подтипа H5N1 – высоко патогенный вирус «птичьего
гриппа» – впервые инфицировал человека в 1997 году во время вспышки болезни
среди домашних птиц в Гонконге (Claas et.al.,1998; Shortridge et al.,1998). В 2003 и
2004 годах этот вирус распространился из Азии в Европу и Африку и
циркулировал среди птиц во многих странах, что привело к сотням случаев
заболевания людей, в том числе и со смертельным исходом (Guan et al., 2009).
Вспышки болезни среди домашних птиц оказывают серьезное воздействие на
экономику и международную торговлю в пораженных странах. Продолжающаяся
циркуляция вирусов H5N1 среди домашних птиц, особенно там, где этот вирус
является эндемическим, по-прежнему представляет угрозу для общественного
здравоохранения (WHO, 2011), так как эти вирусы обладают не только
способностью вызывать тяжелое заболевание у людей, но и преодолевать
межвидовой барьер (Manz et al., 2013; Webster et al., 2007).
9 января 2014 года ВОЗ сообщила о подтверждённом случае заболевания гриппом, вызванным вирусом А/H5N1 в Канаде у человека, приехавшего из Пекина. Всего в мире с 1997 года зарегистрировано 649 случаев заболевания людей гриппом, вызванным вирусом H5N1, 385 из которых с летальным исходом. Таким образом, смертность от гриппа, вызванная вирусом H5N1, составляет почти 60% (WHO, 2014). В нашей стране пока не зарегистрировано ни одного случая заболевания человека гриппом, вызванным вирусом H5N1. Первая вспышка «птичьего гриппа» среди домашней птицы в России произошла в июле
2005 года в Новосибирской области (Львов и др., 2005) и была связана с
миграцией водоплавающих птиц из стран Азии на территорию нашей страны.
Все вышесказанное указывает на необходимость быстрой идентификации и типирования вирусов гриппа А не только для облегчения наблюдения за пандемическим потенциалом вируса «птичьего гриппа», но и для улучшения контроля и лечения инфицированных пациентов (Sakurai et al., 2012). В последние годы методы молекулярной диагностики, рекомендованные ВОЗ, играют
ключевую роль в выявлении и типировании вирусов гриппа (Alexander, 2008, Thanh et al., 2010). Совокупность чувствительных и специфичных современных отечественных тест-систем для качественного и количественного выявления генома вируса гриппа H5N1 на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, а также методов выявления антител к данному вирусу может существенно облегчить экологический мониторинг с целью предупреждения возможной пандемии.
Цель и задачи исследования Целью исследования была разработка и усовершенствование методов лабораторного выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 и антител к нему. Задачи исследования:
-
Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР, проверить чувствительность и специфичность и на основании этих данных создать «Тест-систему для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» и нормативную документацию к ней (СТО и Инструкцию по применению);
-
Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения и количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени, проверить его чувствительность и специфичность;
3. Разработать генно-инженерные положительные контроли на основе
плазмиды pGEM-T Easy, содержащие клонированные участки генома вируса
гриппа А подтипа H5N1;
4. Показать возможность использования метода количественного
определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 для контроля на
стадиях получения рекомбинантных вирусов гриппа методом обратной
генетики.
5. Показать возможность использования разработанных тест-систем для
обнаружения и дифференциации высоковирулентного вируса гриппа А подтипа
H5N1 в биологических образцах от птиц, собранных в различных регионах РФ;
6. Получить рекомбинатный белок NS1 на основе вектора pET32b+ с
последующей химической трансформацией штамма E. Coli
BL21trxB(DE3)pLysS, накоплением и выделением методом метало-хелатной
аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы.
7. Разработать методику обнаружения антител к рекомбинантному
неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 на основе
непрямого ИФА.
Научная новизна работы
Созданы отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР-РВ для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 с учетом генотипов вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации. Достигнута высокая эффективность применения молекулярно-генетических методик мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Разработанные тест-системы являются универсальными и позволяют детектировать все известные на сегодняшний день генотипы вируса гриппа А подтипа H5N1.
