Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России Садыкова Галина Кадымовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10.

1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила 10.

1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция 18.

1.3. Генетическая организация и репликативный цикл флавивирусов 25.

1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН 34.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Компьютерный анализ последовательностей ДНК 40.

2.2. Выделение РНК 40.

2.3. Реакция обратной транскрипции 41.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции 41.

2.5. Клонирование кДНК-фрагментов генома 41.

2.6. Приготовление компетентных клеток 42.

2.7. Трансформация плазмидной ДНК 42.

2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле 43.

2.9. Выделение фрагментов ДНК из агарозы 43.

2.10. Секвенирование ДНК 44.

2.11. Сайт-специфический мутагенез ДНК 44.

2.12. Транскрипция вирусной РНК in vitro 45.

Глава 3. Результаты.

3.1. Определение и анализ первичной структуры геномов 19-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных на территории Астраханской области в 2001-2005гг 46.

3.2. Клонирование полноразмерной кДНК-копии российского изолята вируса Западного Нила, относящегося к IV субтипу 67.

Глава 4. Обсуждение результатов 69.

Выводы 74.

Благодарности 74.

Список цитируемой литературы 75.

Приложение 86.

• Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция
• Генетические факторы патогенности ВЗН
• Определение и анализ первичной структуры геномов 19-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных на территории Астраханской области в 2001-2005гг
• Клонирование полноразмерной кДНК-копии российского изолята вируса Западного Нила, относящегося к IV субтипу

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Род Flavivinis семейства Flaviviridae состоит более, чем из 70 вирусов, большинство из которых является арбовирусами, т.е. вирусами, передающимися путем биологической трансмиссии восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками.

Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, включающий в себя млекопитающих, насекомых, птиц и рептилий. Многие из них могут вызывать тяжелые заболевания человека - желтую лихорадку, лихорадку Денге, клещевой энцефалит, японский энцефалит и др. Прототипным вирусом семейства считается вирус жёлтой лихорадки, который и дал название семейству и роду флавивирусов. (Термин "flavi" происходит от латинского слова "flavus" - жёлтый и связан с жёлтым цветом кожи у больных жёлтой лихорадкой.) В большинстве случаев передача инфекции осуществляется через укус переносчика - комара или клеща, что позволяет разделить флавивирусные инфекции на переносимые клещами и комарами, а также заболевания, для которых переносчик не установлен. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами Денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, клещевого энцефалита и Западного Нила. Ежегодно Всемирная Организация Здравоохранения регистрирует более 50 миллионов случаев заболевания лихорадкой Денге, около 200 000 случаев заболевания желтой лихорадкой и около 50 000 случаев заболевания японским энцефалитом. Смертность от заболеваний, вызванных этими наиболее патогенными представителями семейства флавивирусов, варьирует в пределах 5%-30% .

Дополнительным фактором значимости проблем, связанных с флавивирусными инфекциями, становится существенное расширение их ареала. Здесь ярким примером может служить вирус японского энцефалита, который во второй половине XX века широко распространился в Азии, Океании, а в конце 1990-х достиг австралийского континента. Другой хорошо известный пример связан с проникновением в 1999 году и последующим стремительным распространением вируса Западного Нила на американском континенте. Возможность переноса флавивирусов перелетными птицами, их способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, быстрая адаптация к природным условиям обеспечивает формирование новых природных очагов флавивирусных инфекционных заболеваний, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население. Отсутствие на сегодняшний день вирусоспецифических препаратов, эффективных методов лечения, а, нередко, и профилактики заболеваний, вызванных флавивирусными инфекциями, объясняет интерес работников науки и практического здравоохранения к данной проблеме.

Для России наиболее актуальными являются вирус клещевого энцефалита (несмотря на существование эффективной вакцины) и вирус Западного Нила. В нашей стране наиболее активные очаги лихорадки Западного Нила расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь, в дельте Волги, в силу географических и экологических особенностей сформированы чрезвычайно благоприятные условия для поддержания активной циркуляции ВЗН, и почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки.

Особую значимость вирус Западного Нила приобрел после ряда крупных эпидемических вспышек, произошедших в конце 1990-х годов в различных частях света и характеризующихся необычно частыми, для данной инфекции, случаями поражения ЦНС и высокой смертностью. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в

7 Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий (-9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в

1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС. Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно эпидемические вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном (~ 10%) уровне летальности. Вопрос, чем обусловлено серьезное изменение характера патогенности эпидемических вспышек, вызванных в последнее время вируса Западного Нила, остается открытым. Сравнительный и эволюционный анализ первичной структуры геномов различных изолятов ВЗН, поиск и изучение генетических детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства, являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

Настоящая работа была выполнена в рамках комплексного изучения биологии вируса Западного Нила, циркулирующего на территории юга Русской равнины, которое проводится в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с 1999 года. В рамках этого исследования были, в частности, выполнены работы по генетической характеристике российских штаммов ВЗН, вызвавших эпидемии 1999-

2000 гг., созданию новых чувствительных тест-систем для детекции возбудителя, а также работы по мониторингу циркуляции вируса, включающему в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической цепи.

8 Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлась характеристика и изучение генетических свойств популяции ВЗН, циркулирующей на эндемичной территории юга Астраханской области России. В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Установить первичную структуру геномов 18-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. на территории Астраханской области.

2. Охарактеризовать генетические свойства вирусной популяции, циркулировавшей на данной территории в период с 2001 по 2005 гг.

3. Разработать экспериментальную систему для изучения биологических свойств ВЗН методами обратной генетики на основе низкрпатогенного штамма LEIV-Krnd88-190.

Основные положения, выносимые на защиту.

Установлена нуклеотидная последовательность геномов (с 24 н.п. по 10834 н.п. включительно) 18-ти штаммов вируса ЗН, изолированных в 2001-2005 годах в Астраханской области из птиц, комаров и клещей.

Проведена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства.

3. Создана экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, несущей полноразмерную кДНК копию вирусного генома.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIV-

9 Krnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro.

Впервые определена первичная структура генома для 9 штаммов ВЗН, кодирующая все структурные и неструктурные белки, а также нетранслируемые области генома (частично). Для 9 штаммов ВЗН впервые определена первичная структура, кодирующая неструктурные белки вируса, а также 3' -нетранслируемую область (частично).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей исследуемых штаммов выявил их высокую идентичность с астраханскими штаммами Ast99-986 и Ast99-901, вызвавшими эпидемические вспышки в 1999-2000 гг.

Проведен поиск функциональных детерминант вируса, отвечающих за его вирулентные свойства. В частности, показано, что у 6 из 18 штаммов в положении 154-156 а.к. оболочечного белка Е имеется потенциальный сайт гликозилирования NYS, который является одним из ключевых факторов нейроинвазивности вируса в мышах, а три штамма имеют смешанную NYS/NYP позицию. Кроме того, у всех исследуемых штаммов имеется аминокислота пролин в 249-й позиции геликазного домена неструктурного белка NS3, которая, как было показано в опытах in vivo, также отвечает за патогенные свойства вируса Западного Нила.

Данные о первичной структуре вирусов являются важными, как для многих фундаментальных исследований, связанных с происхождением, распространением и эволюцией вирусов, так и практических научных вопросов, связанных с эпидемиологией вирусных инфекций. Разработка мер по предотвращению эпидемиологических заболеваний включает в себя ряд вопросов, связанных с установлением источника и путей распространения вирусной инфекции, а также мониторингом появления новых, более опасных вариантов вируса.

10 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Экология и эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила. /. /. /. Экология вируса Западного Нила.

Рис. 1. Трансмиссивный цикл вируса Западного Нила.

Вирус Западного Нила (ВЗН) является этиологическим агентом лихорадки Западного Нила. Инфицирование человека вирусом ЗН может иметь различные проявления - от бессимптомной инфекции или легкой лихорадки до развития тяжелых форм энцефалитов и менингоэнцефалитов с летальностью до 12-14%. Заражение происходит, как правило, посредством укусов комаров различных видов, хотя описаны случаи заражения при переливании крови, кормлении грудью, трансплантации органов и т.д. Вирус Западного Нила способен размножаться в организме млекопитающих, птиц, земноводных и членистоногих. У животных инфекция протекает, как правило, инаппаратно. Исключение составляют лошади, у которых ЛЗН имеет клиническое течение в виде энцефаломиелита и других неврологических проявлений, а также птицы, являющиеся главным природным резервуаром вируса.

Основной природный цикл вируса ЗН происходит между птицами и комарами, преимущественно рода Culex (рис.1). Вирус Западного Нила был многократно, в различных частях ареала, изолирован от птиц, принадлежащих к различным семействам и отрядам. Главным фактором, определяющим основное значение птиц в циркуляции ВЗН, является их способность развивать высокие, достаточные для заражения комаров, титры виремии в крови. Экспериментальное заражение птиц различных отрядов и семейств позволило выделить среди них виды, особенно восприимчивые к ВЗН, демонстрирующих высокие и продолжительные показатели виремии. Так, например, в исследовании, проведенном в 2003 году (Komar et al., 2003), было показано, что очень высокие (до 12 1оюБОЕ/мл) титры виремии развиваются у семейства врановых (Corvidae). Немного меньшие (до 8 logio БОЕ/мл) титры виремии были отмечены у представителей семейств чайковые {Laridae) и ржанковые {Charaiidae). Еще меньшие, но, однако, достаточные для заражения комаров титры виремии, развивались у птиц семейства голубиные (Columbidae), совиные (Strigidae), дятловые (Picidae). На основании этих данных были выделены пять наиболее важных для циркуляции ВЗН на территории США видов птиц. К ним были отнесены голубая сойка (Cyanocitta cristata), гракл (Ouiscahis quiscida), чечивица (Carpodacus mexicanus), американская ворона (Cowus branchyrhynchos) и домашний воробей (Passer domesticus) (Komar et al., 2003). Среди американских ворон Coi-vus brachyrhynchos, в отличие от европейского подвида С.согопе, наблюдается массовая гибель уже в период развития эпизоотии, предшествующей началу эпидемического периода. Высокая восприимчивость к вирусу Западного Нила, широкая распространенность почти на всей территории страны, а также массовость в населенных пунктах придают этому виду птиц большое эпидемиологическое значение как резервуара в урбанистической циркуляции ВЗН в США. Массовая гибель ворон положена в основу систему раннего оповещения в США о

12 предстоящем обострении эпидемической ситуации. В 2004 году в работе Brault с соавторами показали существенное - до 5 logio БОЕ/мл различие в уровне виремии и смертности (в 8 раз) при экспериментальном заражении Corvus branchyrhynchos штаммом NY99, циркулирующим в настоящее время в США, и генетически близкими штаммами ВЗН из Австралии и Африки (KUN и KEN-3829). Дальнейшие исследования американских авторов (Brault et al., 2007) позволили идентифицировать генетические характеристики штамма NY99, отвечающие, по крайней мере, частично за его повышенные вирулентные свойства in vivo. В общей сложности, в США ВЗН был обнаружен, по крайней мере, в 138 видах умерших птиц. В Европе, в отличие от США, смертность среди птиц, вызванная ВЗН, является редким явлением. Массовая гибель ворон, однако, наблюдалась и во время вспышки ЛЗН в г. Волгограде в 1999 г. Важно отметить, что птицы играют не только роль резервуара ВЗН в природных очагах, но и способны переносить его на огромные расстояния во время сезонных миграций. Причем в процессе миграций происходят тесные контакты между их различными популяциями и видами, а, следовательно, и обмен адаптированными к ним возбудителями во время промежуточных остановок и в местах зимовок.

