Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
-
Классификация возбудителя 10
-
Молекулярно-биологическая характеристика вируса болезни Ньюкасла 12
-
Структура вириона 12
-
Геном вируса и кодируемые им белки 14
1.2.2.1. NP - нуклеокапсидный белок. 15
1.2.2. 2. Белки, кодируемые геном Р 17
1.2.2.2.а. Фосфопротеин (Р) 18
1.2.2.2.Ъ. Белки VhW 19
-
БелокМ 20
-
Белок F 22
-
Белок HN 25
-
Белок L 28
-
Протеолитическая активация белка слияния 29
-
Адсорбция и проникновение вируса в клетку 31
-
Репликация генома вируса БН 35
-
Транскрипция мРНК вируса БЫ 38
-
Сборка вирионов вируса БН 39
1.3. Молекулярно-генетические основы патогенности вируса болезни
Ньюкасла ...40
1.4. Детекция и типирование штаммов ВБН 43
Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
-
Анализируемые штаммы из базы данных GenBank 46
-
Исследуемые штаммы 50
-
Места сбора и объем полевых материалов в Приморском крае в 2004 г 51
-
Олигонуклеотиды использованные в экспериментах 52
-
Выделение РНК , 53
-
Реакция обратной транскрипции (ОТ) 54
-
Проведение полимеразной цепной реакции 54
-
Определение 5'-концевой последовательности геномной РНК 55
-
Электрофорез ДНК 57
-
Приготовления ДНК для секвестрования .57
-
Секвестрование ДНК. 58
-
Построение алайментов и филогенетический анализ 58
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 59
-
Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах 59
-
Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств 62
-
Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии 62
-
Анализ штаммов ВБН, изолированных от сельскохозяйственных птиц в Казахстане в 1988-2004 гг 67
-
Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких птиц и домашних в Приморском крае в 2004 г 70
-
Филогенетические взаимоотношения исследуемых штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов в пределах генетических групп 74
-
Анализ сайта расщепления белка F исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов 88
3.6. Анализ полного генома штамма ВБН Sterna/Astrakhan/2755/2001.90
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 99
ВЫВОДЫ 105
Благодарности 106
Список литературы 107
Введение к работе
Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) или APMV-1 (Avian Paramyxovirus J) принадлежит к семейству парамиксовирусов (Paramyxoviridae), подсемейству Paramyxovirinae, роду Avulavirus [70,71]. Семейство парамиксовирусов включает ряд вирусов, вызывающих опасные заболевания человека и животных, среди них особенно печально известны такие вирусы, как вирус кори (measles), респираторно синцитиальный вирус (RSV), вирус парагриппа (parainfluenza), вирус инфекционного паротита (mumps), вирус болезни Ньюкасла (NDV), вирус чумы рогатого скота (rinderpest).
Актуальность проблемы
Впервые вспышки болезни Ньюкасла (БН) среди домашней птицы были зарегистрированы на индонезийском острове Ява и собственно в Ньюкасле в 1926 году [103]. На сегодняшний день вирус БН широко распространен в различных регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в список наиболее важных патогенов (лист А). Несмотря на проведение повсеместной вакцинопрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается самой массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием промышленного птицеводства это заболевание приобрело пандемический характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную роль в этом процессе сыграл широкий международный обмен высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета эпизоотической ситуации в конкретных странах [109, 120].
За последние 80 лет множество эпизоотических вспышек БН нанесли удар по птицеводческой индустрии многих стран, причём некоторые из них переросли в форму панзоотии. Полагается, что первая панзоотия началась в середине 1920-х гг. и утихла только в конце 1950-х гг., когда стала распространённой вакцинация. О развитии второй панзоотии имеются две версии. Согласно одной она началась на Дальнем Востоке в начале 1960-х гг. и распространилась до Европы через Ближний Восток. Другая версия
5 предполагает, что вторая панзоотия имеет южноамериканское происхождение в результате импорта экзотических птиц (попугаев) в Европу и Северную Америку [11, 47, 69]. Инфекция почтовых голубей вариантом вируса БН (PPMV-1) в конце 1970-х гг. на Ближнем Востоке ознаменовала начало третьей панзоотии, которая к настоящему моменту охватила многие страны всего мира. В настоящий момент, несмотря на проведение вакцинации практически повсеместно, существует опасность возникновения новой панзоотии.
Лавинообразное накопление экспериментальных данных показывает огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий момент не существует общепринятой системы классификации вируса в пределах рода. Среди наиболее известных систем классификации ВБН выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По системе, предложенной авторами Lommczi et al. (1998), Alexander et al. (1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al (2001), Yu et al (2001) существует восемь основных линий (I-VIII) [69, 15, 49, 50, 57, 120]. Другая система, предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести основных линий 1-6 [9, 10].
Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного числа штаммов ВБН по всему миру и определены основные генотипы, остаётся неясным вопрос - какие генотипы ВБН представлены на территории России и сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту написания работы в базе данных GenBank были представлены частичные нуклеотидные последовательности гена F только четырёх представителей генотипов За, ЗЬ и 4а, выделенных с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3, 6]. Однако совершенно не изучено разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких птиц.
В связи с повсеместно расширяющейся программой вакцинации, начавшейся в начале 1950-х гг. и увеличивающимся числом вакцинных вариантов вируса, возникает вопрос о возможности выплеска вакцинных штаммов в популяции диких птиц и об их дальнейшей судьбе.
Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны несколько ОТ-ГШР систем. В основном, все они основаны на амплификации участка гена F или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала (в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, из-за недостатка данных по распространению генотипов ВБН на территории России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для детекции РНК вируса БН адаптированную к вариантам вируса, циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему выявления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим использованием амшгафицированных фрагментов ДНК для секвенироваыия и выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с ранее известными.
Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных государств, отсутствуют.
Цель и задачи исследования.
Целью, настоящего исследования явилась генетическая характеристика вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а также определение первичной структуры генома варианта вируса БН,
7 наиболее распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Провести определение первичной структуры гена F или его участка "культуралышх" штаммов вируса БН (всего 59), выделенных на территории России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.
Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных GenBank.
Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в 2004 г.
Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных GenBank, с помощью филогенетического анализа.
Определить первичную структуру полную генома российского штамма Stema/Astrakhan/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.
Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена F (374 и.о.) и результатов генотипирования по практически полному геному.
Научная новизна и практическая значимость.
Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса БН.
Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.
Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1, 2, а также субтипам За, 5Ь и 5d.
Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5d, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 - лентогенному характеру патогенности.
Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5b, 5d и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ъ, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств.
Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм Sterna/Astrakhan/2755/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.
Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена F (374 н.о. от начала открытой рамки считывания белка F — по классификации Aldous с соавт., 2003) и результатов генотипирования по практически полному геному показал высокую степень их корреляции (К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена F (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основных генетических линий.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. С помощью данной
9 системы обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени.
На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена F (374 н.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 5d.
Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и леитогеиного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БН, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма Stema/Astrakhan/2755/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.
5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена F и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена F (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Avidavirus и внутри основных генетических линий.