Получен Российский патент № 2361924 «Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1».
Разработки могут быть использованы в лабораториях Научно-исследовательских институтов в целях изучения эволюции вируса гриппа А подтипа H5N1 для предупреждения возможной пандемии.
Впервые показана возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени для контроля получения рекомбинантного вируса гриппа H5N1 методом обратной генетики.
Показана возможность применения непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 для
дифференциации инфицированных и вакцинированных инактивированной вакциной птиц.
Практическая значимость
Для «Тест-системы для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А
подтипа H5N1 методом ПЦР» разработаны СТО 42418073-0001-2007 и
Инструкция по применению от 21. 05. 2009 №1-4.7/02562, которые утверждены
в Министерстве Сельского хозяйства РФ. Данная тест-система
сертифицирована во Всероссийском Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), сертификат соответствия № РОСС RU.ФВ01.Н26634.
Разработанные тест-система и методики на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени использованы при проведении Международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа в 2007-2011 г.г. Получен международный сертификат от 31. 10. 2011 г.
Сконструированные генно-инженерные положительные контроли,
содержащие фрагменты генома вируса гриппа А подтипа Н5N1, могут быть
использованы в лабораторных и коммерческих тест-системах для
качественного и количественного контроля определения генома
высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в научных и клинических лабораториях.
Разработанные методики и «Тест-система для диагностики вируса гриппа
А подтипа H5N1 методом ПЦР» используются в региональных ветеринарных
лабораториях, в диагностических лабораториях Роспотребнадзора и
Минсельхоза РФ для проведения мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1. Тест-системы могут также быть использованы для проведения научно-практических занятий в Университетах и Институтах Минздрава РФ.
Методика обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку вируса гриппа NS1на основе непрямого ИФА может быть использована
для дифференциального выявления вакцинированных инактивированной вакциной и инфицированных птиц.
Основные положения, выносимые на защиту
Создана и предложена в практику здравоохранения тест-система для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 («птичий грипп») и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР.
Разработан молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Выработана методика количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР-РВ, которая может быть использована для контроля накопления рекомбинантного вируса гриппа А/H5N1, полученного методом обратной генетики.
Синтезирован рекомбинантный белок NS1 на основе вектора pET32b+ с
последующей химической трансформацией штамма E. Coli
BL21trxB(DE3)pLysS, очищенный метало-хелатной аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы для использования его в качестве специфического компонента в ИФА.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на Международной научной конференции
«Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для
людей и животных» (Ульяновск, 2006); итоговой конференции СНО
медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты
современной медицины (Москва, 2007); IV Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Молекулярная
диагностика - 2007» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической
конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого
«Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и
химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007); научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, 2012), на совместном заседании кафедры фармхимии медицинского факультета РУДН и отдела прикладной вирусологии ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» МЗ РФ (Москва 2013)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК, 1 патент РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 160 страницах компьютерного
текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав
экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы,
включающего 148 источников, в том числе 112 иностранных, 4 приложений. Работа иллюстрирована 30 рисунками и 11 таблицами.
Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1
Вирус гриппа передаётся воздушно-капельным путём напрямую при вдыхании вирусных частиц или косвенно путём попадания вирусных частиц в верхние дыхательные пути или конъюнктиву слизистой оболочки. Подтверждены случаи передачи вируса гриппа А H5N1 от птицы к человеку, возможна также передача вируса из окружающей среды человеку и ограниченная, неустойчивая передача вируса от человека человеку.