Млекопитающие, за редким исключением, не играют существенной роли в поддержании циркуляции ВЗН, поскольку титры развивающейся у них виремии недостаточны для заражения следующего пула комаров. Об этом свидетельствуют и экспериментальные данные по их заражению. Это относится и к диким, и к домашним животным. Среди домашних животных, исключая птиц, только у лошадей возникает выраженная клиническая картина в форме лихорадки с явлениями менингоэнцефалита и частым (до 30% и более) смертельным исходом. Определенное значение в экологии вируса могут играть земноводные. В частности, озерные лягушки Rana ridibunda могут сохранять вирус, и их донорская возможность для комаров рода Cidex Pipiens подтверждена рядом исследователей.

Главную роль переносчиков ВЗН играют комары и, возможно, аргасовые и иксодовые клещи. Основное эпидемиологическое значение имеют комары, по крайней мере, 43 видов из 11 родов, преимущественно рода Culex. Естественно, что в различных экосистемах то или иное значение в эпизоотологии и эпидемиологии имеют разные виды комаров. В США вирус выделен от многих видов комаров родов Culex, Coquillettidia, Culiseta, Aedes (Andreadis et. al., 2001; Bell et. al., 2006; Hayes et.al., 2005). Одни виды рода Culex (C.pipiens, C.restuans) являются абсолютными кровососами птиц, обеспечивая циркуляцию вируса в природных и антропогенных биоценозах, другие (C.salinarius) пьют кровь и у птиц, и у млекопитающих (в том числе и у человека), являясь, поэтому эпидемиологически значимыми переносчиками (Molaei et. al., 2006). Во время эпидемической вспышки в

1996 г. в Румынии основное эпидемиологическое значение в антропогенных биоценозах имели комары Culex pipiens. В Эфиопской зоогеографической области (Египет, ЮАР, Израиль) основную роль играют C.univittatus, что показано в полевых наблюдениях и при экспериментальном изучении.

Несколько меньшее значение в этом регионе имеют С. pipiens и C.neavei.

Во Франции выявлена важная роль C.modestus в качестве переносчика. В

Израиле экспериментально установлена эффективная передача вируса комарами C.pipiens molestus. Этот вид, наряду с высокой агрессивностью по отношению к человеку, обладает также выраженной орнитофильностью и может иметь серьезное эпидемическое значение в городах, где он способен размножаться в подвалах домов. В Индии и Пакистане основными переносчиками являются комары комплексов С. vishnui, С. quinquefasciatus,

С. Fatigans.. Комары рода Culex перезимовывают в стадии имаго. ВЗН был выделен в США в зимнее время от напитавшихся осенью кровью самок. Это один из возможных, наряду с сохранением вируса в клещах, механизмов сохранения вируса в зимнее время и создания устойчивых природных и антропогенных очагов инфекции.

В России в очагах ЛЗН в Северо-Западном Прикаспии, территория которого включает в себя Астраханскую область и юг Волгоградской, включая Волгоград, число видов комаров - потенциальных переносчиков ВЗН - достигает 15-ти, из них вирус ЗН обнаружен в 6 видах (Lvov et al., 2004, Fyodorova et al., 2006). Наиболее важное эпизоотическое значение имеют комары вида Сх. modestus, они же могут играть важную роль в эпидемических процессах, особенно в открытых урбанизированных биотопах. Комары Сх. pippiens являются основными переносчиками вируса в популяциях птиц и между популяциями птиц и млекопитащих. Определенное эпизоологическое значение могут иметь также комары Coq.richiardii и An. messeae, особенно в годы их высокой численности (Львов и др., 2008; Федорова, 2007).

ВЗН неоднократно выделяли от иксодовых и, особенно часто, аргасовых клещей. Их роль в сохранении вируса в межэпидемический период доказана многократно в полевых и экспериментальных исследованиях. Вирус был выделен в Египте от клещей Argas hermanii, собранных зимой. Показано возникновение стойких очагов на юге СССР за счет адаптации вируса к клещам Ornithodoros coniseps, обитающих в гнездовьях чаек и крачек в бассейне Каспийского моря (Львов и др., 1989).

Лихорадка Западного Нила является спорадическим, природно-очаговым заболеванием. Возникновению эпидемической ситуации часто предшествует эпизоотия среди домашних или синантропных животных, которая, в свою очередь, развивается после эпизоотии среди диких животных. Заболевания среди диких животных, как правило, остаются незамеченными.

1.1.2. Эпидемиология вируса Западного Нила.

Впервые вирус ЗН был изолирован в 1937 году в провинции Западный Нил в Уганде от больного с легкой лихорадкой. В течение многих лет после описания ВЗН спорадическая заболеваемость и некрупные вспышки ЛЗН отмечались в Африке, на Ближнем Востоке и Азии. Первые значительные

15 вспышки ЛЗН были зарегистрированы в 1950-1954 годах и в 1957 году в Израиле, а также в 1974 году в ЮАР, когда заболело около 3000 человек. Летальных исходов во время этих вспышек зарегистрировано не было. Случаи менингоэнцефалита, вызванные вирусом ЗН, впервые наблюдались в 1957 году во время вспышки в Израиле (среди пожилых пациентов), а позднее в Индии (среди детей) со смертельными исходами.

Начиная с 1990-х г.г. характер патогенности эпидемических вспышек ЛЗН резко изменились в неблагоприятную сторону. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий для ЛЗН (около 9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Эпизоотия сопровождалась высокой смертностью птиц и повторилась в 1998 году. Там же в этот период отмечались и многочисленные случаи энцефаломиелита, вызванного ВЗН, среди лошадей. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС (энцефалит). Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном уровне летальности. Здесь следует особо отметить, что до 1999 года американский континент был свободен от вируса. Однако уже через год возник очаг во Флориде, а к 2003-2004 году практически вся территория США, Южной Канады и Латинской Америки стала эндемичной с высоким для данной инфекции уровнем заболеваемости и смертности. По данным Center for Disease Control and Prevention () за 1999-2008 гг. в США переболело около 29 тыс. человек, из которых 1124 умерло. Максимум заболеваемости был отмечен в 2003 году - в США 9862 подтвержденных случая, из них 241 - с летальным исходом, в Канаде -1335 случаев, из них 10 летальных. В 2006 году ВЗН был обнаружен на территории Аргентины.

В России спорадическая заболеваемость ЛЗН фиксировалась еще с середины 60-х годов прошлого столетия. В 1991-1996 гг., когда заболеваемость носила спорадический характер, в Астраханской области было зарегистрировано 10 случаев заболевания ЛЗН. В 1999 году было выявлено около 600 подтвержденных случаев, причем помимо Астраханской области, впервые больные были зарегистрированы также в Волгоградской области и в Краснодарском крае. Позднее, заболеваемость ЛЗН фиксировалась и в 2001-2002 гг., но в меньшем масштабе (Петров и др., 2001; Ковтунов и др., 2003). Новая ограниченная вспышка ЛЗН была отмечена в Астраханской области и в 2005 году (около 70 случаев заболевания).

1.1.3. Географическое распространение вируса Западного Нила.

До 1999 года ареал ВЗН был ограничен восточным полушарием. Однако сейчас его ареал занимает огромные территории в пределах экваториального, тропического и умеренного (южная часть) климатических поясов в Африке, Европе, Америке, Азии, Океании и Австралии. На рис. 2 показаны ареалы вирусов антигенного комплекса я понского энцефалита. Из него, в частности, видно, что ВЗН является в настоящее время одним из самых широко распространенных флавивирусов.

Кроме того, несмотря на близкие антигенные свойства, ареалы вирусов серокомплекса японского энцефалита перекрываются. Так, вирус Западного Нила в Индии сосуществует с вирусом японского энцефалита, в Австралии с вирусом энцефалита долины Мюррей, а в Северной Америке - с вирусом энцефалита Сент-Луис.

Рис.2. Географическое распространение вирусов энцефалита Сент-Луис (SLEV), Западного Нила (WNV), Японского энцефалита (JEV) и энцефалита долины Мюррей (MVEV).

На территории стран бывшего СССР ареал вируса ЗН охватывает Молдавию, Украину, Белоруссию, юг европейской части России (степи и лиственные леса), в Западной Сибири - Алтайский край (степи и лесостепь). Кроме того, циркуляция вируса зафиксирована в Армении, Азербайджане, Грузии, Казахстане, Таджикистане, Киргизии, Узбекистане и Туркменистане (Булычев и др., 1981; Виноград и др., 1982; Войнович и др., 1981; Гайдамович и др., 1972; Сиденко и др., 1973; Сидорова и др., 1973). Заболеваемость ЛЗН за последние 20 лет регистрировалась в Казахстане и Среднеазиатских республиках, на Украине, в Азербайджане. Очень велик риск заражения в пустынных частях Поволжского района, особенно вдоль долин крупных рек. Наиболее активные природные очаги ВЗН находятся в дельте Волги, вдоль ее низовий до впадения в Каспий.

Вопрос о механизмах изменения ареала вирусов остается одним из чрезвычайно сложных вопросов эпидемиологии из-за влияния множества причин самого различного происхождения - как природных, так и связанных с деятельностью человека. Так, например, вопрос, каким

18 именно образом вирус Западного Нила проник на американский континент, остается открытым. Однако современная возможность быстрого получения и анализа генетической информации, наряду с развитием методов молекулярной эпидемиологии, позволяет надежно установить эпидемиологическую связь и эволюционные отношения между разными штаммами вируса. Так, анализ первичной структуры штаммов ВЗН, выделенных на территории Израиля в 1997 - 2001 гг., выявил их очень высокую идентичность штаммам, изолированным в 1999 г. в Северной Америке, в связи с чем Ближний Восток рассматривают как наиболее вероятный источник интродуцированного в США вируса (Lanciotti et. al., 1999).

1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция.

1.2.1. Происхождение и эволюция вируса Западного Нила.

Род Flavivims насчитывает в настоящее время 15 антигенных комплексов. Большинство вирусов, вызывающих энцефалиты, относятся либо к антигенному комплексу японского энцефалита, либо к антигенному комплексу клещевого энцефалита. Вирус Западного Нила относится к антигенному комплексу японского энцефалита, куда помимо ВЗН входят еще 15 вирусов. Часть флавивирусов передается комарами, некоторые клещами, а ряд вирусов, включая ВЗН, обладает способностью к траншиссивной передаче и комарами, и клещами.

