Содержание к диссертации
Введение 5-9
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9-40
Глава I. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ВИРИОНА ВИРУСА ГРИППА И ИХ СВОЙСТВ 9-15
Глава 2. СТРУКТУРА ГЕНША ВИРУСА ГРИППА И ЕГО СВЯЗЬ С ШОІОШЧЕСКІШ СВОЙСТВАМИ' 16-27
2.1. Доказательства фрагментарности генома вируса гриппа 16-22
2.2. Кодирующая функция индивидуальных фраг ментов РНК вируса гриппа 23-27
Глава 3. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ "РЕКШЕЙНАДИЙ 28-40
3.1. Наследование биологических признаков ви руса гриппа при генетической рекомбинации 28-32
3-2. Генетическая детерминация биологических свойств вируса гриппа 32-40
3.2.1. Генетическая детерминация признака патогенности вируса гриппа. 33-36
3..2.2.. Генетическая детерминация признака высокой репродукционной активности (РА) штаммов вируса гриппа 36-40 .
Часть П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 41-93
Глава I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ' 41-48
Вирусы 41
ІД. Накопление вирусов на куриных эмбрионах . 42
1.2. Определение 'инфекционной и гемагглюти- нирующей активности вируса 42
1.3. Определение антигенной структуры гемагглю-тинина и нейрамияидазы 43-44
1.4. Определение токсигенности вируса для мышей 44
1.5. Получение рекомбинантов с измененной репродукционной активностью 45
Г.6. Концентрация и очистка вируса 46
1.7. Электрофорез вирионных белков в полиакрияа-мидном геле (ПААГ) 46-47
1.8. Выделение РНК . 47-48
1.9. електрофорез одноцепочечных вирионных РБК в полиакриламидном геле (ПААГ) 48
Глава 2. ШБОР МОДЕЛИ' И МЕТОДА ОЦЕНКИ НАСЛВДОВАНШ ШШОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСА ГРИППА ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕКОМБИНАЦИИ 49-60
2.1. Электрофоретический анализ одноцепочечных вирионных РЕК штаммов вируса гриппа 51-56
2.2. Сравнительная характеристика полипептидного состава вирусов, гриппа a/pr/8/34 и
А/Техас/77 56-60
Глава 3. МОЛЖУЛЯРНСЬВТОЛОШЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ СКРЕЩИВАНИИ ВИРУСОВ ГРИППА A/PR/8/34 И А/ТЕХАС/77 61-79
3.1. Биологические свойства родительских и рекомбинантных штаммов 62-69
3.1.1. Антигенная специфичность гемаггліо-тинина и неЁраминидазы 62
3.1.2. Инфекцшнная и гемагглготшщруицая активность в куриных: эмбрионах 62-66
3.1.3. Токсигешость для белых мышей. 66-69
3.2. Электрофоретический анализ РНК родительских и; рекомбинантшх штаммов вируса гриппа. 69-75
3.3, Корреляция между структурой генома реком-бинантов и наследованием или признаков РА и Тм, присущих исходным родительским вирусам. 76-79
Глава 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПРИЗНАКА РА 80-93
4.Г. Анализ, геномов высокорепродуктивных реком-бинантов из скрещивания вируса гриппа a/pr/8/34 (нсжі) с эпидемическими штаммами А/Ленинград/76 (НЗЛ2) ж А/Уфа/77 (НІНІ). 80-84
4.2. Передача признака РА в двух последовательных опытах генетической рекомбинации вирусов гриппа А 84-89
4.3. Получение, низкорепродуктивных вариантов вируса.гриппа и изучение их геномов 89-93
Часть Ш.
Заключение 94-101
Практические рекомендации 102
Выводы I03-IG4
Список литературы 105-125
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение генетической детерминации биологических свойств вируса гриппа является одной из актуальных проблем современной вирусологии. Развитие исследований в этом направлении обусловлено, в частности, необходимостью получения штаммов вируса с заданншли биологическіши своиствагли для вакцинопрофилактики гриппозной инфекции. В настоящее время в практике подготовки вакцинных штаммов используется, в основном, метод генетической рекомбинации, заменивший ранее применявшийся метод длительной адаптации новых вариантов вируса гриппа к развивающимся куриным эмбрионам при пассировании.
Возможность изменения антигенных и ряда других биологических свойств вируса гриппа с помощью генетической рекомбинации была обоснована в 50-х годах экспериментальными работами Burnet и др., однако изучение генетической детерминации этих свойств стало возможным благодаря развитию молекуляряо-биологических методов анализа структуры вируса гриппа / 102,161,162,164,179 / . Так, примене ние метода электрофоретического разделения вирусной РНК в присутствии высокой концентрации мочевины / 91,168 / обеспечило не только возможность установления родительской принадлежности всех восьми фрагментов РНК в геномах рекомбинантов / 102,166,167,179,но и создало условия для выявления корреляций между структурой генома вируса гриппа и такими важными биологическими признаками возбудителя как патогенность для человека и различных животных / 43,165,182, 185 186 / » а также чувствительность к ингибиторам вирус ной репродукции / 11,35,57 /.