В 1997 году впервые была зафиксирована передача вируса от птицы человеку, произошедшая через неделю после начала вспышки заболевания среди птиц (Mounts A.W. et al., 1999). В то время не существовало действительного риска, связанного с употреблением в пищу или приготовлением домашней птицы или заражения людей вирусом гриппа А H5N1. Заражение вирусом после разделывания домашней птицы было связано с серопозитивностью к вирусу гриппа А H5N1. В последнее время большинство заразившихся имели прямой контакт с домашней птицей, хотя не относились к числу людей, участвовавших в выбраковке больных птиц. Люди также заражались при ощипывании и приготовлении больных птиц, подготовке боевых петухов, при игре с домашними птицами, особенно с инфицированными утками, переносящими заболевание бессимптомно, при употреблении крови уток, а также недоваренной птицы. Передача вируса кошачьим наблюдалась при кормлении тигров и леопардов в зоопарке Таиланда зараженной курицей (Keawcharoen J. et al., 2004) и при таком же кормлении домашних кошек в эксперименте (Kuiken T. Et al.2004).
Передача вируса гриппа А H5N1 от человека к человеку предположительно происходила в общежитиях и был зафиксирован один случай передачи вируса от матери ребёнку (Ungchusak K. et al., 2005). Не было выявлено ни одного случая передачи вируса воздушно-капельным путем от человека к человеку, однако при тесном контакте без мер предосторожности передача вируса возможна. В 1997 году передача вируса от человека к человеку произошла, по-видимому, не через социальный контакт, малую эффективность такой передачи вируса доказывают и серологические исследования инфицированных работников здравоохранения. Серологические исследования во Вьетнаме и Тайланде не нашли доказательств бессимптомного инфицирования среди зараженных. В последнее время, благодаря активному эпиднадзору за контактами пациентов, с помощью ОТ-ПЦР были выявлены легкие формы заболевания. Выявлено больше инфекций у пожилых людей, а также увеличение числа и продолжительности заболевания в семьях во Вьетнаме, предположительно вызванные адаптацией местных штаммов вируса к человеку. Однако необходимы вирусологические и эпидемиологические исследования для подтверждения этих выводов. На сегодняшний день риск внутрибольничной передачи вируса среди медицинских работников низок, даже не используя меры предосторожности (Liem N.T. et al., 2005). Тем не менее, был зарегистрирован один случай тяжелого заболевания медсестры, контактировавшей с инфицированным пациентов во Вьетнаме. Учитывая наличие вируса гриппа А H5N1 в окружающей среде также возможно инфицирование при проглатывании контаминированной воды во время плавания в водоёмах, при попадании воды в нос и на конъюнктиву глаза. Фактором риска также является использование необработанных фекалий птиц в качестве удобрения. Клинические проявления. Спектр клинических проявлений вируса гриппа А H5N1 основан на описаниях госпитализированных пациентов. Описание случаев заболевания вирусом гриппа А H5N1 позволяет выявить лёгкие случаи заболевания, субклинические, а также атипичные формы, такие как гастроэнтерит и энцефалопития (M.D. de Jong, 2005). Большинство пациентов до заболевания были здоровыми детьми или взрослыми. Инкубационный период вируса гриппа А H5N1 более длинный, чем у других вирусов гриппа человека. В 1997 году клинические признаки заболевания появлялись через 2-4 дня после инфицирования, недавние исследования показывают такие же интервалы, но с разбросом до 8 дней (Hien T.T. et al., 2004). В случае передачи вируса в бытовых условиях инкубационный период составлял от 2 до 5 дней, однако верхний предел мог быть до 8-17 дней, что может быть связано с заражением через окружающую среду или при контакте с инфицированными животными. У большинства пациентов начальным симптомом заболевания была высокая температура (как правило, выше 380С) и гриппоподобная инфекция нижних дыхательных путей. Иногда отмечалось инфицирование верхних дыхательных путей. У пациентов, инфицированных вирусом гриппа А H5N1 конъюктивит встречался реже, чем у пациентов, инфицированных вирусом птичьего гриппа Н7. Также сообщалось, что у