Результаты филогенетических исследований и эволюционного анализа свидетельствуют о том, что вирусы, переносимые клещами, вирусы, переносимые комарами и большинство вирусов без переносчика или переносчик для которых не установлен, относятся к трем различным эволюционным линиям, которые образовались на ранних стадиях эволюции представителей рода Flavivims.(ZanotXo et al., 1996;

19 Marin et. al., 1995; Kuno et.al., 1998) Предполагается, что все три линии произошли от общего вируса-предшественника, циркулирующего в Африке около 10 000 лет назад, причем первой (приблизительно 3000 лет назад) произошла дивергенция вирусов без переносчика, затем вирусов, переносимых клещами и, в последнюю очередь, произошла дивергенция вирусов, переносимых комарами. Было также показано, что скорость эволюции арбовирусов ниже, чем у вирусов без переносчика. Кроме того, отношение числа несинонимических замен в геноме к синонимическим у вирусов, циркуляция которых связана с членистоногими и позвоночными, выше. Это означает, что на арбовирусы оказывается более выраженное селективное воздействие.

С помощью эволюционного анализа протяженных участков геномов флавивирусов было установлено, что скорость эволюции вирусов, переносимых комарами, выше скорости эволюции вирусов, переносимых клещами почти в два раза. При этом "комариные" и "клещевые" вирусы существенно различаются топологией филогенетического дерева. Вирусы, переносимые клещами, имеют асимметричное филогенетическое дерево, для которого характерны постоянные появляющиеся в процессе эволюции ответвления, причем количество дочерних ветвей значительно больше, чем можно было бы ожидать на основе математического ожидания. Филогенетическое дерево вирусов, переносимых комарами, имеет более сбалансированную топологию с меньшим количеством дочерних ветвей, причем большая часть из них возникла в последнее время (около 200 лет назад). Отношение количества несинонимических замен к количеству синонимических у "клещевых" вирусов выше, чем у "комариных", при этом у "клещевых'⁷ вирусов чаще встречаются аминокислотные замены на биохимически близкие. Это указывает на то, что флавивирусы, переносимые клещами, испытывают большее селективное воздействие по сравнению с вирусами, переносимыми комарами. Таким образом,

20 случайное появление жизнеспособных вариантов в популяции у "клещевых" вирусов является менее вероятным событием, чем у "комариных^,\

Важнейшим фактором эволюции вирусов, независимо от их характеристик, является хозяин. Смена основного хозяина часто приводит к появлению новых эпидемически важных вариантов вируса, вирулентных для нового хозяина. Для успешной циркуляции в природе арбовирусы должны эффективно репродуцироваться в таких отдаленных хозяевах, как позвоночные-прокормители и членистоногие-переносчики. Сопоставление филогенетических данных с данными экологических исследований позволило установить, что главным фактором эволюции флавивнрусов на уровне вида является переносчик (Marin et. al., 1995; Kuno et. al., 1998; Gaunt et al., 2001). Из рис.3 хорошо видно деление членов всего рода Flavivirus на три основных кластера, связанных с типом переносчика. В свою очередь, кластер, объединяющий все флавивирусы, переносимые комарами, подразделяется на два субкластера, связанные либо с комарами рода Culex (среди них вирусы ЯЭ, энцефалита Сент-Луис и Западного Нила), либо с комарами рода Aedes (среди них, например, вирусы желтой лихорадки и вирус Денге), причем субкластер "Culex" сформировался уже после отделения ^uкомариных" вирусов от "клещевых" и вирусов без переносчика. Доминирующая роль комаров рода Aedes и Culex в циркуляции флавивнрусов объясняется их широким распространением, а также большим видовым разнообразием. Род Aedes насчитывает 975 различных видов, a Culex - 769, что в сумме превышает численность всех видов комаров, относящихся к остальным родам (1522).

Из сопоставления филогенетических и экологических данных, представленных на рис.3, для вирусов, переносимых комарами, можно также заметить связь между переносчиком вируса и характером вызываемых им заболеваний. Так, большинство вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки, переносятся комарами рода Aedes, а вирусы, способные вызывать энцефалиты - комарами рода Culex.

WN KUN MVE ALF JE AROA IGU

КОК STR

2UBA6 IT NTA TMU ТНСНг ILH ЦОС у BIRD ^r Old World RODENT? Now Worid Old Wortd New World

ОЕЫЛ. Human J & primate Africa _p "J"" Primate ^FO' ^ (& human) (& human) J SEABIRD Old World Otd World New World RODENT New Wodd Culex Clade Encephalitic disease Aedes Clades Haernorrhagic disease Tick-> borne Clade No-known vector Clade

Рис.3. Филогенегнческое дерево представителей рода Flavivirus, совмещенное с экологическими данными. Иллюстрация из работы Gaunt M.W. et al., 2001.

22 1.2.2. Молекулярная эпидемиология вируса Западного Нила До недавнего времени все известные штаммы ВЗН, включая индийские, подразделялись на два генотипа, а австралийский геновариант вируса Кунджин и вовсе считался отдельной нозологической единицей. Однако по мере накопления данных о первичной структуре геномов различных изолятов ВЗН, эта филогенетическая картина подверглась существенному пересмотру. Во-первых, вирус Кунджина был признан 1Ь-субтипом вируса Западного Нила. Во-вторых, были открыты изоляты ВЗН, образующих, по крайней мере, еще два отдельных самостоятельных генотипа - Рабенсбург 97-103 из Центральной Европы и LEIV-Krnd88-190 из России (Bakonyi et. al., 2005; Прилипов и др., 2004). И, наконец, индийские штаммы - новые и уже известные - были отнесены к отдельному, пятому генотипу ВЗН (Bondre et. al., 2007). Обобщая сказанное, на рис. 4 представлена современная картина генетического родства между различными штаммами ВЗН. Таким образом, к настоящему моменту известно, по меньшей мере, пять различных генотипов вируса. Количественные оценки дивергенции между ними приведены в таблице 1. Нуклеотидная дивергенция между различными генотипами вируса ЗН варьирует в пределах 20-25% , а внутри отдельных генотипов - 5-15%. ! і elide la) 97.68 r 0.10

Таблица 1. Нуклеотидное сходство между различными генетическими линиями вируса Западного Нила. Данные взяты из работы V.P.Bondre и соавторов, 2007.

В целом, принадлежность к той или иной генетической линии коррелирует с географическим распространением вируса. Так, субкластер lb первой группы содержит только изоляты из Австралии (Кунджин), штаммы из Южной Африки и Мадагаскара относятся ко второй группе, а все изоляты из Индии объединяются в пятом генотипе. Два изолята, LE1V-Krndl90 (российский изолят из Краснодарского края) и Rabensburg 97-103 (из Центральной Европы), образуют отдельные генетические линии вируса. Однако полной корреляции между генотипами и их географическим распространением все же не наблюдается. По-видимому, это связано с тем, что важную роль в циркуляции ВЗН играют птицы, способные к передаче вируса на длительные расстояния, иногда на другие континенты. Так, субкластер 1а первой группы содержит изоляты самого различного географического происхождения - из Африки, Европы, Ближнего Востока и Северной Америки.

На территории России зафиксирована циркуляция, по крайней мере, трех различных генотипов ВЗН - 1, 2 и 4. Проведенные комплексные вирусологические и молекулярно-генетические исследования показали абсолютное доминирование 1 -го генотипа. (Львов и др., 2004; Прилипов и др., 2004).

С lade 1a NY99-Eah6 ВСГ8Г

1^99-Гаттэо382-в9 NJ200OMQ6488 MD 2000-OW265 Nv 20CKKrow325e N^v 200

IS-98-ST0 I TVPS533 I -<Лу99-90Г> P8H001 Morocco-04 05 PsAnOOf L My-1998-Eq -Moikco-98-111 K\3829 RO97-S0 VLG-4-1999 LEPV-Vlg99.27889 I LE!V-V400-2792< ІПФ872698Н Chm-01 686568 і unm-ui

4 ilrtl 6865* wo iEg-101 Clade 1b - Kunjirt —Ssraf«!0 ..WNFCOWeng lei-Bass _{Л }} Lineage 1 Lineage 2 Rai>ens&urg97-t03 G16910 r— 821622 G2267 Sv'89/ 8С4Э94 W2«5 022869 804987 80755 80776 80829 W78 — 80235 LBV-Krr

Рис.4. Филогенетический анализ различных изолятов вируса Западного Нила, выполненный по полной нуклеотиднои последовательности генома. Данные взяты из работы Bondre et.al., 2007.

25 1.3. Генетическая организация и репликативныи цикл флавивирусов.

1.3.3. Общее строение вирусного генома.

Флавивирусы - это маленькие, размером около 45 нм, РНК-содержащие вирусы с липидной оболочкой. Вирусные частицы состоят из нуклеокапсида размером примерно 30 нм, сформированного вирусным капсидным белком и вирусной РНК, и липидного бислоя, в который погружены два других структурных белка вируса -мембранный М и оболочечный Е.

Однонитевая позитивная РНК вируса длиной примерно 11 000 нуклеотидов кодирует одну открытую рамку считывания, которая фланкирована 5' и 3' - нетранслируемыми областями (Рис.5). Геномная РНК инфекционна и в клетке функционирует как мРНК. Её 5'-нетранслируемая область кэпирована по первому типу, начинается с консервативного динуклеотида AG и содержит примерно 90-130 нуклеотидов; 3'- нетранслируемая область неполиаденирована, варьирует от 430-760 нуклеотидов и заканчивается консервативным динуклеотидом CU (Rice et. al., 1986; Chambers et. al., 1990). 5'- и 3'-нетранслируемые области играют очень важную роль в процессе репликации флавивирусного генома. В них содержатся консервативные элементы первичной и пространственной структуры РНК вируса, специфичные для различных серологических комплексов. Функциональная значимость этих элементов и их потенциальное взаимодействие с клеточными и вирусными белковыми факторами были вначале постулированы на основе анализа первичной структуры флавивирусных геномов. Позднее, с развитием методов обратной генетики функциональный анализ таких элементов подтвердил эти предположения (Brinton et. al, 1986; Rice et. al., 1986; Lindenbach and Rice, 1997; 1999). Structure* Nonstructural

Рис. 5. Организация структуры генома флавивирусов. Открытая рамка считывания фланкирована 5'- и 3' - нетранслируемыми областями. 5' - конец геномной РНК кэпирован. Показаны вирусные белки, образующиеся в результате протеолитического расщепления полипротеина-предшественника.