Широкое применение в вакцинопрофилактике гриппа рекомбинантных штаммов с высоким уровнем репродукционной активности в куриных эмбрионах, используемых для приготовления инактивированных вакцин и вирусных доагностикумов, обусловило необходимость установления оптимального набора генов, необходимых для реализации признака "репродукционная активность", учитывая, что сведения по этому вопросу в; литературе разноречивы / 60,159,193 / . Вышеуказанные обстоятельства определили актуальность проведения настоящего исследования применительно как к чисто теоретическим аспектам учения о гриппа, так и в связи с насущными задачами подготовки вакцинных и диагностических штаммов вируса гриппа.
Б работе предпринята попытка изучить характер наследования при генетической рекомбинации признака высокой репродукционной активности штаммов вируса гриппа в куриных эмбрионах. В качестве модели были использованы высокорепродуктивные рекомбинанты, а также • низкопродуктивные клоны вируса гриппа, полученные в лаборатории генетики, руководимой Н.Е.Горевым.
Цель и задачи исследования. Непосредственная цель исследований заключалась в изучении характера наследования при генетической рекомбинации таких важных свойств вируса гриппа, как способность к повышенной репродукция в куриных эмбрионах и токсигенная активность для мышей, для чегс потребовалось решить ел едущие основные задачи:
1) выбрать оптимальную модель и метод для изучения интересующих нас биологических признаков вируса гриппа;
2) изучить характер наследования при генетической рекомбинации признака высокой репродукционной активности вирусов гриппа в куриных эмбрионах (РА);
3) определить уровень токсигенности для белых мышей родительских и рекомбинантных штаммов вируса гриппа и выяснить характер ва-сяедования признака токсигенности (Тм) при генетической рекомбинации;
4) сопоставить характер наследования рекомбияантными штаммами признаков РА и Тм со структурными особенностями геномов рекомбинантов.
Научная новизна и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту. На модели оригинального набора рекомбинантных штаммов вируса гриппа А был изучен характер наследования рекомбинантными штаммами признаков токсигенности для мышей (Тм) и высокой репродукционной активности в куриных эмбрионах (РА). В результате генотипирования набора рекомбинантов, наследующих НА іг м от елаботоксигенного родительского штамма были получены данные, подтверждающие влияние генов, кодирующих поверхностные белки вируса гриппа на уровень токсигенной активности изученных рекомбинантов. Кроме того, постоянное присутствие PI, Р2 и М генов от высоко ток сигенного родительского штамма A/PR/8/34 как, в геномах ре-комбинатов, обладающих токсигенной активностью, так. и в геномах нетоксигенных для мышей рекомбинантов, позволило нам исключить вышеперечисленные гены из участия в детерминации признака Тм.
Цри выяснении генетической детерминации признака РА в куриных эмбрионах штаммов вируса гриппа нами впервые была прослежена последовательная передача вышеуказанного признака в двух последовательных опытах генетической рекомбинации. Цри этом удалось выявить достаточно четкую корреляцию между приобретением рекомбинантами способности к повышенной репродукции: в куриных эмбрионах и наследованием ими М-гена от высокорепродуктивного родительского штамма.
Анализ геномов набора рекомбинантов с антигенным профилем НШІ и НЗН2, проведенный дополнительно к вышеуказанным экспериментам, позволил нагл четко показать, что необходимым условием для проявления штаммами высокой репродукционной активности в куриных змбрионах является наличие в их геномах М-гена от высокорепродуктивного родительского вируса.
Выявление коррелятивной связи между М-геном от высокоурожайного родительского штамма в геномах рекомбинантов и признаком РА может быть использовано при отборе высокорепродуктивных рекомбинантов в практике лабораторных исследований и особенно при подготовке штаммов, предназначенных для производства инактивированных гриппозных вакцин и вирусных диагностикушв.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на двух конференциях молодых ученых во ВНИИ гриппа Минздрава СССР (1979, 1981 гг.) и на конференции молодых ученых;в_НИИЭМ им. Пастера Минздрава РСФСР (1982 г.), а также представлены на выставке научно-технического творчества молодежи (ШШ-83) Петроградского района г. Ленинграда, кроме того, результаты исследований были доложены на заседании отдела молекулярной биологии и генетики вирусов (1981 г.), а также на совместном заседании отдела молекулярной биологии и генетики вирусов и отдела этиологии вирусов гриппа и ОРЗ ВНИИ гриппа Минздрава СССР (1983 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы. Оформлено и внедрено 2 рационализаторских предложения.
Выполненная работа является частью плановой тематики научно-исследовательских работ ВНИИ гриппа Минздрава СССР, посвященной молекулярно-биологическому изучшию вирусов гриппа Ой государственной регистрации - 800.72 908).