некоторых пациентов на начальном этапе возникает диарея, рвота, боль в животе, боль в плевральной полости и кровотечение из носа и десен. Водянистая бескровная диарея и воспаление встречались чаще, чем при вирусах гриппа человека, и могут предшествовать респираторным симптомам на неделю. В одном из сообщений описывались два пациента, у которых не было респираторных симптомов, однако была энцефалопатия и диарея. Симптомы инфекции нижних дыхательных путей проявлялись не только в начале заболевания, но и сохраняются в дальнейшем. Одышка появлялась через 5 дней после начала заболевания. Общими симптомами являлись дыхательная недостаточность, тахипноэ и потрескивание при вдохе. Количество мокроты, иногда с примесью крови варьировалось у разных пациентов. Почти у всех пациентов клиническим проявлением заболевания было воспаление лёгких. Рентгенологические исследования показывали наличие диффузных, мультифокальных и очаговых инфильтратов, на бронхограмме визуализируются интерстициональные инфильтраты. Рентгенологические изменения появлялись в течение 5 дней после начала заболевания. В Хошимине во Вьетнаме самым распространенным изменением у только поступивших пациентов было многоочаговое уплотнение по крайней мере двух зон на бронхограмме. Случаи плеврального выпота были редки. Данные микробиологических исследований говорят о том, что это процесс возникает при первичной лёгочной пневмонии без бактериальной инфекции на момент госпитализации. Прогрессирование дыхательной недостаточности было связано с наличием диффузных, двусторонних инфильтратов и проявлением острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). В Тайланде время от начала заболевания до развития ОРДС составляло в среднем 5 дней. Общими признаками заболевания являлись полиорганная недостаточность с признаками дисфункции почек и патология сердца, в том числе дилатация сердца и суправентрикулярная тахиаритмия. Другими осложнениями были пневмония, легочное кровотечение, пневмоторакс, панцитопения, синдром Рейе, а также сепсис.
Летальность среди госпитализированных пациентов была высокой, хотя общий уровень летальности, скорее всего, значительно ниже. В отличие от 1997 года, когда большинство летальных случаев приходилось на пациентов старше 13 лет современный вирус гриппа А H5N1 вызывает высокий уровень смертности среди младенцев и маленьких детей. В Тайланде смертность составила 89 процентов среди лиц моложе 15 лет. Смерть наступала в основном на 9 или 10 день от начала заболевания, большинство пациентов умирало в основном от прогрессирующей лёгочной недостаточности. Общими лабораторными признаками заболевания были лейкопения, в основном лимфопения, лёгкая или умеренная тромбоцитопения и слабо или умеренно повышенный уровень АЛТ. Одним из признаков заболевания также является гипергликемия, которая может быть связана с приёмом кортикостероидов или повышения уровня креатинина. В Тайланде повышенный риск смерти наблюдался у пациентов, поступивших с низким уровнем лейкоцитов, тромбоцитов и лимфоцитов. Диагностика вируса гриппа А H5N1 включает вирусовыделение и обнаружение РНК вируса подтипа Н5, или оба метода. В отличие от вирусов гриппа А человека вирус птичьего гриппа H5N1 ассоциирован с более высокой частотой обнаружения вируса и более высоким уровнем вирусной РНК в фаренгиальном секрете, а не в назальном. Во Вьетнаме вирусная РНК обнаруживалась в носоглоточных смывах начиная со 2 до 15 дня после начала заболевания (в среднем через 5 дней), а вирусная нагрузка на 4-8 день после начала заболевания была в 10 раз выше у пациентов с вирусом гриппа А H5N1, чем у пациентов с вирусами гриппа А подтипов H3N1 и H1N1.
Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1 методом ПЦР
Учитывая большую вариабельность генома вируса гриппа типа А, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее консервативным участкам вирусного генома. Основой для поиска мест посадок праймеров стало сопоставление нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина и нейраминидазы всех вирусов гриппа, находящихся в базе данных. Всего использовали более 10000 нуклеотидных последовательностей геномов вирусов гриппа.