Условная схема репликации флавивирусов изображена на рис. 6. Флавивирусы проникают в клетку путем эндоцитоза, опосредованного рецепторным взаимодействием пока не идентифицированного мембранного белка клетки-хозяина с вирусным оболочечным белком. Внутри эндосомы под влиянием рецепторного взаимодействия и/или более кислой среды запускается механизм конформационного изменения вирусного оболочечного гликопротеина Е, в результате которого пептид слияния, ранее скрытый внутри белка, экспонируется наружу и вставляется в липидную оболочку эндосомальной везикулы. После этого происходит слияние вирусной и эндосомальной мембран, в результате которого вирусный нуклеокапсид "раздевается" и оказывается в цитоплазме клетки-хозяина. Предполагается, что именно пептид слияния играет главную роль в процессе слияния мембран, хотя не исключено, что имеются и другие необходимые факторы, обеспечивающие полное конформационное взаимодействие липидных бислоев.

(.mediated Virion (parental} Virions (progf«>)

Рисунок 6. Условная схема, иллюстрирующая цикл репликации флавивирусов.

1.3.2. Трансляция вирусного генома.

Трансляция генома приводит к образованию полипротеина- предшественника длиной примерно 3400 аминокислот, из которого, в результате ко- и посттрансляционного расщепления клеточными и вирусной протеазами, образуются индивидуальные вирусные белки. Структурные белки С, капсидный белок; ргМ/М, (пре)мембранный белок и Е, гликопротеин внешней оболочки расположены в N-концевой части полипротеина-предшественника и занимают примерно 25% всей открытой рамки считывания. Оставшиеся 75% кодируют неструктурные белки: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5. Хотя структурные и неструктурные белки образуются из одного полипротеина-предшественника, с некоторыми ограничениями можно считать их функции независимыми. Структурные белки отвечают за формирование и сборку вириона, а неструктурные - за репликацию вирусного генома. Это, в частности, приводит к тому, что структурные белки ргМ и Е, экспрессированные отдельно, способны самостоятельно формировать рекомбинантные вирусоподобные частицы (без нуклеокапсида) с идентичной оригинальной структурой и аналогичными рецепторными и фузионпыми свойствами. С другой стороны, геном вируса, лишенный структурной части, способен к самостоятельной успешной репликации в клетке и упаковке in trans вирусных частиц. Другим важным практическим следствием является возможность создания химерных, или гибридных, флавивирусных частиц, у которых структурная (как правило, ргМ и Е) и неструктурная части принадлежат разным вирусам. Такой подход используется, в частности, при создании флавивирусных вакцин.

В клетке полипротеин-предшественник ассоциирован с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с помощью гидрофобных участков в некоторых вирусных белках. Эти гидрофобные участки, расположенные на С-концах белков М, Е и NS4A, на N-концах белков

29 NS2A и NS4B и в центральной части белка С, "заякориваются" в мембране ЭПР, в результате чего полипротеин-предшественник занимает в клетке сложное пространственное положение (Nowak et. al., 1989; Yamtshikov and Compans, 1993).

1.3.3. Процессинг и биологические функции неструктурных белков.

Процессинг полипротеина-предшественника является сложным, регулируемым процессом с участием вирусной и клеточных протеаз. Выщепление неструктурных белков, в основном, осуществляется в клеточной цитоплазме вирусоспецифической протеазой, расположенной в N-концевом домене белка NS3. Исключения составляют сайты NS1-NS2A, который расщепляется пока неизвестным ферментом, и NS4A-NS4B, который служит мишенью для клеточной сигнальной пептидазы, однако его расщепление происходит эффективно лишь после разрезания вирусной протеазой внутреннего сайта в белке NS4A. Такой механизм регуляции каталитической активности сигнальной пептидазы является необычным и описан пока только для процессинга флавивирусных белков. Выщепление самой вирусной протеазы (по сайтам NS2B-NS3 и NS3-NS4A) происходит автокаталитически. Показано, что она является трипсино-подобной сериновой протеазой с аминокислотным мотивом His51-Asp75-Serl35 в функциональном активном центре, а гидрофильный домен белка NS2B служит кофактором ее каталитической активности. Помимо протеазной активности, за которую отвечает N-концевой домен, белок NS3 проявляет еще, как минимум, три биологических активности, выступая как геликаза, нуклеотидтрифосфатаза и РНК 5'- трифосфатаза, за которые отвечает его С-концевой домен.

Неструктурный белок NS1 (46 кДа) - вариабельный гликозилированный протеин, который существует в клетке как димер, а также может секретироваться из инфицированных клеток млекопитающих, но не насекомых, в гексамерной форме. Растворимые формы белка NS1 известны достаточно давно в качестве комплемент-связывающего антигена (Brinton et al. 2002а). Внутри инфицированных клеток NS1 обнаруживается в ассоциации с двухцепочечной репликативной формой вирусной РНК (Brinton et al., 2002 b.) Основная известная функция NSl - подавлять выработку интерферона (ИФН) инфицированной клеткой путем ингибирования TLR3' - опосредованной активации фактора 3 (IRF3) регуляции ИФН (Scholle F et al., 2005; Wilson et al., 2008; Kyung et al. 2006). Таким образом, NSl играет роль "усилителя вирулентности" при флавивирусных инфекциях. Мутации, снижающие уровень гликозилирования NS1, приводят к снижению вирулентности, а полная отмена гликозилирования - к неустойчивой репродукции вируса и появлению множественных дополнительных мутаций (Crabtree et al., 2005). NSl способен вызывать выраженный протективный эффект при иммунизации животных (Lin et al., 1998; Lin et al., 2008).

Неструктурный белок NS2A (22 кДа) обладает выраженной гидрофобностью, имеет трансмембранную локализацию и, по-видимому, участвует в сборке вириона (Leung et al., 2008; Liu et al., 2006).

Неструктурный белок NS2B (14 кДа), как уже упоминалось выше, играет роль кофактора вирусной протеазы NS3. Минимально необходимым фрагментом белка, способным осуществлять эту функцию, является центральный гидрофильный участок протяженностью 40 аминокислотных остатков (Leung et al., 2001). Фланкирующие этот участок гидрофобные домены модулируют связывание комплекса NS2B-NS3 с мембранами. Накопление в этих доменах мутаций, повышающих гидрофильность, ведет к снижению вирулентности (Brinkworth et al., 1999).

Неструктурный белок NS4A (ІбкДа) в инфицированной клетке колаколизован с NS1 и двухцепочечной репликативной формой

31 вирусной PFLK, модулируя снижение выработки ИФН хозяйской клеткой и репликативной активности вируса (Lindenbach et al. 1999).

Неструктурный белок NS4B (27 кДа) имеет совместную локализацию в инфицированной клетке с NS3 и двухцепочечной репликативной формой вирусной РНК. Наряду с NS4A, белок NS4B способен подавлять выработку интерферона инфицированной клеткой. Показано, что мутация 249 Е -> G на С-конце ("заякоренном" в мембрану эндоплазматического ретикулума) NS4B приводит к снижению репликативной активности вируса и возникновению вблизи частично компенсирующих мутаций (Puig-Basagoiti et al., 2007) .

1.3.4. Репликация вирусного генома.

Процессинг неструктурных белков приводит к репликации вирусного генома, которая осуществляется в две стадии. На первой стадии образуется негативная цепь РНК, комплементарная исходной (+)РНК вирусного генома. Эта негативная цепь сохраняется и используется в качестве матрицы для наработки новых положительных РНК-цепей. Синтез РНК осуществляет решшкативный комплекс, состоящий из вирусных и, вероятно, клеточных белков. Главную роль в этом комплексе играет самый большой (103 кДа) вирусный белок NS5, С-концевой домен которого обладает свойствами РНК-зависимой РНК-полимеразы. Помимо этого, N-концевой домен белка NS5 обладает функцией метилтрансферазы и отвечает за образование 5-сар структуры, необходимой для стабилизации и успешной трансляции эукариотической РНК. Обе эти функции были сначала постулированы на основе анализа аминокислотной последовательности белка NS5. Делеции в N- и С-участках NS5 блокируют репродукцию вируса (Khromykh et al., 1999)

Детально механизм синтеза вирусной РНК изучен пока недостаточно. Известно, однако, что очень важную роль в этом процессе играет взаимодействие некоторых консервативных

32 структурных элементов вирусной РНК, расположенных вблизи ее 5' и 3' - концов.

5' UTR«a р^гис1»^га' Nonstructural о₃, _иш CapJ2-l С ргМ Е INS1 NS2a NS2b NS3 NS4a NS4b NSS Ht*L / ' - ^-^---^^ \ / ~> '—TT^ 40 . r: . »

A—UQ 4Aj3₅ ,4s .,10 -)00 ">"ga Uoh-3' G C--CUGUCAAUAUGCUA-/fAA^CAGCAOAUUGACAC -«0 m7GpppAm _{5>cs 3}._Сд,

Рис.7. Элементы структуры вирусной РНК, вовлеченные в ее псевдоциркуляцию и репликацию.

Показано, что для псевдоциркуляции и успешной репликации вирусной РНК, необходимы, в частности, два вида таких удаленных in cis взаимодействий - между комплементарными участками 5'CS - 3'CS и 5'UAR-3'UAR (рис. 7.) Удаление этих участков, подавление их функций с помощью антисмысловых олигомеров или нарушение их взаимодействия у мутантных вирусов приводило к отсутствию репликации (но не трансляции) вирусной РНК (Ко et. al., 2003; Zhang et. al., 2008). Кроме того, важную роль в процессе репликации генома играет сам 3'- концевой участок РНК вируса (рис.8), формирующий вторичную структуру, чрезвычайно консервативную для флавивирусов и взаимодействующий с эукариотическим фактором элонгации транскрипции eEFIA (Blackwell et. al., 1997). G L А GCCG А ^й 1111 _u S« ₅'₀ C-G v₃₀

С —G С —G G—С A—U С —G C—G 60-A —U A G-20

С — G A — U С —G U —A С —G U —A С A 70-G— C-10

А i*""* G С С U _л U—А

А у—с

А _ JZ

6/Чї I G— С U„/ Ga-u

3' end of genome

Рис.8. Вторичная структура участка 3'SL (stem loop), участвующего в репликации вирусного генома.

1.3.5. Образование зрелых структурных белков и сборка вириона.

Образование зрелых структурных вирусных белков и сборка вириона происходят поэтапно, с образованием промежуточных белковых комплексов и незрелых вирусных частиц. Как и в случае с NS4A-NS4B, эффективное расщепление клеточной сигнальной пептидазой сайта С- ргМ регулируется активностью вирусной протеазы, которая сначала разрезает белок С по его внутренней последовательности. После отщепления клеточной сигнальной пептидазой N-концевых сигнальных последовательностей белков ргМ, Е и NS1 в полостях эндоплазматического ретикулума, ргМ и Е образуют нековалентно связанные гетеродимеры, которые встраиваются в незрелые вирусные частицы. Показано, что образование таких ргМ/Е гетеродимеров играет важную роль в правильной укладке и транспорте белка Е. Далее

34 незрелые вирусные частицы, состоящие из вновь синтезированной геномной РЫК, капсидного белка С, и ргМ/Е-гетеродимеров, транспортируются из клетки через транспортную сеть аппарата Гольджи. В процессе этого транспорта происходит гликозилирование белков ргМ и Е , после которого клеточная протеаза фурин разрезает ргМ с образованием зрелой структурной формы мембранного белка М. Такое созревание мембранного белка дестабилизирует общую структуру ргМУЕ-гетеродимера и приводит к его конформационной перестройке, в результате которой образуются гомодимеры оболочечного белка Е, входящие в состав зрелых вирусных частиц. Созревшие вирионы "отпочковываются" от клетки, высвобождаясь во внеклеточную среду путем экзоцитоза.