При выборе мест посадки праймеров учитывались следующие требования: специфичность праймеров для всех последовательностей вирусов подтипа H5N1, отсутствие мест посадки праймеров на последовательности вирусов других подтипов. В качестве дополнительных критериев, определяющих пригодность праймеров, учитывались следующие: отсутствие дупликсов праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие мест ложной посадки на матрицы геномов различных штаммов вируса гриппа А и родственных вирусов. Этим критериям удовлетворяют все отобранные праймеры.
. Отмечены сайты посадки олигонуклеотидных праймеров, использованных в тест-системе ПЦР.
В результате реакции обратной транскрипции и синтезируется отрезок генома гена Н размером 184 п.н. амплификации
Отмечены сайты посадки олигонуклеотидных праймеров, использованных в тест-системе ПЦР. В результате реакции обратной транскрипции и амплификации синтезируется отрезок генома гена N размером 213 п.н.
Эффективность и специфичность тест-системы проверена на референтных штаммах вируса гриппа, полученных из коллекции ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И, Ивановского» Минздрава РФ (таблица 1). Штаммы имели различную специфичность поверхностных белков. Результаты проведения ПЦР с использованием разработанной тест-системы представлены на рисунке 12. Результаты исследования эпидемических штаммов вируса гриппа, выделенных от людей, показали, что с помощью разработанной тест-системы можно выявить геном вируса гриппа А подтипа N1. Специфичность тест-системы также была проверена с эпидемическими и эталонными штаммами вируса гриппа А, выделенными от животных, в том числе и от птиц. Показано наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в эталонных штаммах А/Mallard/Pensylvania/10218/84 и А/Grebe/Novosibirsk/29/05, а также РНК вируса гриппа А подтипа N1 в эталонных штаммах A/WSN/33, A/FPV/Росток и А/Grebe/Novosibirsk/29/05. При обнаружении РНК вируса гриппа А подтипа N1 положительные результаты были получены с эпидемическими штаммами А/СССР/90/77 (Н1N1) и A/WSN/33 (Н1N1), хранившимися в замороженном состоянии длительное время (несколько лет при -700С). Показано, что нет перекрестных реакций с вирусами других семейств (Paramyxoviridae, Coronaviridae, Birna Viridae).
Результаты ПЦР показали, что положительный результат получали только при наличии гемагглютинина 5 типа и нейраминидазы 1 типа в различных титрах. ПЦР с использованием других подтипов вируса гриппа А показала отрицательный результат. На рисунке 13 пример электрофореза после проведения ПЦР на матрице гена нейраминидазы. Видно, что положительный результат получен в случае детекции вируса гриппа А подтипа N1.
Для определения чувствительности разработанного метода использовали образец вируса A/Grebe/Novosibirsk/29/05 с начальным титром 105 ЭИД50/мл. Далее готовили серию последовательных десятикратных разведений образца вируса. Затем проверяли в ПЦР на наличие РНК вируса гриппа А подтипа Н5 (рисунок14) и N1 (рисунок 15). Исходя из полученных результатов можно говорить о том, что предел обнаружения РНК вируса гриппа подтипа Н5 составляет 102 ЭИД50/мл, а предел обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа N1 – 103 ЭИД50/мл.
Для синтеза «положительного» контроля на вирус гриппа А подтипа Н5N1 были использованы праймеры, разработанные ранее для этой тест системы. Матрицей для синтеза специфических фрагментов был референтный штамм вируса гриппа А подтипа Н5N1 A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Фрагмент гена НА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 184 п.н. и фрагмент гена NА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 213 п.н клонировали в плазмиду pGEM Easy. После трансформации компетентных клеток E.coli проводили скрининг клонов методом ПЦР, чтобы обнаружить присутствие плазмиды со специфичным фрагментом. Также было проведено секвенирование полученных вставок. Последовательности, полученные в результате секвенирования, были сопоставлены с последовательностью A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Сравнение показало, что нуклеотидные последовательности вставок на 100% совпадают с нуклеотидными последовательностями вируса, использованного для изготовления «положительных» контролей. Массовую концентрацию плазмид определяли спектрофотометрически при длине волны =260 нм. Среднее значение концентраций рассчитывали по результатам 6-ти измерений (табл. 8). Плазмиды в десятикратных разведениях использовались в качестве матрицы при постановке ОТ-ПЦР.
Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
С целью создания положительного контроля для разработанной тест системы использовались специфические праймеры, входящие в состав данного теста. Матрицей для синтеза специфических фрагментов был референтный штамм вируса гриппа А подтипа Н5N1 A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Фрагмент гена НА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 173 п.н. и фрагмент гена NА вируса гриппа А подтипа H5N1 размером 196 п.н клонировали в плазмиду pGEM Easy. После трансформации компетентных клеток E.coli проводили скрининг клонов методом ПЦР, чтобы обнаружить присутствие плазмиды со специфичным фрагментом. Также было проведено секвенирование полученных вставок. Последовательности, полученные в результате секвенирования, были сопоставлены с последовательностью A/Grebe/Novosibirsk/29/05. Сравнение показало, что нуклеотидные последовательности вставок на 100% совпадают с нуклеотидными последовательностями вируса, использованного для изготовления «положительных» контролей. Массовую концентрацию плазмид определяли спектрофотометрически при длине волны =260 нм. Среднее значение концентраций рассчитывали по результатам 6-ти измерений (табл. 9). Концентрация выделенных рекомбинантных плазмид pGEM-H5-RT и pGEM-N1-RT оказалась равна 0,192 мкг/мкл и 0,215 мкг/мкл соответственно. Данная концентрация соответствует количеству ДНК для плазмиды pGEM-H5-RT (5,5107 молекул/мкл) и для плазмиды pGEM-N1-RT (6,1107 молекул/мкл).
В качестве матрицы при постановке ОТ-ПЦР использовали серию разведений исходных плазмид. Положительный сигнал в обеих реакциях был получен при использовании всех разведений плазмиды, кроме 10-10, однако оптимальными для использования полученной рекомбинантной плазмиды являются разведения 10-2 – 10-6.
Для проведения количественного анализа строили калибровочный график с использованием стандартных растворов рекомбинантной плазмиды с известной концентрацией. График выражал линейную зависимость значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла с помощью компьютерной программы проводили расчёт концентрации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 в нескольких положительных пробах от птиц.
В качестве стандартных растворов были использованы разведения полученной ранее рекомбинантной плазмиды pGEM-H5-RT с концентрацией 5,5хЮ10 молекул/мкл.
Концентрации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 в исследуемых пробах составили (молекул/мкл): проба 1 - 2,4x1 о6, проба 2 - 5,0x106 , проба 3 -4,6хЮ5, проба 4 - 5,0хЮ4 , проба 5 - 5,2хЮ3, проба 6 - 1,6 103, проба 7 -1,3x102 (рисунок 24) Рисунок 24. Определение количества вируса гриппа А подтипа H5N1 (молекул/мкл) в пробах.
- калибровочные растворы, - исследуемые образцы. 4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики.
В работе были исследованы стадии получения рекомбинантного вируса гриппа А подтипа H5N1 методом обратной генетики, на основе вируса гриппа А pR8 (Н1N1). У одной из 8 плазмид инфекционного клона, ген гемагглютинина H1 был заменен на ген гемагглютинина вируса гриппа А/Курган/05/2005 (H5N1). После трансфекции клеток 293Т/MDCK 8-ю плазмидами инфекционного клона и пассирования в культуре клеток МДСК, а затем в куриных эмбрионах получен рекомбинантный вирус А/H5N1.
На рисунке 25 представлены результаты тестирования рекомбинантного вируса гриппа А/H5N1 на различных стадиях его получения: в культуре клеток МДСК и в аллантоисной жидкости после первого и второго пассажей на куриных эмбрионах.