1.4. Генетические факторы патогенності! ВЗН.

Флавивирусы относятся к нейротропным возбудителям, способным вызывать у человека лихорадки и энцефалиты разной степени тяжести. Классической моделью для изучения патогенеза вызываемых ими заболеваний являются новорожденные и взрослые мыши нескольких линий. Обычно проявление патогенности флавивирусов на мышах тесно связано с возрастными факторами, характеризующими зрелость защитных систем организма, в первую очередь ИФН. Система интерферона обеспечивает состояние невосприимчивости организма к вирусам и является важнейшей составной частью врожденного иммунитета. Активация генов системы ИФН и синтез антивирусных цитокинов приводит к усилению адаптивного и гуморального иммунитета. На специальных линиях мышей, дефектных по ИФН-зависимым генам, при многих вирусных инфекциях показана высокая значимость системы ИФН в развитии заболеваний.

Флавивирусы (ВЗН, вирус японского энцефалита, вирус Денге и др.) нарушают клеточный механизм индукции ИФН-зависимых генов,

35 действуя на активацию сигнальных факторов транскрипции STAT (Guo et al., 2005; Ho et al., 2005). В роли антагонистов ИФН-сигналов выступают неструктурные белки флавивирусов NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 (Best et. al., 2005; Lin et. al, 2006; Liu et. al., 2006; Wilson et. al., 2008; , Эти вирусные белки, взаимодействуя с тирозиновыми киназами Jakl и Тук2, препятствуя их фосфорилнрованию. Вызываемый флавивирусами блок активности системы действия ИФН на этапе передачи сигналов к антивирусным клеточным генам обеспечивает необходимые условия для вирусной репродукции (Lin et al., 2006; Liu et al., 2006). Гуморальный иммунитет является важным компонентом в системе защиты организма хозяина от вирусной инфекции. Дефектные по производству В-лимфоцитов линии мышей погибали при инфицировании ВЗН, но выживали-при пассивной иммунизации. Главной мишенью нейтрализующих антител является оболочечный белок Е. Согласно данным рентгеноструктурного анализа» белок Е является димером, каждый мономер которого состоит из трех структурных единиц, (рис. 9). Домен I является центральным, несет основную структурную нагрузку, имеет форму Р-складчатой глобулы, содержит антигенные эпитопы и сайт гликозилирования. Домен II содержит пептид слияния высоко консервативный для флавивирусов DRGWGNGCGLFGK и является рН-лабильным: его конформация изменяется при понижении рН, после чего происходит слияние вирусной и клеточной мембран. Домен III является иммуноглобулиноподобным и содержит сайт связывания с клеточным рецептором, а также эпитопы для вируснейтрализующих антител. (Beasley et. al., 2002; McMinn, 1997).

Сайт потенциального N-гликозилирования в домене I, находящийся в а.к. 154-156 белка Е имеет важное значение для патогенных свойств вируса. У представителей ВЗН, относящихся к разным генетическим линиям, соответствующие аминокислотные позиции очень вариабельны

36 - NYP, SYS, KYS и т.д. У ряда штаммов, относящихся ко второму и четвертому генотипу, в этом месте наблюдается деления аминокислот 154-156 (Berthet et. al., 1997; Chambers et. al., 1998).

1 52 FL 132 198 282 299 400 501 A — Г і i^—і '—i^^—— і

Рис. 9. Схематичная трехмерная структура отдельного мономера оболочечного белка Е ВЗН. Показан олигосахарид, связанный с аспарагином в а.к. позиции 154. Три домена белка изображены разным цветом. Домен слияния (fusion loop) выделен оранжевым цветом, 6 дисульфидных мостиков - зеленым. Иллюстрация взята из работы Kanai R., 2006.

В опытах in vivo было показано, что дегликозилирование белка Е в штамме ВЗН, относящемся к первому генотипу, приводило к аттенуации нейроинвазивности, но не нейровирулентности в мышах (Beasley et. al., 2002). Однако некоторые штаммы ВЗН, также относящиеся к первому генотипу и гликозилированные по белку Е, аттенуированны к нейроинвазивности в мышах (Chambers et al., 1998; Halevy et al., 1994). Кроме того, описаны случаи энцефалита у людей и животных, вызванные южноафриканскими штаммами ВЗН, относящимися ко второму генотипу с негликозилированными вариантами белка Е. (Botha et al., 2008). Таким образом, связь между гликозилированием белка Е и нейроинвазивным фенотипом вируса не является взаимно-однозначной. По-видимому, существуют и другие генетические факторы, отвечающие за патогенные свойства вируса, в том числе нейроинвазивные и нейровирулентные.

Дегликозилирование белка Е также влияло на сборку вирусных частиц и уменьшало способность вируса реплицироваться in vitro в клетках насекомых, но не млекопитающих (Hanna et. al., 2005). В опытах in vivo при заражении комаров Citlex pipiens и Culex tarsalis штаммом ВЗН NY-1999 и его дегликозилированным по белку Е мутантом (NYS-> IYS) было показано, что потеря гликозилирования существенно снижает способность репликации вируса в организме переносчика и приводит к возникновению обратных реверсий (IYS->NYS) (Moudy et. al., 2009).

Для успешной циркуляции в природе флавивирусы должны эффективно заражать и реплицироваться в таких отдаленных хозяевах, как насекомые и позвоночные. ВЗН способен успешно инфицировать самые разные линии клеток животных, включая клетки млекопитающих, птиц и насекомых, что, по-видимому, обеспечивается способностью вируса связываться со многими и/или высоко консервативными клеточными рецепторами. Такая относительно широкая тропность, по-

38 видимому, вносит свой вклад и в широкий спектр клинических проявлений ЛЗН. Рецепторы, используемые ВЗН in vivo, в настоящее время активно изучаются. В экспериментах in vitro показано, что рецепторами для ВЗН служат интегрин aVJ33 (Lee et аі., 2006) и/или лектины DC-SIGN, DC-SIGN-R (Davis et al., 2006).

Вирус Западного Нила, как и другие флавивирусы, является цитолитическим и вызывает апоптоз во многих клетках, включая нейроны. В ряде исследований in vitro показано, что экспрессия отдельных вирусных белков — капсидного или NS3 также вызывает Сазр9-зависимый апоптоз (Yang et al. 2002). Установлено, что апоптозоиндуцирующий сигнал локализован в С-концевом участке капсидного белка, поэтому мутанты с заменами на С-конце капсидного белка могут обладать пониженной патогенностью.

Эпидемия ЛЗН в 1998-1999-гг. в Израиле и Северной Америке сопровождалась массовой гибелью ворон. Как уже упоминалось выше, высокая восприимчивость к вирусу Западного Нила, широкая распространенность почти на всей территории страны, а также плотность популяции этих птиц в населенных пунктах придают им большое эпидемиологическое значение как резервуара в урбанистической циркуляции ВЗН в США. Необычно высокая и не наблюдавшаяся ранее смертность среди птиц, вызванная ЛЗН, привлекла внимание исследователей. В результате был идентифицирован еще один важный фактор патогенности, находящийся в неструктурном белке NS3. Аминокислота пролин в положении 249 белка NS3 , как было показано в опытах in vivo при заражении птиц, является "переключателем" низковирулентного фенотипа вируса на высоковирулентный.

Единственная замена в этом положении S->P приводила к существенному изменению патогенных свойств вируса с увеличением титра виремии больше, чем в 10⁵ раз и повышением уровня смертности до 94% (против исходного в 31%). Напротив, в исходно

39 высокопатогенном штамме обратная замена 249 пролин на треонин приводила к снижению титра виремии с 9.41ogio до 3.6 logio Б.О.Е, а уровень смертности снизился со 100% до 12,5%. Оба штамма принадлежали к первой генетической линии и имели дополнительно 11 аминокислотных различий (Brault А.С., 2007).

Свой вклад в патогенность ВЗН вносит и генетическое разнообразие вирусной популяции. Все крупные эпидемии ЛЗН последних лет (в России, США, Румынии, Израиле), сопровождавшиеся необычно высоким для ЛЗН уровнем смертности, были вызваны исключительно представителями субкластера 1а первого генотипа ВЗН. Экспериментальные данные, полученные in vivo, также свидетельствуют о повышенной патогенности некоторых штаммов ВЗН, принадлежащих к субкластеру 1а.

Чрезвычайно удобной моделью для изучения популяционной динамики ВЗН является его распространение с 1999 года на американском континенте. Штаммы ВЗН, циркулирующие в США в период с 1999 по 2002 гг., были практически идентичны штамму NY-1999, однако в 2003 году появился новый вариант вируса с мутацией в а.к. позиции 159 белка Е (Val->Ala), быстро распространившийся по всей стране (Hayes et. al., 2005; Grinev et. al., 2008). В настоящее время этот вариант штамма NY-1999 является доминирующим на территории США. В опытах in vivo было показано, что данная аминокислотная замена приводит к эффективной репликации вируса при более высокой температуре (Moudy et. al., 2007).

Поиск и идентификация генетических детерминант флавивирусов, отвечающих за их вирулентные и адаптивные свойства, а также молекулярный механизм их действия являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью с помощью пакетов программ DNASTAR (Lasergene v.6) и MEGA v.4.1. При анализе использовались также нуклеотидные последовательности различных штаммов вируса ЗН, опубликованные в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (). Подбор праймеров для проведения реакций обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и секвенирования выполняли с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США). В работе были использованы синтетические олигонуклеотиды производства фирмы. "Литех". Структура праймерови их назначение приведены в таблице 3.

2.2. Выделение РНК

К 200 мкл суспензии исследуемого образца (мозговой суспензии мышей-сосунков или культуральной жидкости) добавляли 200 мкл лизирующего раствора (4 М гуанидин изотиоцианат, 0,5% саркозил, 100 мМ р-меркаптоэтанол, 25 мМ цитрат натрия), перемешивали на вортексе. Добавляли 200 мкл насыщенного водой фенола, 100 мкл хлороформа и 40 мкл ацетата натрия (2 М, рН=4,5), вортексировали и инкубировали 20 мин. при 4С. Центрифугировали при 13000g 20 мин. Отбирали водную фазу и* добавляли к ней равный объем изопропанола (400 мкл). Инкубировали ночь при -20С. Преципитат осаждали центрифугированием (13000g 20 мин), осадок промывали 70 % этанолом и растворяли в 20 мкл деионизированной воды.

2.3. Реакция обратной транскрипциии.

Реакцию обратной транскрипции для синтеза кДНК проводили в 0,5 мл пробирках для ПЦР, объём реакционной смеси составлял 10 мкл. В пробирку вносили 3,5 мкл РНК, денатурировали её при 72С в течение 2 мин и сразу же вносили в лед. В пробирку с денатурированной РНК добавляли 6,5 мкл смеси следующего состава (приведены конечные концентрации реагентов): 50мМ Трис-HCl, рН=8,3, 10 мМ MgCb, 50 мМ КС1, 10 мМ DTT, 0,5 мМ спермидина, по 0.5 мМ каждого дНТФ, 0,5 мМ праймера для синтеза кДНК, 16 ед. ингибитора РНКаз (Promega, США) и 12 ед. обратной транскриптазы AMV (Promega, США). Смесь инкубировали в течение 30-60 мин. при 42С. Для инактивации активностей обратной транскриптазы реакционную смесь прогревали' 15 мин. при 95С.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции.

Для получения амплифицированных фрагментов длиной до —8000 н.п. использовали смесь Taq/Pfii полимераз. Полимеразную цепную реакцию проводили в тонкостенных пробирках объемом 0,2 и 0,5 мл (QSP) на амплификаторах Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) или Терцик [ДНК-технология, Россия). В Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. В реакционную смесь входили- следующие компоненты: ПЦР-буфер (200 мМ NH4SO4, 750 мМ Трис-HCl рН=8,8), 2,5 мМ MgAc, по 0,2 мМ каждого дНТФ, по 5 пМ прямого и обратного праймера, 1 мкл раствора кДНК (тотальной, 0,01-0,1 мкг) и 2,5 ед. смеси Taq/Pfu-полимераз. ПЦР амплификацию осуществляли с использованием следующих параметров: 95 С 40 сек. - 1 цикл; 94 С 20 сек., 55-60 С 20 сек., 72 С 5-6 мин - 30-35 циклов; 72 С 5-10 мин. — 1 цикл.

2.5. Клонирование кДНК-фрагментов генома.

Лигирование фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации концевых областей генома, поводили в объеме 10-20 мкл при +16С в течение 12-24 часов. Для лигирования использовали среду следующего состава: 50 мМ Tris-HCl рН=7,5, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ, 50 нг вектора pGEM-T {Promega, США) и добавляли 0,5-1 мкг ДНК-вставки. В реакции использовали 0,5 единиц ДНК-лигазы фага Т4.

2.6. Приготовление компетентных клеток E.coli.

В 100 мл 2xYT бульона следующего состава (на 1 л): бактотриптон - 16 г (Difco, США), дрожжевой экстракт - 10 г (Difco, США), хлорид натрия — 5 г, добавляли 1 мл ночной культуры E.coli и растили до оптической плотности 0,4-0,6 о.е. при 37С. Клетки охлаждали во льду и центрифугировали при +4С в течение 5 мин. при 5 тыс. об/мин. Осадок клеток ресуспендировали в 20 мл буфера RF1 (100 мМ RbCl, 50* мМ МпСЬ, 30 мМ ацетат калия, 10 мМ СаС1₂, 15% глицерина, рН=5,8) и инкубировали во льду 30 мин. Затем клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 5 тыс об/мин, при +4С). Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл буфера RF2 (10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 75 мМ СаСЬ, 15% глицерина, рН=6,8) и инкубировали во льду 20 мин. Приготовленные таким образом клетки разделяли на аликвоты по 100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С до использования.

2.7. Трансформация плазмидной ДНК.

Непосредственно перед трансформацией клетки размораживали во льду. К суспензии компетентных клеток добавляли 0,1-0,5 мкг

43 плазмидной ДЬЖ и выдерживали на льду 20 мин. Тепловой шок проводили в водяной бане при 42С в течении 1 мин и добавляли 0,5 мл 2xYT бульона. Для фенотипического выражения плазмидных маркеров суспензию клеток инкубировали в течение 1 часа при 37С, затем высевали на твердую питательную среду, содержащую антибиотик (ампициллин). Селекцию плазмид проводили на чашках Петри, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и по 40 мкл на чашку растворов 100 мМ ИПТГ и 2 % X-gal. Плазмиды, несущие вставку кДНК, отбирали по белому цвету колоний. Колонии, содержащие рекомбинантные плазмиды со вставками большого размера (5000 н.п. и более) растили при 20-25С в течение 24-48 часов.

Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом из 2-5 мл ночной бактериальной культуры с применением набора "Wizard plus SV minipreps DNA purification system" {Promega, США) в соответствии с. рекомендациями производителя. .

2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

Электрофорез препаратов ДНК проводили в 1% агарозном геле, с использованием агарозы фирмы Pharmacia, в їх трис-ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 40 мМ трис-ацетат рН=8,0, 2 мМ ЭДТА, в течение 20-40 минут при 80-120 В. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объем буфера для нанесения, содержащего 30% глицерина, 0,25% бромфенолового синего и 0,25% ксиленцианола.

Для визуализации ДНК гель прокрашивали в течение 10-20 минут в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл в ТАЕ).. Учет результатов -проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размеры молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров - фрагментов ДНК известной молекулярной массы (lkb DNA-Ladder, Gib со).

2.9. Выделение фрагментов ДНК из агарозы.

Перед реакцией секвенирования амплифицированные фрагменты ДНК вычищали из агарозного геля. После электрофореза зону геля, содержащую нужный фрагмент, вырезали и растворяли в 1 мл раствора Nal (6,6 М Nal, 16 мМ Na₂S0₃). После растворения агарозы добавляли 10 мкл сорбента glass milk. Сорбцию ДНК проводили в течение 30 мин. при 16 С. Затем сорбированный ДНК-фрагмент промывали 80% этанолом и смывали с подсушенного осадка glass milk добавлением 25-50 мкл раствора ТЕ (Трис-ЭДТА) при 50С в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант с элюированной ДНК отбирали в отдельную пробирку и использовали в реакции секвенирования.

Для выделения фрагментов ДНК, предназначенных для лигирования и последующего клонирования, использовали набор "Wizard plus PCR purification system" (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя или аналогичный набор фирмы Qiagen.

2.10. Секвенирование ДНК

Первичную нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи прямого секвенирования ПЦР-продукта с использованием BigDye Termination Cycle Sequencing Kit согласно рекомендациям изготовителя. Электрофорез ДНК осуществлялся на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 {Applied Biosystems, США).

2.11. Сайт-специфический мутагенез ДНК.

Сайт-специфический мутагенез ДНК осуществляли с помощью нескольких различных методов. Самый простой из них заключался в

45мутировании ДНК методом фьюжн-ПЦР (fusion PCR) с использованием двух перекрывающихся праимеров, содержащих нужную замену (или инсерцию/делецию). Другой подход заключался в следующем. Нужную плазмиду использовали в качестве матрицы для длинного и точного однонаправленного ПЦР с использованием мутантного олигонуклеотида и особой смеси ферментов - Pfu-полимеразы, Pfu-dUTP-азы и Pfu- лигазы. После проведения ПЦР в амплифицированную смесь добавляли эндонуклеазу рестрикции Dpnl, способную разрезать только метилированную или полуметилированную двухцепоченую ДНК по сайту GmeATC. Таким образом, исходная плазмида, выделенная из бактерий и метилированная по данной последовательности, разрезалась, а вновь синтезированная in vitro одноцепочечная мутантная цепь сохранялась и использовалась для трансформации компетентных клеток E.coli. Последующий скрининг осуществлялся прямым секвенированием отдельных клонов мутагенезированной плазмиды. Эффективность такого метода варьировала в среднем от 50-75%.

Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция

На территории стран бывшего СССР ареал вируса ЗН охватывает Молдавию, Украину, Белоруссию, юг европейской части России (степи и лиственные леса), в Западной Сибири - Алтайский край (степи и лесостепь). Кроме того, циркуляция вируса зафиксирована в Армении, Азербайджане, Грузии, Казахстане, Таджикистане, Киргизии, Узбекистане и Туркменистане (Булычев и др., 1981; Виноград и др., 1982; Войнович и др., 1981; Гайдамович и др., 1972; Сиденко и др., 1973; Сидорова и др., 1973). Заболеваемость ЛЗН за последние 20 лет регистрировалась в Казахстане и Среднеазиатских республиках, на Украине, в Азербайджане. Очень велик риск заражения в пустынных частях Поволжского района, особенно вдоль долин крупных рек. Наиболее активные природные очаги ВЗН находятся в дельте Волги, вдоль ее низовий до впадения в Каспий.

Вопрос о механизмах изменения ареала вирусов остается одним из чрезвычайно сложных вопросов эпидемиологии из-за влияния множества причин самого различного происхождения - как природных, так и связанных с деятельностью человека. Так, например, вопрос, каким именно образом вирус Западного Нила проник на американский континент, остается открытым. Однако современная возможность быстрого получения и анализа генетической информации, наряду с развитием методов молекулярной эпидемиологии, позволяет надежно установить эпидемиологическую связь и эволюционные отношения между разными штаммами вируса. Так, анализ первичной структуры штаммов ВЗН, выделенных на территории Израиля в 1997 - 2001 гг., выявил их очень высокую идентичность штаммам, изолированным в 1999 г. в Северной Америке, в связи с чем Ближний Восток рассматривают как наиболее вероятный источник интродуцированного в США вируса (Lanciotti et. al., 1999).

Род Flavivims насчитывает в настоящее время 15 антигенных комплексов. Большинство вирусов, вызывающих энцефалиты, относятся либо к антигенному комплексу японского энцефалита, либо к антигенному комплексу клещевого энцефалита. Вирус Западного Нила относится к антигенному комплексу японского энцефалита, куда помимо ВЗН входят еще 15 вирусов. Часть флавивирусов передается комарами, некоторые клещами, а ряд вирусов, включая ВЗН, обладает способностью к траншиссивной передаче и комарами, и клещами.

Результаты филогенетических исследований и эволюционного анализа свидетельствуют о том, что вирусы, переносимые клещами, вирусы, переносимые комарами и большинство вирусов без переносчика или переносчик для которых не установлен, относятся к трем различным эволюционным линиям, которые образовались на ранних стадиях эволюции представителей рода Flavivims.(ZanotXo et al., 1996; Marin et. al., 1995; Kuno et.al., 1998) Предполагается, что все три линии произошли от общего вируса-предшественника, циркулирующего в Африке около 10 000 лет назад, причем первой (приблизительно 3000 лет назад) произошла дивергенция вирусов без переносчика, затем вирусов, переносимых клещами и, в последнюю очередь, произошла дивергенция вирусов, переносимых комарами. Было также показано, что скорость эволюции арбовирусов ниже, чем у вирусов без переносчика. Кроме того, отношение числа несинонимических замен в геноме к синонимическим у вирусов, циркуляция которых связана с членистоногими и позвоночными, выше. Это означает, что на арбовирусы оказывается более выраженное селективное воздействие.