Разработанные тест-системы были использованы для тестирования 9-й панели, в ходе международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа, проходившей в марте 2011. В таблице 10 представлены результаты молекулярного анализа, полученные в ходе лабораторного экзамена.
Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1.
Получение ПЦР фрагмента гена NS1.Для наработки фрагмента гена NS1 вируса гриппа были разработаны специфические праймеры (таблица 4). С помощью разработанных праймеров и штамма вируса гриппа А/chicken/Kurgan/3/2005 был получен ПЦР фрагмент с генома вируса гриппа гена NS1. Неструктурный белок вируса гриппа NS1 является одним из консервативных белков вируса, поэтому матрицей для синтеза ПЦР фрагмента гена NS1 может быть вирус гриппа любого типа и подтипа. Клонирование полученной плазмиды и экспрессия белка. Полученный участок был клонирован в экспрессионный вектор pET32b+ (рисунок 27).
Наличие нужной вставки было проверено с помощью секвенирования получившейся плазмиды.
Конструкция была трансформирована в экспрессионные клетки E.coli штамм BL21(DE3)pLysS, с помощью которых был проведен синтез белка.
Очистка полученного белка. Рекомбинантный белок очищали от примесей с помощью металл-афинной хроматографии. Затем различные фракции белка проверяли методом ИФА с моноклональными антителами против гистидина (рисунок 28). В экспрессионной плазмиде есть участок, кодирующий 6 аминокислот гистидина, которые транслируется на С-конец белка, поэтому проверка полученного белка на наличие гистидинов позволяет достоверно судить о его синтезе.
Из рисунка 28 видно, что белок большей частью выделяется в денатурирующих условиях, т.е. в буфере, содержащем 50 мМ имидазола и 6М мочевины.
Это подтверждается анализом рекомбинантного белка NS1 в ПААГ электрофорезе в 12% полиакриламидном геле и методом иммуноблоттинга с моноклональными антителами (мАТ) против полигистидиновых групп, меченных пероксидазой хрена (рисунок 29).
На рисунке 29 на дорожках №5 и №6 хорошо видна специфическая полоса, с молекулярным весом 45 кДа, что соответствует молекулярной массе полученного рекомбинантного белка NS1 в комплексе с гистидиновыми остатками. Рекомбинантный белок NS1 может быть использован для сенсибилизации планшетов в ИФА при определении антител к данному белку в сыворотках крови птиц. Предварительное шахматное титрование с референтными сыворотками показало, что оптимальная концентрация белка NS1 составляет 1 мкг/мл, а сыворотки следует разводить в 100 раз.
Были проверены 5 сывороток от кур, привитых «Флупротект H5» инактивированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц типа А подтипа H5 производства ФГУП «Ставропольская Биофабрика» (серия 040306) и 3 референтные сыворотки от кур, инфицированных вирусом H5N1 (LPAI), предоставленные Др. Д. Л. Суарэсом (USDA Agricultural Research Service (USDA-ARS), South East Poultry Research Laboratory, Атенс, Джорджия, США) (рисунок 30). Рисунок 30. Результаты иммуноферментного анализа сывороток кур на наличие антител к белку NS1 Как показали результаты эксперимента (рис. 30) уровень антител в референтных сыворотках от кур, инфицированных инактивированным вирусом H5N1, значительно превышает таковой в сыворотках вакцинированных кур. Полученные результаты указывают на возможность применения разработанного метода для дифференциальной диагностики привитых инактивированными вакцинами и инфицированных птиц.
В настоящее время грипп является одним из самых распространённых заболеваний на планете (Newmann G., 2011, Слёпушкин, 2001).
Постоянно существует серьезная угроза возникновения новой пандемии среди людей, которая может быть вызвана вирусом гриппа А подтипа H5N1 (Dawood F.S., 2009; Fraser C., 2009; Tumpey T.M., 2009). Первый подтверждённый случай передачи вируса гриппа птиц H5N1 человеку был зафиксирован в Гонконге в 1997 году. В результате заболело 18 человек, 6 из которых умерли.