С помощью эволюционного анализа протяженных участков геномов флавивирусов было установлено, что скорость эволюции вирусов, переносимых комарами, выше скорости эволюции вирусов, переносимых клещами почти в два раза. При этом "комариные" и "клещевые" вирусы существенно различаются топологией филогенетического дерева. Вирусы, переносимые клещами, имеют асимметричное филогенетическое дерево, для которого характерны постоянные появляющиеся в процессе эволюции ответвления, причем количество дочерних ветвей значительно больше, чем можно было бы ожидать на основе математического ожидания. Филогенетическое дерево вирусов, переносимых комарами, имеет более сбалансированную топологию с меньшим количеством дочерних ветвей, причем большая часть из них возникла в последнее время (около 200 лет назад). Отношение количества несинонимических замен к количеству синонимических у "клещевых" вирусов выше, чем у "комариных", при этом у "клещевых 7 вирусов чаще встречаются аминокислотные замены на биохимически близкие. Это указывает на то, что флавивирусы, переносимые клещами, испытывают большее селективное воздействие по сравнению с вирусами, переносимыми комарами. Таким образом, случайное появление жизнеспособных вариантов в популяции у "клещевых" вирусов является менее вероятным событием, чем у "комариных,\

Важнейшим фактором эволюции вирусов, независимо от их характеристик, является хозяин. Смена основного хозяина часто приводит к появлению новых эпидемически важных вариантов вируса, вирулентных для нового хозяина. Для успешной циркуляции в природе арбовирусы должны эффективно репродуцироваться в таких отдаленных хозяевах, как позвоночные-прокормители и членистоногие-переносчики. Сопоставление филогенетических данных с данными экологических исследований позволило установить, что главным фактором эволюции флавивнрусов на уровне вида является переносчик (Marin et. al., 1995; Kuno et. al., 1998; Gaunt et al., 2001). Из рис.3 хорошо видно деление членов всего рода Flavivirus на три основных кластера, связанных с типом переносчика. В свою очередь, кластер, объединяющий все флавивирусы, переносимые комарами, подразделяется на два субкластера, связанные либо с комарами рода Culex (среди них вирусы ЯЭ, энцефалита Сент-Луис и Западного Нила), либо с комарами рода Aedes (среди них, например, вирусы желтой лихорадки и вирус Денге), причем субкластер "Culex" сформировался уже после отделения uкомариных" вирусов от "клещевых" и вирусов без переносчика. Доминирующая роль комаров рода Aedes и Culex в циркуляции флавивнрусов объясняется их широким распространением, а также большим видовым разнообразием. Род Aedes насчитывает 975 различных видов, a Culex - 769, что в сумме превышает численность всех видов комаров, относящихся к остальным родам (1522).

Генетические факторы патогенности ВЗН

Флавивирусы относятся к нейротропным возбудителям, способным вызывать у человека лихорадки и энцефалиты разной степени тяжести. Классической моделью для изучения патогенеза вызываемых ими заболеваний являются новорожденные и взрослые мыши нескольких линий. Обычно проявление патогенности флавивирусов на мышах тесно связано с возрастными факторами, характеризующими зрелость защитных систем организма, в первую очередь ИФН. Система интерферона обеспечивает состояние невосприимчивости организма к вирусам и является важнейшей составной частью врожденного иммунитета. Активация генов системы ИФН и синтез антивирусных цитокинов приводит к усилению адаптивного и гуморального иммунитета. На специальных линиях мышей, дефектных по ИФН-зависимым генам, при многих вирусных инфекциях показана высокая значимость системы ИФН в развитии заболеваний.

Флавивирусы (ВЗН, вирус японского энцефалита, вирус Денге и др.) нарушают клеточный механизм индукции ИФН-зависимых генов, действуя на активацию сигнальных факторов транскрипции STAT (Guo et al., 2005; Ho et al., 2005). В роли антагонистов ИФН-сигналов выступают неструктурные белки флавивирусов NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 (Best et. al., 2005; Lin et. al, 2006; Liu et. al., 2006; Wilson et. al., 2008; , Эти вирусные белки, взаимодействуя с тирозиновыми киназами Jakl и Тук2, препятствуя их фосфорилнрованию. Вызываемый флавивирусами блок активности системы действия ИФН на этапе передачи сигналов к антивирусным клеточным генам обеспечивает необходимые условия для вирусной репродукции (Lin et al., 2006; Liu et al., 2006). Гуморальный иммунитет является важным компонентом в системе защиты организма хозяина от вирусной инфекции. Дефектные по производству В-лимфоцитов линии мышей погибали при инфицировании ВЗН, но выживали-при пассивной иммунизации. Главной мишенью нейтрализующих антител является оболочечный белок Е. Согласно данным рентгеноструктурного анализа» белок Е является димером, каждый мономер которого состоит из трех структурных единиц, (рис. 9). Домен I является центральным, несет основную структурную нагрузку, имеет форму Р-складчатой глобулы, содержит антигенные эпитопы и сайт гликозилирования. Домен II содержит пептид слияния высоко консервативный для флавивирусов DRGWGNGCGLFGK и является рН-лабильным: его конформация изменяется при понижении рН, после чего происходит слияние вирусной и клеточной мембран. Домен III является иммуноглобулиноподобным и содержит сайт связывания с клеточным рецептором, а также эпитопы для вируснейтрализующих антител. (Beasley et. al., 2002; McMinn, 1997).

Сайт потенциального N-гликозилирования в домене I, находящийся в а.к. 154-156 белка Е имеет важное значение для патогенных свойств вируса. У представителей ВЗН, относящихся к разным генетическим линиям, соответствующие аминокислотные позиции очень вариабельны - NYP, SYS, KYS и т.д. У ряда штаммов, относящихся ко второму и четвертому генотипу, в этом месте наблюдается деления аминокислот 154-156 (Berthet et. al., 1997; Chambers et. al., 1998). В опытах in vivo было показано, что дегликозилирование белка Е в штамме ВЗН, относящемся к первому генотипу, приводило к аттенуации нейроинвазивности, но не нейровирулентности в мышах (Beasley et. al., 2002). Однако некоторые штаммы ВЗН, также относящиеся к первому генотипу и гликозилированные по белку Е, аттенуированны к нейроинвазивности в мышах (Chambers et al., 1998; Halevy et al., 1994). Кроме того, описаны случаи энцефалита у людей и животных, вызванные южноафриканскими штаммами ВЗН, относящимися ко второму генотипу с негликозилированными вариантами белка Е. (Botha et al., 2008). Таким образом, связь между гликозилированием белка Е и нейроинвазивным фенотипом вируса не является взаимно-однозначной. По-видимому, существуют и другие генетические факторы, отвечающие за патогенные свойства вируса, в том числе нейроинвазивные и нейровирулентные.

Дегликозилирование белка Е также влияло на сборку вирусных частиц и уменьшало способность вируса реплицироваться in vitro в клетках насекомых, но не млекопитающих (Hanna et. al., 2005). В опытах in vivo при заражении комаров Citlex pipiens и Culex tarsalis штаммом ВЗН NY-1999 и его дегликозилированным по белку Е мутантом (NYS- IYS) было показано, что потеря гликозилирования существенно снижает способность репликации вируса в организме переносчика и приводит к возникновению обратных реверсий (IYS- NYS) (Moudy et. al., 2009).

Для успешной циркуляции в природе флавивирусы должны эффективно заражать и реплицироваться в таких отдаленных хозяевах, как насекомые и позвоночные. ВЗН способен успешно инфицировать самые разные линии клеток животных, включая клетки млекопитающих, птиц и насекомых, что, по-видимому, обеспечивается способностью вируса связываться со многими и/или высоко консервативными клеточными рецепторами. Такая относительно широкая тропность, по 38 видимому, вносит свой вклад и в широкий спектр клинических проявлений ЛЗН. Рецепторы, используемые ВЗН in vivo, в настоящее время активно изучаются. В экспериментах in vitro показано, что рецепторами для ВЗН служат интегрин aVJ33 (Lee et аі., 2006) и/или лектины DC-SIGN, DC-SIGN-R (Davis et al., 2006).

Вирус Западного Нила, как и другие флавивирусы, является цитолитическим и вызывает апоптоз во многих клетках, включая нейроны. В ряде исследований in vitro показано, что экспрессия отдельных вирусных белков — капсидного или NS3 также вызывает Сазр9-зависимый апоптоз (Yang et al. 2002). Установлено, что апоптозоиндуцирующий сигнал локализован в С-концевом участке капсидного белка, поэтому мутанты с заменами на С-конце капсидного белка могут обладать пониженной патогенностью. Эпидемия ЛЗН в 1998-1999-гг. в Израиле и Северной Америке сопровождалась массовой гибелью ворон. Как уже упоминалось выше, высокая восприимчивость к вирусу Западного Нила, широкая распространенность почти на всей территории страны, а также плотность популяции этих птиц в населенных пунктах придают им большое эпидемиологическое значение как резервуара в урбанистической циркуляции ВЗН в США. Необычно высокая и не наблюдавшаяся ранее смертность среди птиц, вызванная ЛЗН, привлекла внимание исследователей. В результате был идентифицирован еще один важный фактор патогенности, находящийся в неструктурном белке NS3. Аминокислота пролин в положении 249 белка NS3 , как было показано в опытах in vivo при заражении птиц, является "переключателем" низковирулентного фенотипа вируса на высоковирулентный. Единственная замена в этом положении S- P приводила к существенному изменению патогенных свойств вируса с увеличением титра виремии больше, чем в 105 раз и повышением уровня смертности до 94% (против исходного в 31%).

Определение и анализ первичной структуры геномов 19-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных на территории Астраханской области в 2001-2005гг

Проведенные ранее комплексные вирусологические, серологические и молекулярно-генетические исследования выявили сосуществование на территории Астраханской области, по крайней мере, трех различных генотипов ВЗН — 1-го, 2-го и 4-го, а также абсолютное доминирование субкластера 1а первого генотипа, близкого по своим генетическим характеристикам к эпидемическим штаммам 1999 года. Вызванные в 1996-1999 гг. этим геновариантом вируса вспышки эпидемии ЛЗН в Израиле, США и России характеризовались необычно высоким, до 10-14%, уровнем летальности, что, вероятно, было во многом обусловлено новыми измененными генетическими свойствами вирусной популяции.

Основной целью нашей работы являлась генетическая характеристика вирусной популяции ВЗН, циркулирующей в природных биоценозах дельты Волги в 2001-2005 гг. и сравнение их генетических свойств с эпидемическими штаммами 1999 года, а также астраханским штаммом Нр94, изолированным в 1963 году. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса Западного Нила, выделенных в 2001-2005 гг. в Астраханской области от птиц и переносчиков, выявил их высокую степень нуклеотидного сходства со штаммами, выделенными в 1999 г. от больных людей во время эпидемической вспышки. Полученные данные свидетельствуют о тесной связи вирусной популяции, циркулирующей среди птиц, комаров и клещей с эпидемическими штаммами. Нуклеотидная дивергенция между эпидемическими штаммами 1999 года Ast901-99 Ast986-99 и штаммами ВЗН 2001-2005 гг. составляет в среднем 0,28%. Это согласуется с наблюдениями других исследователей. Так, нуклеотидная дивергенция между изолятами ВЗН, выделенными из крови доноров в США в 2002-2005 гг. и штаммом NY-1999, варьировала в пределах 0,18 - 0,37%. Большинство нуклеотидных замен при этом ( 75%) были синонимическими, 80% из которых являлись транзициями C U и Ц- С. Число аминокислотных замен относительно штамма NY-1999 составляло от 3 до 16 (Grinev et.al., 2008). Мы также оценили нуклеотидную дивергенцию (и генетическую дистанцию) между штаммом Нр-94 1963 г. и штаммами ВЗН 2001-2005 гг. Нуклеотидная дивергенция между ними составляет в среднем 5,4%. Эти результаты также согласуются с данными других исследователей. Согласно данным Bert et.al., 2002 расхождение штаммов, выделенных в Египте в 1950-1960-е годы и современными не превышало 10%. В Израиле циркулирует две популяции ВЗН, при этом внутри каждой популяции у новых и старых штаммов, выделенных с 1952 по 2001 гг. дивергенция крайне низка (Bin et al., 2001; Banet-Noach et al., 2003). Почти полное отсутствие нуклеотидных замен в 5 -НТР, а также генах, кодирующих белки С и М, также хорошо согласуются с наблюдениями других исследователей и объясняются, по-видимому, тем, что в этой области РНК вируса содержит высоко консервативные участки, участвующие в репликации вирусного генома.

Анализ известных к настоящему моменту генетических детерминант патогенности ВЗН выявил, в частности, фенотипический полиморфизм исследуемых штаммов по участку 154-156 а.к. в белке Е, где находится важный биологический сайт поверхностного N-гликозилирования, отвечающий за нейроинвазивные свойства ВЗН in vivo. Таким образом, среди исследованных штаммов присутствуют варианты вируса, аттенуированные по нейроинвазивным свойствам. Мы также показали, что все исследованные в данной работе штаммы ВЗН, включая штаммы Ast99-901, Ast99-986 1999 года и Нр94 1963 года, содержат аминокислоту пролин в 249 положении белка NS3. Эта аминокислота расположена в геликазном домене белка NS3 и не находится вблизи участка связывания с вирусной РНК, однако является важным фактором патогенности ВЗН для птиц. Три потенциальных сайта N-гликозилирования в белке NS1, также влияющие на патогенные свойства вируса, сохранились в а.к. позициях 130, 175 и 203. Создание обратных генетических систем для вирусов дает исследователям мощный инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярно-генетических механизмах тех или иных фенотипических свойств вируса. К настоящему моменту создано множество обратных генетических систем для флавивирусов. (Hurrelbrink et.al., 1999; Lai et. al.3 1991; Mandl et. al., 1997; Campbell et. al., 2000; Shi et. al., 2002 и др.) Большая часть из них сделана на основе бактериальных плазмид, несущих кДНК копию вирусной РНК под контролем промотора бактериофага Т7. Однако известны и другие системы, созданные, например, на основе "челночных" векторов, где кДНК вируса расположена под контролем эукариотического промотора (Khromykh et. al., 1994). Самым простым, на наш взгляд, способом в настоящее время является получение инфекционной копии РНК вируса непосредственно с амплифицированных кДНК-фрагментов - одного, несущего весь геном, или двух, лигированных затем in vitro. Такой подход был использован, например, при создании обратной генетической системы для вирусов желтой лихорадки (Rice et.al., 1989), японского энцефалита (Sumiyoshi et. al., 1992), Денге (Kapoor et.al., 1995) и др. Однако системы, созданные на основе бактериальных плазмид, имеют ряд преимуществ. Главным из них является возможность быстро и эффективно вносить необходимые мутации в геном вируса, клонированный в плазмидный вектор. Кроме того, РНК, считанная с плазмидной матрицы Т7 РНК-полимеразой in vitro, содержит меньше ошибок, чем считанная с ДНК-фрагмента, полученного предварительно амплификацией in vitro с За -полимеразой. Ну и, наконец, если плазмидная конструкция стабильна, то, независимо от размера, ее можно легко и быстро наработать в препаративных количествах. Главной проблемой при этом является именно стабильность плазмидной конструкции с большой ( 10 000 н.п.) вставкой ДНК, кодирующей эукариотические аминокислотные последовательности под контролем Т7 промотора.

Клонирование полноразмерной кДНК-копии российского изолята вируса Западного Нила, относящегося к IV субтипу

Таким образом, среди исследованных штаммов присутствуют варианты вируса, аттенуированные по нейроинвазивным свойствам. Мы также показали, что все исследованные в данной работе штаммы ВЗН, включая штаммы Ast99-901, Ast99-986 1999 года и Нр94 1963 года, содержат аминокислоту пролин в 249 положении белка NS3. Эта аминокислота расположена в геликазном домене белка NS3 и не находится вблизи участка связывания с вирусной РНК, однако является важным фактором патогенности ВЗН для птиц. Три потенциальных сайта N-гликозилирования в белке NS1, также влияющие на патогенные свойства вируса, сохранились в а.к. позициях 130, 175 и 203.

Создание обратных генетических систем для вирусов дает исследователям мощный инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярно-генетических механизмах тех или иных фенотипических свойств вируса. К настоящему моменту создано множество обратных генетических систем для флавивирусов. (Hurrelbrink et.al., 1999; Lai et. al.3 1991; Mandl et. al., 1997; Campbell et. al., 2000; Shi et. al., 2002 и др.) Большая часть из них сделана на основе бактериальных плазмид, несущих кДНК копию вирусной РНК под контролем промотора бактериофага Т7. Однако известны и другие системы, созданные, например, на основе "челночных" векторов, где кДНК вируса расположена под контролем эукариотического промотора (Khromykh et. al., 1994). Самым простым, на наш взгляд, способом в настоящее время является получение инфекционной копии РНК вируса непосредственно с амплифицированных кДНК-фрагментов - одного, несущего весь геном, или двух, лигированных затем in vitro. Такой подход был использован, например, при создании обратной генетической системы для вирусов желтой лихорадки (Rice et.al., 1989), японского энцефалита (Sumiyoshi et. al., 1992), Денге (Kapoor et.al., 1995) и др. Однако системы, созданные на основе бактериальных плазмид, имеют ряд преимуществ. Главным из них является возможность быстро и эффективно вносить необходимые мутации в геном вируса, клонированный в плазмидный вектор. Кроме того, РНК, считанная с плазмидной матрицы Т7 РНК-полимеразой in vitro, содержит меньше ошибок, чем считанная с ДНК-фрагмента, полученного предварительно амплификацией in vitro с За -полимеразой. Ну и, наконец, если плазмидная конструкция стабильна, то, независимо от размера, ее можно легко и быстро наработать в препаративных количествах. Главной проблемой при этом является именно стабильность плазмидной конструкции с большой ( 10 000 н.п.) вставкой ДНК, кодирующей эукариотические аминокислотные последовательности под контролем Т7 промотора. Изначально нашей целью было создание одноплазмидной системы, однако получить плазмиду, несущую полную последовательность кДНК генома вируса целиком, нам не удалось. При этом в качестве векторов мы пробовали различные вектора на основе как высококопийных (pBluescript II, pGEM), так и низкокопийных (pBR322, pACYC) бактериальных плазмид. Поэтому было решено ограничиться двухплазмидной системой, также широко используемой для данных целей. Выбор штамма ВЗН для создания обратной генетической системы был обусловлен следующими соображениями. Существующие в настоящее время системы обратной генетики получены для генотипов 1 и 2 линии. Именно с помощью этих систем были идентифицированы генетические детерминанты, отвечающие за патогенные свойства ВЗН, в частности, сайт гликозилирования в белке Е, связанного с нейроинвазивностью в мышах. Однако четкой и взаимнооднозначной корреляции между аттенуацией нейроинвазивности ВЗН и дегликозилированием белка Е (по аспарагину в, а.к. позиции 154) нет. Некоторые штаммы ВЗН, принадлежащие к первой или второй генетической линии и дегликозилированные по этому сайту, оставались нейроинвазивными. Это свидетельствует, в частности, о том, что и другие генетические факторы ВЗН могут играть роль в аттенуации нейроинвазивности. Влияние замены в а.к. позиции 249 S- P для переключения с низковирулентного фенотипа вируса на высоковирулентный также исследовалось на инфекционных клонах штаммов ВЗН, относящихся к 1-й генетической линии. Неясно поэтому, является ли эта замена в NS3 необходимой и достаточной, или же здесь также играет свою роль наличие дополнительных, пока неизвестных генетических факторов. Штамм LEIV-Krdl90 относится к 4-й генетической линии и обладает ярко выраженными низковирулентными и низкоинвазивными свойствами (Львов и др., 2004), что, по нашему мнению, делает его удобной моделью как для изучения генетических детерминант вирулентности ВЗН, так и для создания на его основе рекомбинантных флавивирусных вакцин нового поколения. 1. В результате анализа первичной структуры генома 18 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. в Астраханской области РФ, установлена высокая идентичность их как между собой, так и со штаммами ВЗН Ast99-901 и Ast99-986, вызвавшими эпидемические вспышки в этом регионе в 1999-2000 гг. 2. В 6 из 18 штаммов, исследованных в данной работе, содержится потенциальный сайт N-гликозилирования в белке Е, отвечающий за нейроинвазивные свойства вируса. У 9 из 18 штаммов сайт потенциального глйкозилирования отсутствует, а в 3 штаммах содержится частично, так как соответствующая позиция в геноме гетерогенна. 3. Все 18 штаммов, исследованных в данной работе, в геликазном домене неструктурного белка NS3 в положении 249 содержат аминокислоту пролин, которая отвечает за высокопатогенные свойства ВЗН in vivo. 4. Плазмида, полученная в данной работе и несущая полноразмерную кДНК копию генома вируса Западного Нила, может быть использована в экспериментальной системе обратной генетики для ВЗН.

Похожие диссертации на Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России

Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государствУсачев Евгений Валерьевич

Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годахЕвсеенко Василий Александрович

Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской ФедерацииПлотников Вадим Алексеевич

Характеристика штаммов вируса кори, циркулирующих на территории Российской Федерации в период массовой вакцинопрофилактики Журавлева Юлия Николаевна

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса миксомы кроликовСиндрякова, Ирина Петровна

Молекулярно-генетическая характеристика дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных от людей с различными формами инфекционного процессаКулакова Нина Викторовна

Характеристика геномов рекомбинантных штаммов вируса гриппа типа А различной репродукционной активности Фураева Валентина Алексеевна

Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы козКукушкина Мария Сергеевна

Морфологические характеристики инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у куриных эмбрионов и мышей Виноградов Илья Викторович

Характеристика начальных этапов инфекции, вызванной вариантами одного штамма вируса клещевого энцефалита, обладающими селективным преимуществом при размножении в разных системахШевцова, Анастасия Сергеевна