В такой ситуации очень важен мониторинг вируса гриппа среди людей и птиц, быстрое и надежное выявление возбудителя у людей с симптомами острого респираторного заболевания для принятия эффективных мер по лечению и предотвращению дальнейшего распространения вируса (Львов Д.К., 2010; Коновалова Н.И., 2010).
Сейчас традиционными методами диагностики вируса гриппа А являются вирусологические методы. Это надежные и чувствительные методы, однако, они трудоемки и на их выполнение требуется от 1 до 2 недель. В последнее время широкое распространение получили молекулярные методы диагностики. Время анализа инфекционного материала сокращается до одного дня, их чувствительность не уступает чувствительности традиционных методов. Всемирная организация здравоохранения рекомендует использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), реакцию ингибирования гемагглютинации (HI) и реакцию ингибирования нейраминидазы (NI), выделение вируса с помощью куриных эмбрионов и культур клеток (Quilivan M., 2000), иммунодиффузии в агарозном геле (AGID), а также ПЦР и ПЦР в реальном времени для диагностики вируса гриппа А (World Health Organ. 1980; Schild G.C., 1980). Золотым стандартом в диагностике вируса гриппа птиц является метод ELISA (Takimoto S., 1991.). Однако ни данный метод, ни реакции ингибирования не могут быть пригодны для идентификации вновь возникших штаммов, т.к. зависят от специфических антител. Наращивание вируса на куриных эмбрионах или культурах тканей позволяет получить большое количество вируса для последующей диагностики и типирования (Соминина А.А., 2006; Бурцева Е.И., 2001), однако это занимает от 3 до 7 дней.(Wang R., 2010.) Метод иммунодиффузии в агарозном геле требует большого количества антигена, что предполагает его предварительное пассирование на куриных эмбрионах.
В отличие от традиционных методов современные молекулярные методы диагностики вируса гриппа не имеют таких ограничений. Их отличают такие преимущества как быстрота, надёжность и экономичность (Sakurai A., 2012.).
Для молекулярной диагностики и типирования вируса гриппа А в настоящее время применяются такие методы как ОТ-ПЦР (Herrmann B., 2001.) и ПЦР в реальном времени (van Elden L.J., 2008, Лободанов С.А., 2012), также её модификации, такие как высокоскоростная ПЦР в реальном времени (Sakurai A., 2011.) и количественная ПЦР в реальном времени (Aguero M., 2007; Ellis J.S., 2007.), лигазная цепная реакция, реакция транскрипционной амплификации (Lau L. T., 2004; Moore C., 2004.), изотермальная петлевая реакция (Poon L. L. M., 2005; Imai M., 2006; Ito M., 2006.) и микрочипы (Kessler N., 2004; Li J., 2001; Lodes M. J., 2006; Townsend M. B., 2006, Fesenko E.E. 2007).
Исходя из вышеизложенного, актуальной проблемой данного исследования стало создание комплекса методов молекулярной диагностики, позволяющего определить наличие вируса гриппа А подтипа H5N1 в пробе. Данный комплекс включает создание тестов для диагностики и типирования высокопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР и ПЦР в реальном времена, а также количественной модификации ПЦР в реальном времени.
Первой разработкой в рамках данного исследования стало создание теста для определения высокопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1 методом одностадийной ПЦР.
Среди опубликованных работ по разработке праймеров для амплификации РНК вирусов гриппа А есть работы, описывающие как одностадийные (Fouchier R. A. M., 2000; Vabred A., 2000; Wright K. E., 1995), так и “гнездовые” ПЦР (Oxburgh L., 1999). Причем заявленная авторами чувствительность одностадийной ПЦР не уступает чувствительности гнездового варианта ПЦР ( Qiu B.F., 2009).
![Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс]](/i/i/4453/177401.png "Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс] Шевченко Елена Сергеевна")
